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Detail:(In Japanese)
新規微生物と微生物によるヒ素類の除去方法

Country (In Japanese)
日本国特許庁(JP)
Gazette Type (In Japanese)
特許公報(B2)
Patent Number (In Japanese)
特許第4088690号(P4088690)
Publication number (In Japanese)
特開2005-261234(P2005-261234A)
Entry. Date (In Japanese)
平成20年3月7日(2008.03.07)
Issue Date (In Japanese)
平成20年5月21日(2008.05.21)
Date of publication of application (In Japanese)
平成17年9月29日(2005.09.29)
Title (In Japanese)
新規微生物と微生物によるヒ素類の除去方法
Int. Cl. (IPC) (In Japanese)
C12N   1/20        (2006.01)
C02F   3/34        (2006.01)
C12N  15/09        (2006.01)
C12Q   1/04        (2006.01)
C12R   1/11        (2006.01)
File Index (In Japanese)
C12N 1/20 ZNAA
C12N 1/20 D
C02F 3/34 Z
C12N 15/00 A
C12Q 1/04
C12N 1/20 ZNAA
C12R 1:11
Number of claims (In Japanese)
7
Information concerning the deposit of microorganisms (In Japanese)
FERM P-19682
Total pages (In Japanese)
13
Application Number (In Japanese)
特願2004-075390(P2004-075390)
Date of filing (In Japanese)
平成16年3月16日(2004.03.16)
Date of request for substantive examination (In Japanese)
平成16年3月17日(2004.03.17)
Name of grantee or of the holder (In Japanese)
【識別番号】504224153
【氏名又は名称】国立大学法人 宮崎大学
Inventor (In Japanese)
【氏名】林 幸男
【氏名】宮武 宗利
【氏名】田辺 公子
Agent (Agent or common representative) (In Japanese)
【識別番号】240000039、【弁護士】、【氏名又は名称】弁護士法人 衞藤法律特許事務所
Examiner (In Japanese)
【審査官】長井 啓子
Field of search (In Japanese)
Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍ２）
ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍ２）
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍ２）
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
ヒ素吸着能を有することを特徴とする新菌株バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３。
【請求項2】
請求項１の新菌株バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３を用いて、ヒ素類含有水溶液を処理することを特徴とする微生物によるヒ素類の除去方法。
【請求項3】
ヒ素類が３価のヒ素類であることを特徴とする請求項２記載の微生物によるヒ素類の除去方法。
【請求項4】
水溶液のｐＨが２～１１であることを特徴とする請求項２記載の微生物処理によるヒ素類の除去方法。
【請求項5】
水溶液のｐＨが２～８であることを特徴とする請求項２記載の微生物処理によるヒ素類の除去方法。
【請求項6】
水溶液のｐＨが６～８であることを特徴とする請求項２記載の微生物処理によるヒ素類の除去方法。
【請求項7】
処理温度が３０～５０℃であることを特徴とする請求項２記載の微生物によるヒ素類の除去方法。
Description (In Japanese)
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規微生物及び微生物によるヒ素類の除去方法、特にヒ素類含有水溶液を微生物処理してヒ素類を除去する方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
廃液中のヒ素類の除去には、例えば鉄（３）を塗布したアルギニンゲル（非特許文献１）や鉄粒子（非特許文献２）で吸着する方法、活性化された赤泥（非特許文献３）やフライアッシュ（非特許文献４）に吸着させる方法、化学的沈殿方法（非特許文献５）、モリブデン含浸キトサンビーズによる吸着（非特許文献６）、炭素ベース吸着剤による方法（非特許文献７）などが一般的に知られている。さらに生物的な吸着方法として、化学的に修飾されたバイオマス菌を用いて除去する方法も、実験室的にではあるが知られている（特許文献８）。尚、鉄（３）及びＦｅ（３）は、３価の鉄（Ｆｅ）を示し、Ａｓ（３）は、３価のヒ素（Ａｓ）を示し、Ａｓ（５）及びArsenic(５)は、５価のヒ素（Ａｓ）を示す。

