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明細書 :紅藻のシアニジウム属を培養する培地

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第4180059号 (P4180059)
公開番号 特開2006-230266 (P2006-230266A)
登録日 平成20年9月5日(2008.9.5)
発行日 平成20年11月12日(2008.11.12)
公開日 平成18年9月7日(2006.9.7)
発明の名称または考案の名称 紅藻のシアニジウム属を培養する培地
国際特許分類 C12N   1/12        (2006.01)
FI C12N 1/12 B
請求項の数または発明の数 7
全頁数 8
出願番号 特願2005-048531 (P2005-048531)
出願日 平成17年2月24日(2005.2.24)
審査請求日 平成17年9月5日(2005.9.5)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】300071579
【氏名又は名称】学校法人立教学院
発明者または考案者 【氏名】黒岩 常祥
【氏名】八木沢 芙美
【氏名】岡野 幸雄
【氏名】黒岩 晴子
【氏名】三角 修巳
個別代理人の代理人 【識別番号】100076163、【弁理士】、【氏名又は名称】嶋 宣之
審査官 【審査官】長井 啓子
参考文献・文献 国際公開第2004/081176(WO,A1)
調査した分野 C12N 1/12
BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN)
JSTPlus(JDreamII)
JMEDPlus(JDreamII)
JST7580(JDreamII)
特許請求の範囲 【請求項1】
基礎培養体およびクエン酸を含み、紅藻のシアニジウム属が増殖可能な強酸性である紅藻のシアニジウム属を培養する培地。
【請求項2】
クエン酸濃度が、0.1重量%以上5.0重量%未満である請求項1に記載の紅藻のシアニジウム属を培養する培地。
【請求項3】
基礎培養体とクエン酸に、ゲル状を維持するための支持体を加えた請求項1または2に記載の紅藻のシアニジウム属を培養する培地。
【請求項4】
上記支持体が、ゲランガムである請求項3に記載の紅藻のシアニジウム属を培養する培地。
【請求項5】
基礎培養体、クエン酸、支持体溶液を、それぞれ別々に加熱加圧滅菌処理をし、所定温度に下がった後に混合し、冷やし固めてプレート状にした請求項3または4に記載の紅藻のシアニジウム属を培養する培地。
【請求項6】
基礎培養体がアレン培地水溶液であり、2倍~20倍濃度のアレン培地成分を含んだ請求項1~5に記載の紅藻のシアニジウム属を培養する培地。
【請求項7】
基礎培養体のpHが1以上3以下であり、支持体であるゲランガム濃度が0.1重量%以上0.7重量%以下である請求項4に記載の紅藻のシアニジウム属を培養する培地。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
この発明は、シアニディオシゾン・メローラエ(Cyanidioschyzon merolae)などの、紅藻のシアニジウム属を培養するための培地に関する。
【背景技術】
【0002】
紅藻のシアニジウム属には、シアニディオシゾン・メローラエ(Cyanidioschyzon merolae)、シアニジウム・カルダリウム(Cyanidium caldarium)、ガルデリア・スルフラリア(Galdieria sulphraria)が含まれる。紅藻のシアニジウム属は、温泉に生息する単細胞の藻の一種である。これらは、1つの細胞に核とミトコンドリアなど真核生物としてのオルガネラを最小セットで含む単純な構造であり、約20億年前に出現した始原真核生物に最も近い生物である。なお、上記シアニディオシゾン・メローラエ(Cyanidioschyzon merolae)を、以降、シゾンという。
