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明細書 :シゾンを選択的に培養する培地

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第4180060号 (P4180060)
公開番号 特開2006-230267 (P2006-230267A)
登録日 平成20年9月5日(2008.9.5)
発行日 平成20年11月12日(2008.11.12)
公開日 平成18年9月7日(2006.9.7)
発明の名称または考案の名称 シゾンを選択的に培養する培地
国際特許分類 C12N   1/12        (2006.01)
FI C12N 1/12 B
請求項の数または発明の数 4
全頁数 8
出願番号 特願2005-048532 (P2005-048532)
出願日 平成17年2月24日(2005.2.24)
審査請求日 平成17年9月5日(2005.9.5)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】300071579
【氏名又は名称】学校法人立教学院
発明者または考案者 【氏名】黒岩 常祥
【氏名】八木沢 芙美
【氏名】岡野 幸雄
【氏名】黒岩 晴子
【氏名】三角 修巳
個別代理人の代理人 【識別番号】100076163、【弁理士】、【氏名又は名称】嶋 宣之
審査官 【審査官】長井 啓子
参考文献・文献 国際公開第2004/081176(WO,A1)
調査した分野 C12N 1/12
BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN)
JSTPlus(JDreamII)
JMEDPlus(JDreamII)
JST7580(JDreamII)
特許請求の範囲 【請求項1】
シゾンが増殖可能な強酸性であって、アクチン重合阻害剤を含んだことを特徴とするシゾンを選択的に培養する培地。
【請求項2】
上記アクチン重合阻害剤がサイトカラシンである請求項1に記載のシゾンを選択的に培養する培地。
【請求項3】
クエン酸を添加した請求項1または2に記載のシゾンを選択的に培養する培地。
【請求項4】
ゲル状を維持するための支持体を用いてプレート状にした請求項1~3のいずれか1に記載のシゾンを選択的に培養する培地。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
この発明は、シゾン(Cyanidioschyzon merolae)を選択的に培養するための培地に関する。
【背景技術】
【0002】
シゾンは、温泉に生息する単細胞の藻の一種であり、約20億年前に出現した真核生物の起源に最も近く位置する生物である。シゾンは、1つの細胞に核とミトコンドリアや葉緑体など真核生物に共通するオルガネラを最小単位で含んでいる単純な構造である。
このように、シゾンは、現在地球上に存在する全ての生物の生命の基になる物質を含んでいるとともに、構造が単純であるため、実験や解析がやりやすいという特徴を持っている。また、シゾンは、細胞壁を持っていないため、細胞内物質を取り出しやすいという生化学的な解析に有利であるとともに、本願の発明者らによってゲノム解読も完了しているので、その情報を基盤に応用的な研究に利用することも可能である。
【0003】
つまり、シゾンは、真核細胞の基本原理の謎に迫るための実験材料として最適である。そこで、実験材料としてのシゾンを効率良く培養する必要性が生じる。
なお、シゾンは、pH1.5、温度45℃という極限環境に棲息するので、培養するためには強酸性の環境が必要である。このような強酸性の培地として、アレン培地を用いることがある。
上記アレン培地とは、強酸性の液体培地であり、その組成は、図8の表5に示すとおりである。なお、上記表5中のP4metalの組成を、図9の表6に示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
シゾンの場合、pH1.5、温度45℃という極限環境に棲息するが、このような環境でも棲息可能な、シゾン以外の藻類やカビなどもあり、自然界においてはそれらが一緒に棲息している場合がほとんどである。そのため、アレン培地を利用してシゾンを培養する場合に、同じ生息環境にいる藻類やカビの混入が起こる可能性がある。培養中に、上記のような他の生物の混入を許したのでは、研究対象として必要なシゾンのみを取り出すことが困難になる。
そこで、この発明の目的は、他の生物の混入を防止して、シゾンのみを選択的に培養することが可能な培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
第1の発明の培地は、シゾンが増殖可能な強酸性であって、アクチン重合阻害剤を含んだ点に特徴を有する。
第2の発明は、上記第1の発明を前提とし、アクチン重合阻害剤がサイトカラシンである点に特徴を有する。
第3の発明は、上記第1または第2の発明を前提とし、クエン酸を添加した点に特徴を有する。
第4の発明は、上記第1~第3の発明を前提とし、ゲル状を維持するための支持体を用いてプレート状にした点に特徴を有する。
【発明の効果】
【0006】
第1~第4の発明の培地によれば、アクチンタンパク質の収縮リングを利用して分裂増殖する全ての生物の増殖を阻止することができる。従って、シゾンの培養時に、シゾン以外の藻類やカビの増殖を阻止でき、シゾンだけを培養することができる。その結果、実験材料として必要なシゾンを効率的に培養し、採取することができるようになる。
【0007】
第3の発明によれば、シゾンを選択的に培養するだけでなく、その増殖率を高め、より効率良くシゾンを増殖させることができる。