【非特許文献1】Min JH et al:Arsenate sorption by Fe(3)-doped alginate gels.Water Res 32 [1544] 52 (1998)
【非特許文献2】Matis KA et al:Sorption of As(5) by goethite particles and study of their flocculation.Water Air Soil Pollut 111 [297] 316(1999)
【非特許文献3】Bildik M. et al:Arsenic removal from aqueous solutions by adsorption on red mud.Waste Manage 22 [357] 63 (2002)
【非特許文献4】Diamantopoulos E et al:As(5) removal from aqueous solution by fly ash.Water Res 27(12) [1773] 7 (1993)
【非特許文献5】Harper TR et al:Removale of Arsenic from wastewaters using chemical precipitation methods. Water Environ Res 64 [200] 3 (1992)
【非特許文献6】Dambies l et al:Arsenic(5) sorption on molybdate-impregnated chitosan beads.Colloids Surf A 170 [19] 31 (2000)
【非特許文献7】Pattanayak J et al:A parametric evaluation of the removal of As(5) and As(3) by carbon-based adsorbents.Carbon 38 [589] 96 (2000)
【非特許文献8】Maria X et al:Removal of As(5) from wastewaters by chemically modified fungal biomass.Water Res 37 [4544] 52 (2003)
【0003】
一方、生物的吸着による重金属の除去に関しては、固定化Ｍ．ｒｏｕｘｉｉバイオマスによる生物吸着カラムでの除去（非特許文献９）や、アスペルギルス・ニガーを用いた方法（非特許文献１０）等が知られている。

【非特許文献9】Yan G et al.Heavy metal removal in a biosorption column by immobilized M. rouxii biomass. Bioresource Technology 78 [243] 249 (2001)
【非特許文献10】Kapoor A et al.Removal of heavy metals using the fungus Aspergillus niger.Bioresource Technology 70 [95] 104 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
重金属の生物吸着は、非特許文献９及び１０を待つまでもなく広く知られているが、ヒ素類含有廃水からのヒ素類の除去に微生物を用いた例はほとんどない。マリア等の非特許文献８は数少ない例のひとつである。しかしながら、マリア等のヒ素類の吸着方法で実際に使用している菌は、ペニシリウム・クリソゲナムバイオマスである。また除去するヒ素類は、Ａｓ（５）である。しかも、この菌バイオマス自体ではＡｓ（５）の回収率は低く、菌バイオマスを通常の界面活性剤及び陽イオン電解液で前処理し、化学的に修飾したものでないと、所期の目的を達成しない。前処理は比較的簡単とされているが、工業的な実施に際してはコスト的にも大きな障害となる。これまでのところ、ヒ素類の除去に微生物を用いた例、特にＡｓ（３）の微生物吸着による除去技術は知られていない。
【0005】
本発明は、前記のごとき課題を解決するヒ素類吸着能を有する新規微生物を提供することを目的としている。
【0006】
また本発明は、培養で大量に増やすことのでき、生分解性の微生物を用い、ヒ素またはヒ素化合物含有水溶液からヒ素類を回収する操作が簡単なヒ素類の除去方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記課題を解決した本発明の第１の発明である新規微生物は、土壌から単離されたヒ素吸着能を有する新菌株バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＵＭ－１２３、２００４年２月１２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託、寄託番号［ＦＥＲＭ Ｐ－１９６８２］）を特徴としている。
【0008】
本発明の第２の発明である微生物によるヒ素類の除去方法は、新菌株バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３を用いて、ヒ素類含有水溶液を処理することを特徴としている。
【0009】
第２の本発明は、特にＡｓ（３）のヒ素類の除去において効果的である。この場合、被処理水溶液のｐＨは２～１１、望ましくは２～８、さらに望ましくは６～８の範囲が除去率の観点から好適である。また処理温度は、約３０～５０℃の範囲が除去率の観点から望ましい。
【0013】