これら紅藻のシアニジウム属は、現在地球上に存在する全ての生物の基本になる物質を含んでいるとともに、構造が単純であるため、生物学的な実験がやりやすいという特徴を持っている。
【0003】
特にシゾンは、細胞壁を持っていないため、細胞内物質を取り出しやすいという特徴が有るとともに、本願の発明者らによってゲノム解読も完了しているので、その情報を生化学の研究に利用することができる。つまり、シゾンは、生命の基本原理の謎に迫るための実験材料として最適な素材である。
【0004】
一方、上記したシゾン以外のシアニジウム属も、シゾンと同様に、単純な構造であるとともに、極限環境で棲息し、中にはシゾンよりも、さらに高温環境に強い生物も存在する。従って、生化学の研究材料としてだけでなく、高温で棲息する生命体の特徴を利用する研究に用いることもできる。
つまり、上記紅藻のシアニジウム属は、様々な実験材料として注目されている。
なお、上記紅藻のシアニジウム属は、pH1.5、温度45℃という極限環境に棲息するので、培養するためには強酸性の環境が必要で、通常、培地として、2倍濃度のアレン培地を用いている。このアレン培地とは、酸性の液体培地であり、その組成は、図6の表4に示すとおりである。なお、上記表4中のP4metalの組成を、図7の表5に示している。そして、上記2倍濃度のアレン培地とは、上記図6に示す成分を2倍濃度で含む培地のことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
このように、様々な研究における実験材料として有用な紅藻のシアニジウム属を得るために、上記アレン培地を用いた培養を行っていたが、増殖に時間がかかり、必要な実験材料を集めることは大変であった。
【0006】
この発明の課題は、生命体などの研究における実験材料として有用な紅藻のシアニジウム属の増殖率を高めて、必要な紅藻のシアニジウム属を効率良く採取することができる培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
第1の発明は、基礎培養体およびクエン酸を含み、紅藻のシアニジウム属が増殖可能な強酸性である点に特徴を有する。
第2の発明は、第1の発明を前提とし、クエン酸濃度が、0.1重量%以上5.0重量%未満である点に特徴を有する。
第3の発明は、上記第1、第2の発明を前提とし、基礎培養体とクエン酸に、ゲル状を維持するための支持体を加えた点に特徴を有する。
【0008】
第4の発明は、上記第3の発明を前提とし、上記支持体が、ゲランガムである点に特徴を有する。
第5の発明は、上記第3、第4の発明を前提とし、基礎培養体、クエン酸、支持体溶液を、それぞれ別々に加熱加圧滅菌処理をし、所定温度に下がった後に混合し、この混合液を冷やし固めてプレート状にした点に特徴を有する。
【0009】
第6の発明は、上記第1~第5の発明を前提とし、基礎培養体がアレン培地水溶液であり、2倍~20倍濃度のアレン培地成分を含んだ点に特徴を有する。
なお、上記アレン培地成分とは、アレン培地に含まれる成分であり、2倍~20倍濃度とは、通常、アレン培地といわれている培地(図6参照)を基準にして上記アレン培地成分濃度を高めたものである。
第7の発明は、上記第4の発明を前提とし、基礎培養体のpHが1以上3以下であり、支持体であるゲランガム濃度が0.1重量%以上0.7重量%以下である点に特徴を有する。
【発明の効果】
【0010】
第1~第7の発明によれば、シゾンなど、紅藻のシアニジウム属を、従来の培地を用いた場合と比べて、早く増殖させることができるようになる。
また、第3~第5の発明によれば、プレート培地が得られるので、液体培養ではできない、生育した藻類のコロニーを個別に分離して採取することが可能になる。
特に、第5の発明によれば、高温の強酸性下では変質してしまい、ゲル化できないような支持体溶液を利用してプレート培地を形成することができる。
【0011】