以下、本発明でヒ素類とは、三価または五価のヒ素、Ａｓ（３）Ａｓ（５）またはそれらを含むヒ素化合物をいう。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、以下の産業上の効果及び利点がある。
【0015】
（１）本発明の第１及び第２の発明によれば、バシルス属に属する新規菌株バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３を用いることにより、これまで前例のないＡｓ（３）をマイルドな条件下で、ヒ素類含有水溶液からヒ素類を約８５％の高い回収率でもって除去できる。
【0016】
（２）本発明の第３の発明によれば、微生物の中でもバシルス属及びエセリシア属に属する細菌、アスペルギルス属に属する糸状菌、サッカロマイセス属に属する酵母の使用により、ヒ素類含有水溶液からヒ素類を除去できる。
【0017】
前記各本発明では、生分解性あるいは自己消化性の微生物によりヒ素類を吸着することにより、化学的吸着等にくらべると、ヒ素除去後の廃棄物の環境負荷が少ない利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【0018】
本発明の第１の発明である新規菌株バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３は、土壌を滅菌水に懸濁後、その上清を例えばヒ素含有寒天平板培地に塗布して培養し、菌株を単離することにより得ることができる。培養に使用する培地に特に制限はないが、ヒ素含有培地の使用は、ヒ素類に耐性のある菌の選択を考慮したためである。
【0019】
得られた新規菌株バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３の菌学的性質及び同種公知菌との相違は、後述の実施例１及び実施例１に基づく表１に示すとおりである。
【0020】
【表1】
JP0004088690B2_000002t.gif

【0021】
本発明の第２、第３の発明で吸着除去可能なヒ素類としては、ヒ素の単体、三価Ａｓ（３）及び五価Ａｓ（５）並びにそれらのヒ素化合物など特に制限はない。しかし、新菌株バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３を用いる第２の発明では、図１から明らかなように、三価のヒ素化合物、三酸化二ヒ素（Ａｓ２Ｏ３）の除去率は、五価のヒ素化合物、ヒ酸二ナトリウム七水和物（Ｎａ２ＨＡｓＯ４・７Ｈ２Ｏ）のそれに比べていちじるしく高い。したがって、第２の発明は、Ａｓ（３）において特に有効である。
【0022】
本発明の第３の発明において使用する細菌としては、バシルス属及びエセリシア属に属するヒ素類吸着能を有するバシルス・メガテリウム及びバシルス・サブティリスをあげることができる。特に、後述する新規菌株バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３の使用は、高いＡｓ（３）の除去率を示す。またエセリシア属に属するヒ素類吸着能を有するエセリシア・コリも有用である。糸状菌としてはアスペルギルス・ニガー、酵母としてはサッカロマイセス・セレヴィシエを挙げることができる。バシルス・サブティリス（ＩＦＯ０３３３５）とエセリシア・コリ（ＩＦＯ３３０１）、アスペルギルス・ニガー（ＩＦＯ４４１４）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（ＩＦＯ２０４４）は、いずれも（財）発酵研究所から購入可能な公知菌である。
【0023】
本発明に用いる微生物類の培養には、例えば培地には、肉エキス、ペプトン、塩化ナトリウム、燐酸－水素カリウム等を用い、ｐＨ７程度に調整する。オートクレーブで滅菌した培地に菌を接種し、３０℃で２４時間、１１０ストローク／分で振盪培養する。培養後、培養液から遠心分離機により菌体を分離し、生理食塩水により洗浄後、凍結乾燥して菌体を得る。
【0024】
本発明のヒ素類の除去は、一般的に被処理水溶液のｐＨ調整、温度、圧力、菌体類添加量、混合撹拌時間等に依存する。
【0025】
ｐＨは使用する菌体の種により異なるので特定できないが、本発明の第２の発明では、図１が示すように、Ａｓ（３）の除去率の観点から、ｐＨ２～１１、好ましくは８以下、さらに好ましくは６～８の中性近傍が好適である。温度は、図２に示すように、３０～５０℃、特に３０～４５℃の範囲はが好適である。
【0026】
菌体類の添加量は、ヒ素類の濃度、菌体の種類により異なるが、例えばヒ素類濃度が１ｍｇ／Ｌであれば、菌体量は０．２～２．０ｗ／ｖ程度でよい。
【0027】
撹拌時間は、２時間程度で十分である。２時間以上長時間に亘っても、除去率に大きな変化はない。処理後は、遠心分離機等により菌体と上清を分けて菌体を除けば、ヒ素を除去した清浄な水が得られる。
【実施例1】
【0028】
（本発明の第１の発明による新菌株の取得と同定）
［新菌株の取得］
宮崎県内の畑の土壌を滅菌水に懸濁後、その上清を平板培地に塗布し３０℃で培養した。平板培地には、商品名「Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ」（日水製薬株式会社製）に三酸化二ヒ素［Ａｓ２Ｏ３：Ａｓ（３）］を１ｍｇ／Ｌになるように加えたものを用いた。主な成分は、肉エキス０．５％、ペプトン１．0％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％で、ｐＨは７である。平板培地上のコロニーを分画操作より単一にした。得られた菌株を培地に接種した。培地には、商品名「Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ」（日水製薬株式会社製）に三酸化二ヒ素［Ａｓ２Ｏ３：Ａｓ（３）］を１ｍｇ／Ｌになるように加えたものを用いた。主な成分は、肉エキス０．５％、ペプトン１．５％、塩化ナトリウム０．５％、燐酸－水素カリウム０．５％で、ｐＨは７である。接種後、３０℃で２４時間、１１０ストローク／分の振盪培養を行った。次いで、遠心分離機により、培養液から菌体を分離し、その上清のヒ素濃度を測定した。ヒ素濃度の測定は、宮崎大学フロンティア科学実験総合センター実験支援部門機器分析分野木花分室のヒ素形態別分析システム（ヒ素形態別前処理装置－原子吸光分光光度計）によった。培養上清のヒ素濃度の低下が著しかったものを新規菌株とした。
【0029】
［新菌株の同定１：微生物第１段階試験］
新菌株ＵＭ－１２３（登録番号ＳＩＩＤ２５８８）につき、（株）エヌシーアイエムビー・ジャパンで、形態学的・生理生化学的試験の結果からＳＩＩＤ２５８８と類似の性状を示す分類群を推定するため、下記の試験を実施した。
【0030】
光学顕微鏡Ｕ－ＬＨ１０００（オリンパス、日本）による細胞形態、グラム染色性、胞子の有無、鞭毛による運動性の有無の観察を行った。Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ，イングランド、英国）平板培地上でのコロニー形態を観察した。カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／醗酵（Ｏ／Ｆ）について試験した。結果を表１に示す。
【0031】
表１から明らかなように、ＳＩＩＤ２５８８は、グラム染色陽性、桿菌、芽胞形成、好気条件下での生育性、カタラーゼ反応要請などの性状を示し、BARROW, G.I. et al:Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd. Ed. 1993, Cambridge University Press、及びSNEATH, P. H. A. et al:Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. 2 1984, Williams and Wilkins, Baltimoreを参考にして、バシルス属に属する菌株と推定した。
［新菌株の同定２：１６Ｓ ｒＤＮＡ－５００塩基配列解析］
【0032】
次に、登録番号ＳＩＩＤ２５８８につき、（株）エヌシーアイエムビー・ジャパンで、１６Ｓ ｒＤＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）の部分塩基配列５００ｂｐを用いて検体の帰属分類群を推定するため、塩基配列解析を行った。
【0033】
ＳＩＩＤ２５８８をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ＵＫ）に植菌し、３０℃で２日間培養した。その後、この菌体をＤＮＡ抽出の供試菌体とした。
【0034】
ゲノムＤＮＡの抽出には、ＰｒｅｐＭａｎ Ｍｅｔｈｏｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより１６Ｓ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）のうち５′末端側約５００ｂｐの領域を増幅した。その後、増幅された塩基配列をシーケンシングし、検体の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列を得た。ＰＣＲ産物の精製、サイクルシーケンスには、ＭｉｃｒｏＳｅｑ５００ １６Ｓ ｒＤＮＡ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用した。サーマルサイクラーには、ＧｅｅｎＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ＤＮＡシーケンサーには、ＡＢＩＰＲＩＳＭ ３１００ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用した。なお、ゲノムＤＮＡ抽出からサイクルシークエンスまえの基本操作は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプロトコール（Ｐ／Ｎ４３０８１３２ Ｒｅｖ．Ａに従った。
【0035】
解析では、得られた１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を用いて相同性検索を行い、相同率の上位１０株を決定した。さらに検索された上位１０株と検体の１６Ｓ ｒＤＮＡを用いて近隣結合法（SAITOU, N. et al: The neighbor-joining method:anew method for reconstructing phylogenetic trees.Molecular Biology and Evolution 4 406-425 (1987)）により分子系統樹を作製、検体の近縁種及び帰属分類群の検討を行った。相同性検索及び系統樹の作製には、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ．１．４．１を、相同性検索を行う際のデータベースとしてＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ５００ Ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用した。また、ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ５００ Ｌｉｂｒａｒｙに対する相同性検索において、相同率１００％で一致する菌株が検索されなかった場合は、ＢＬＡＳＴには、ALTDCHUL, S. F. et al:Gapped BLAST:a new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res. 25 3389-3402 (1997)及びSKERMAN V. B. D. et al:Approved lists of Bacterial Names. INt. J. Syst. Bacteriol., 30 225-420 (1980)を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して相同性検索を行った。