第6の発明では、基礎培養体としてアレン培地を用いることによって、紅藻のシアニジウム属が増殖可能な強酸性を実現することができるとともに、増殖率が高く、効率の良い培養が可能になる。特に、培地に、2倍~20倍濃度のアレン培地と同等の成分を含めば、増殖率をさらに高めることができる。
第7の発明によれば、紅藻のシアニジウム属にとって最適な棲息環境を用意することができるので、より増殖率を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
この発明の培地は、基礎培養体とクエン酸とを含んだ、強酸性の培地である。なお、ここで述べる強酸性とはpHが3.0以下の環境を指し、紅藻のシアニジウム属が棲息可能なpHである。
以下に、この発明の培地の一実施例として、紅藻のシアニジウム属を培養するためのプレート培地について説明する。
この発明のプレート培地の、大まかな作製手順を図1に示す。
【0013】
つまり、この発明のプレート培地を作製するためには、基礎培養体(液体)と、支持体溶液と、クエン酸溶液とを、それぞれ作製し、これらを別々に加熱加圧滅菌処理する。そして、加熱加圧滅菌処理を行った各溶液を放置して冷ましてから混合し、その混合液をシャーレなどの型に流し込んでさらに冷やし固める。
なお、培地作成の作業は全てクリーンベンチを用いた無菌作業である。
【0014】
上記基礎培養体は、図2の表1に示すように、(NH42SO4(硫酸アンモニウム)と、KH2PO4(リン酸水素二カリウム)と、MgSO4(硫酸マグネシウム)と、CaCl2/2H2O(塩化カルシウム)と、P4metalとからなる。
上記成分のうち、P4metal以外、すなわち、(NH42SO4(硫酸アンモニウム)と、KH2PO4(リン酸水素二カリウム)と、MgSO4(硫酸マグネシウム)と、CaCl2/2H2O(塩化カルシウム)とを、それぞれ5.24(g)、1.08(g)、1.00(g)、0.28(g)を1(l)の水に溶解し、それにHSO4(硫酸)を添加して溶液のpHを1.5に調整する。この溶液を121℃で20分間の加熱加圧滅菌処理する。
【0015】
また、図7の表5に示すP4metal成分を1(l)の水に溶解し、P4metal溶液を作成し、これを、120℃で20分間加熱加圧滅菌処理をし、16(ml)を、上記(NH42SO4を含み加熱処理を行った溶液に混合すると、基礎培養体が完成する。この基礎培養体は、4倍濃度のアレン培養液に相当する。
なお、上記支持体溶液は、ゲランガム溶液であり、水1(l)にゲランガム10(g)を溶解して作成する。
【0016】
また、上記とは別に20(%)のクエン酸溶液を作成する。
そして、上記ゲランガム溶液とクエン酸溶液を、それぞれ別々に、121℃で20分間の加熱加圧滅菌処理を行う。その後、各溶液を放置してあら熱を取り、それぞれが50℃くらいになったら、上記基礎培養体と、ゲランガム溶液とを1:1で混合する。
【0017】
さらに、上記混合液1(l)に対して、上記クエン酸溶液を100(ml)混合し、培地用溶液を作成する。次に、この培地用溶液を20(ml)、シャーレに流し込む。シャーレを放置し、冷やし固めたものが、この発明の紅藻のシアニジウム属を培養するプレート培地である。この段階で、上記プレート培地は、2倍濃度のアレン培地溶液と同等の成分を含んでいる。
なお、上記培地用溶液を作成する過程で、基礎培養体と、支持体溶液と、クエン酸溶液とを別々に加熱加圧滅菌した後、あら熱を取ってから混合したのは、支持体溶液に含まれるゲランガムが、酸に弱いためである。もしも、ゲランガム溶液と基礎培養体とを混合してから、加熱加圧滅菌処理を行うと、その後、温度を下げてもゲル状にならず、プレート培地を作成することができないことを確認している。このことは、加熱加圧滅菌処理時のような高温で、かつ、強酸性の環境におかれると、ゲランガムの構造が破壊されてしまうためと予想される。
【0018】