【0036】
Ｍｉｃｒｏｓｅｑによる検体［ＵＭ－１２３］（ＳＩＩＤ２５８８）株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析結果は、次の配列表のフリーテキストに示す。
【0037】
（配列表のフリーテキスト）
JP0004088690B2_000003t.gif
【0038】
本検体と近縁とされる菌株とその相違性
Ｌｉｂｒａｒｙ：５００ ００２３ ０．９ １２８６／１２８６
ＢＬＡＳＴ：５３６ＳＩＩＤ２５８８
０．３７％ ５３６ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
３．５４％ ５３６ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ
１０．２６％５３６ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｈｎｉｉ
１０．７５％５３０ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ
１１．５７％５３６ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ
１２．０３％５３２ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
１２．１５％５３５ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ
１２．１７％５３４ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ
１２．７３％５３４ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ
１２．８７％５３７ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ
【0039】
本検体と近縁上位株との相違点
４
７
７
ＳＩＩＤ２５８８ Ｙ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｔ
【0040】
本検体と近縁株との近隣結合法による系統樹は、図３に示す。
【0041】
ＢＬＡＳＴ Ｒｅｓｕｌｔ ＤＮＡ塩基配列データベースに対して行った相同性検索の結果：検索された上位２０エントリーの内エントリー上位５位塩基配列とＳＩＩＤ２５８８塩基配列とのアイデンティティの比較を表２に示す。
【0042】
【表2】
JP0004088690B2_000004t.gif

【0043】
さらにＳＩＩＤ２５８８ ｒＤＮＡとエントリー最上位のＤＮＡとの塩基配列の配列比較を実施した。結果は図４に示す。
【0044】
これらの結果、ＭｉｃｒｏＳＥｑを用いた解析では、ＳＩＩＤ２５８８の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列は、相同率９９．６３％でＢａｃｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（STACKEBRANDT, E. et al:Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology.Int. J. Syst. Evol. Microbiol., [52] 1043-1047 (2002)）の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し高い相同率を示し、２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ間の相違点はＩＵＢコード（Ｙ＝ＣまたはＴ）で１塩基のみであった。分子系統樹上でもＳＩＩＤ２５８８の１６Ｓ ｒＤＮＡは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの１６Ｓ ｒＤＮＡと同じ場所に位置した。ＢＬＡＳＴを用いたＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索の結果、ＳＩＩＤ２５８８の１６Ｓ ｒＤＮＡは、相同率９９．４％でＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＱＭＢ１５５１株の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示した。上記の結果から、ＳＩＩＤＤ２５８８は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに帰属する新規な菌株と推定、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＵＭ－１２３と命名した。
【実施例2】
【0045】
（第２の発明によるヒ素類の除去）
土壌から得られたバシルス・メガテリウムＵＭ－１２３を培地に接種した。培地には、商品名「Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ」（日水製薬株式会社製）を用いた。主な成分は、肉エキス０．５％、ペプトン１．５％、塩化ナトリウム０．５％、燐酸－水素カリウム０．５％で、ｐＨは７である。接種後、３０℃で２４時間、１１０ストローク／分の振盪培養を行った。次いで、遠心分離機により、培養液から菌体を分離し、生理食塩水で洗浄後、凍結乾燥して菌体を得た。
【0046】
ｐＨを下記のごとく調整した緩衝液（Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ， Ｃａｒｍｏｄｙ）に、三酸化二ヒ素［Ａｓ２Ｏ３：Ａｓ（３）］とヒ酸二ナトリウム七水和物［Ｎａ２ＨＡｓＯ４・７Ｈ２Ｏ：Ａｓ（５）］を１ｍｇ／Ｌになるように加えた。このヒ素水溶液に下記の量の菌体、バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３を添加し、下記の時間撹拌した後静置し、各上清を採取した。
ｐＨ調整；ｐＨ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
（菌体添加量２．０ｗ／ｖ、撹拌時間２時間）
菌体添加量；０．２、０．５、１．０、１．５、２．０％（ｗ／ｖ）
（ｐＨ７、撹拌時間４時間）
撹拌時間；２、４、６時間
（ｐＨ７、菌体添加量２．０％（ｗ／ｖ））
【0047】
各上清のヒ素濃度を測定した。ただし、各試験にあってはヒ素初濃度；Ａｓ（３）１ｍｇ／Ｌとした。ｐＨ依存性試験にあっては菌体添加量；２．０％（ｗ／ｖ）、撹拌時間；２時間、菌体添加量依存性試験にあってはｐＨ；７、撹拌時間；4時間、撹拌時間依存性試験にあってはｐＨ；7、菌体添加量；２．０％（ｗ／ｖ）とした。ヒ素濃度の測定は、宮崎大学フロンティア科学実験総合センター実験支援部門機器分析分野木花分室のヒ素形態別分析システム（ヒ素形態別前処理装置－原子吸光分光光度計）によった。ｐＨ依存性の結果を表３及び図１に、菌体添加量依存性の結果を表４に、撹拌時間依存性を表５に示す。
【0048】
【表3】
JP0004088690B2_000005t.gif

【0049】
【表4】
JP0004088690B2_000006t.gif

【0050】
【表5】
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【0051】
表３及び図１から明らかなように、ｐＨ依存性については、Ａｓ（３）はｐＨ７付近で８４．５％の高い除去率を示したが、Ａｓ（５）ではｐＨ依存性がなく５％以下の除去率しか示さなかった。このことから、バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３による微生物処理では、これまでに例のないＡｓ（３）に関して、ｐＨ８以下、望ましくはｐＨ６～８の範囲で、きわめて高い選択的吸着が起こることが判明した。
【0052】
表４から明らかなように、菌体添加量が多いほど除去率が高いことが判明した。また表５から明らかなように、撹拌時間は、２時間以上であれば変化が認められない。
【実施例3】
【0053】
（第３の発明によるヒ素類の除去）
ｐＨ７調整した緩衝液（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ， Ｃａｒｍｏｄｙ）に、三酸化二ヒ素［Ａｓ２Ｏ３：Ａｓ（３）］を１ｍｇ／Ｌになるように加えた。このヒ素水溶液に下記の菌体を２．０％（ｖ／ｗ）添加し、４時間撹拌した後静置し、各上清を採取した。
・バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３(Bacillus megaterium UM-123)
・バシルス・サブティリス(Bacillus subtilis)
・エセリシア・コリ(Escherichia coli)
・アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）
・サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）
【0054】
各検体の上清につき、実施例１と同じ方法でＡｓ（３）の除去率をみた。結果を表６に示す。
【0055】
【表6】
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【0056】
表６から明らかなように、バシルス属及びエセリシア属のヒ素吸着可能菌の使用により、Ａｓ（３）を５０％以上の有効率で除去し得ることが分かった。また除去率はそれほど高くはないが、糸状菌及び酵母でもヒ素類の除去が可能なことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【0057】
本発明のヒ素類吸着能を有する新規菌株バシルス・メガテリウムＵＭ－１２３とそれを用いたヒ素類除去方法、またはバシルス属に属するヒ素類吸着能を有する細菌、エセリシア属に属するヒ素類吸着能を有する細菌を用いたヒ素類の除去方法は、いずれも土壌のヒ素汚染による地下水からのヒ素類の除去に有効に利用できる。さらに、アスペルギルス属に属する糸状菌、サッカロマイセス属に属する酵母も、同様にヒ素類の除去に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】本発明の第２発明におけるヒ素除去方法でのｐＨ依存性を示すグラフである。
【図2】本発明の第２発明におけるヒ素除去方法での温度依存性を示すグラフである。
【図3】本発明の第１発明における新菌株同定での本検体と近縁株との近隣結合法による系統樹図である。
【図4】本発明の第１発明における新菌株同定でのＳＩＩＤ２５８８ ｒＤＮＡとエントリー最上位のＤＮＡとの塩基配列の配列比較図である。
Drawings
【図1】
0 		【図2】
1
【図3】
2 		【図4】
3