また、実際に、紅藻のシアニジウム属を培養する際には、シャーレ内の上記プレート培地上に紅藻のシアニジウム属の細胞を含んだ培溶液を滴下し、インキュベータ内で、42℃~45℃、湿度約70%、光量5000(lx)を維持する。インキュベータ内で、上記シャーレには蓋を被せるとともに、その周囲をテープで密閉し、乾燥を防ぐようにする。
【0019】
上記実施例のプレート培地には、培地全体に対してクエン酸が約1.0(%)含まれている。このように培地にクエン酸を含ませたのは、紅藻のシアニジウム属の増殖を早めるためであるが、クエン酸によって紅藻のシアニジウム属の成長速度が高まることを実験1によって確認した。
【0020】
(実験1)
上記したこの発明のプレート培地と同様にして、クエン酸濃度を0.05(%)、0.1(%)、1.0(%)、2.0(%)、5.0(%)にした培地と、クエン酸を含まない培地(コントロール)とを作成し、各培地で、紅藻のシアニジウム属としてシゾンを培養した。この際、各培地に植えつけるシゾンの細胞密度は、2.7×106(匹/ml)とした。
なお、培地に植えつける細胞密度が1.0×106(匹/ml)以上の場合、1.0×106(匹/ml)未満の場合と比べて、増殖率が高いことを確認している。
上記6つの培地は、インキュベータ内で、42℃~45℃、湿度約70%、光量5000(lx)という、全て同じ培養条件下においた。そして、培養開始から観察し、2ヶ月後に、細胞が生育している領域の着色濃度を写真判定した。その実験結果を図3の表2および図4の写真に示す。
【0021】
図3の表2および図4の写真に示すように、クエン酸を含んだ培地は、2ヶ月後の時点で、クエン酸を含まない培地(コントロール)と比べてシゾンの増殖率が上がっていることがわかった。この実験1の結果からは、クエン酸濃度が2.0(%)の培地で、最もシゾンの増殖率が高いことがわかるが、他の濃度、すなわち、0.05(%)、0.1(%)および1.0(%)でも、コントロールとの差は明らかであった。一方、5.0(%)の濃度になると生育阻害をもたらした。
また、詳細は省略するが、クエン酸の替わりに酢酸を含んだ培地についても実験を行ったが、酢酸の場合、コントロールとの差はなかった。
【0022】
上記のように、クエン酸を含むことによってシゾンの増殖率が高まる理由は、以下のように推測できる。
真核細胞の光合成は、細胞内の葉緑体で行われ、光エネルギーを使って、CO(二酸化炭素)と水から、炭水化物を合成して酸素を放出する。合成した炭水化物は、ミトコンドリア内で酸素を使って分解される過程でエネルギー源(ATP)となる。このエネルギー源が豊富ならば、生物の生育が早まり、その結果増殖率も高まると考えられる。
【0023】
一方、細胞内で、細胞に取り込まれたCOは、カルビン回路を経て炭水化物に合成される。
また、ミトコンドリア内の細胞内呼吸では、糖分がピルビン酸に分解され、ピルビン酸はミトコンドリア内にあるTCA(トリカルボン酸)回路に入り、クエン酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸等を経て、エネルギー源(ATP)を合成し、その過程でCOを放出する。
そこで、上記カルビン回路やTCA回路を早く回転させることによって、より効率良くエネルギー代謝を行うことが可能となり、その結果として紅藻の増殖率を高めることができると考えられる。
【0024】
そのために、上記TCA回路の中間物質であるクエン酸を培地に添加すると、このクエン酸が細胞内に取り込まれ、TCA回路がよりスムーズに回転させられると考えられる。
【0025】
また、カルビン回路やTCA回路の光合成や呼吸に関与する代謝物であれば、クエン酸以外であっても、増殖率を高める効果を期待できるが、カルビン回路やTCA回路の光合成や呼吸に関与する代謝物であっても、細胞内に取り込まれなければ、上記のような効果は得られない。つまり、クエン酸は、細胞内に取り込まれやすい物質と考えられる。
なお、クエン酸以外の物質についても、増殖率を高める効果がないか確認するために、実験2を行い、その結果を図5の表3に示す。
【0026】
(実験2)
上記した培地の作成方法に従って、クエン酸の代わりに、図5の表3に示すアミノ酸、核酸、糖、その他の各物質を用いて、それぞれプレート培地を作成した。具体的には、クエン酸溶液の代わりに、各物質の水溶液を作成し、その水溶液を加熱加圧滅菌後、それぞれ加熱加圧滅菌後の、上記基礎培養体およびゲランガム溶液に混合して冷やし固めた。
そして、それぞれの培地に、シゾンを植え付け、42℃~45℃、湿度70%を保ち、光量なども同一条件で培養した。
【0027】
実験結果は、図5の表3に示すように、いずれの物質も、図3の表2に示すコントロールと比べて増殖率を高める効果はなかった。しかも、尿素と、NaClを添加した培地では、コントロールよりも増殖率が下がり、2週間後には死滅してしまった。
【0028】
以上のように、クエン酸を含んだプレート培地は、シゾンの増殖率を高めることがわかった。詳細は省略するが、支持体であるゲランガムを含まない液体培地であっても、クエン酸を含むことによって、上記実施例と同様に、増殖率が高くなることをシゾンで確認済みである。
ただし、プレート培養なら、例えば、生育状態の異なる突然変異体を採取することが可能であるが、液体培養では、個々の細胞を区別することは、ほとんど不可能である。
また、この実施例では、シゾンを用いた培養実験を説明しているが、シゾンと、ほぼ同じ環境に棲息する紅藻のシアニジウム属のシゾン以外の紅藻についても、同様の効果が得られる。
【0029】
なお、上記実施例で説明した培地の組成は、一例であり、この発明の培地はこれに限定されるものではない。要するに、紅藻のシアニジウム属が棲息可能な強酸性であって、クエン酸を含有していればよい。特に、基礎培養体には、硫酸とアンモニウムを含むことが好ましい。硫酸によって、硫酸環境に生息するシゾンにとって好ましい環境を作ることができる。また、アンモニウムは、光合成を行う際の窒素源となるからである。
また、クエン酸の含有量にも最適な範囲があるが、クエン酸量によるpHの変化は、基礎培養体のpHを調整することによって対応し、培地全体のpHを調整することができる。
ただし、培地全体に、2倍~20倍濃度のアレン培地と同等の成分を含んだ場合、シアニウム属の増殖率が高まり、効率の良い培養ができることを確認している。
実験により、1倍濃度のアレン培地に比べて、2倍~20倍濃度のアレン培地で、シアニウム属の増殖率が高く、20倍濃度を超えた高濃度アレン培地では、増殖率があがらないことを確認している。上記2倍~10倍濃度の範囲では、若干ではあるが、濃度が高くなるほど増殖率が高くなり、約10倍~20倍濃度の範囲では、濃度の影響はほとんどない。従って、経済効率を考えれば、最終的にできあがった培地を、2倍濃度のアレン培地と同等になるように調整することが好ましい。
【0030】
また、支持体としてゲランガム濃度は、上記実施例では、培地全体に対して約0.5%にしているが、プレート培地とするためには、0.4~0.6(%)くらいが好ましい。ゲランガム濃度が高すぎると、プレートが硬くなってしまい、培地が硬すぎると紅藻の生育が悪いという結果が出ている。一方で、ゲランガム濃度が低すぎた場合、生育には問題がないが、培地が液体状になってしまうので、特定の細胞を採取できるという、プレート培地のメリットは得られなくなる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】この発明の培地の作成手順を示した図である。
【図2】基礎培養体の組成の一例を示した表である。
【図3】実験1の結果を示した表である。
【図4】実験1の結果を表した写真である。
【図5】実験2の結果を示した表である。
【図6】アレン培地の組成を示した表である。
【図7】アレン培地に用いるP4metalの組成を示した表である。
図面
【図1】
0
【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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