第4の発明によれば、プレート培地が得られるので、液体培養ではできない、生成した藻類のコロニーを個別に分離して採取することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0008】
この発明の発明者らは、シゾンのゲノム解読に成功し、その結果、シゾンの細胞分裂がアクチンタンパク質を利用していないことを突き止めた。具体的には、シゾンがどのような方法で細胞分裂を行っているのかは明らかになっていないが、アクチンタンパク質を利用しない別の方法で細胞分裂を行っていると考えられる。
これに対し、他の、ほとんど全ての真核細胞は、アクチンタンパク質からなる収縮リング(アクチンリング)を利用して細胞分裂を行うことがわかっている。
【0009】
そこで、培地にアクチン重合阻害剤を含めば、アクチンタンパク質の合成が阻害され、アクチンリングを利用して細胞分裂を行う生物は、増殖ができなくなり、その結果、棲息できなくなるはずである。
一方、シゾンは、細胞分裂、すなわち増殖にアクチンリングを利用しないので、アクチン重合阻害剤によって増殖が抑制されることがない。
つまり、アクチン重合阻害剤を含むとともに、シゾンの増殖が可能な強酸性である、この発明の培地を用いれば、シゾンとともに混入した他の藻類やカビなどは、棲息できなくなる。その結果、この培地では、シゾンだけが選択的に培養されることになる。
【0010】
次に、この発明の培地の第1実施例として、アクチン重合阻害剤を含んだ強酸性のプレート培地について説明する。なお、強酸性とは、pHが約3.0以下であり、紅藻のシアニジウム属が棲息可能なpHである。
まず、この発明のプレート培地の、大まかな作成手順を図1に示す。
【0011】
つまり、この発明のプレート培地を作製するためには、基礎培養体(液体)と、支持体溶液と、サイトカラシン溶液とを、それぞれ作製し、これらを別々に加熱滅菌処理する。そして、加熱滅菌処理を行った各溶液を混合するが、混合する前にそれぞれ別々に、所定温度まで冷ますようにする。そして、上記混合液をシャーレなどの型に流し込んでさらに冷やし固める。
なお、培地作成の作業は全てクリーンベンチを用いた無菌作業である。
【0012】
上記基礎培養体は、図2の表1に示すように、(NH42SO4(硫酸アンモニウム)と、KH2PO4(リン酸水素二カリウム)と、MgSO4(硫酸マグネシウム)と、CaCl2/2H2O(塩化カルシウム)と、P4metalとからなる。
上記成分のうち、P4metal以外、すなわち、(NH42SO4(硫酸アンモニウム)と、KH2PO4(リン酸水素二カリウム)と、MgSO4(硫酸マグネシウム)と、CaCl2/2H2O(塩化カルシウム)とを、それぞれ5.24(g)、1.08(g)、1.00(g)、0.28(g)を1(l)の水に溶解し、それにHSO4(硫酸)を添加して溶液のpHを1.5に調整する。この溶液を121℃で20分間の加熱加圧滅菌処理をする。
【0013】
また、図9の表6に示すP4metal成分を1(l)の水に溶解し、P4metal溶液を作成し、これを、121℃で20分間の加熱加圧滅菌処理をし、8(ml)を、上記(NH42SO4などを含み加熱加圧処理を行った溶液に混合すると、滅菌処理した基礎培養体が完成する。
上記支持体溶液は、ゲランガム溶液であり、水1(l)にゲランガム10(g)を溶解して作製する。
【0014】
さらに、上記各溶液とは別に、この発明のアクチン重合阻害剤としてのサイトカラシンを水に溶解し、サイトカラシン溶液を作製する。
そして、上記ゲランガム溶液と、サイトカラシン溶液とを別々に、121℃で20分間の加熱加圧滅菌処理を行う。その後、あら熱を取り、上記基礎培養体、ゲランガム溶液、サイトカラシン溶液のそれぞれが、70℃位になったところで、基礎培養体とゲランガム溶液とを1:1で混合し、サイトカラシン溶液を、溶液1(l)に対して、サイトカラシン量が10~15(mg)だけ混合し、培地用溶液を作製する。
【0015】
次に、この培地用溶液を20(ml)、シャーレに流し込む。シャーレを放置し、冷やし固めたものが、この発明のシゾンを選択的に培養する培地である。
また、実際に、シゾンを培養する際には、シャーレ内の上記プレート培地上にシゾンを含んだ溶液を滴下し、インキュベータ内で、42℃~45℃、湿度約70%、光量5000(lx)を維持する。インキュベータ内で、上記シャーレには蓋を被せるとともに、その周囲をテープで密閉し、乾燥を防ぐようにする。
【0016】
上記実施例のプレート培地には、培地用溶液に対して10~15(mg/l)濃度のサイトカラシンが含まれている。このように培地にサイトカラシンを含ませたのは、シゾン以外の生物の増殖を抑制し、シゾンを選択的に培養するためである。サイトカラシンによってカビやその他の藻類の増殖が抑制されることを実験1によって確認した。
(実験1)
上記した第1実施例のプレート培地と同様にして、培地1(l)に対してサイトカラシンを8(mg)、10(mg)含んだ培地と、サイトカラシンを含まない培地(コントロール)とを作成し、各培地でシゾンを培養した。
上記3つの培地は、インキュベータ内で、42℃~45℃、湿度約70%、光量5000(lx)という、全て同じ培養条件下においた。そして、培養開始から1週間後にカビの発生状体を顕微鏡観察し、その結果を図3の表2に示す。
【0017】
表2に示すように、サイトカラシンを含まない培地(コントロール)と、サイトカラシンが8(mg/l)の培地は、どちらもカビの発生が見られた。特に、サイトカラシンを含有しないコントロールでは、カビの量が多く、シゾンは死滅しているように見えた。
なお、この実験によって確認されたカビは、高温、強酸性の環境下で棲息可能なカビである。
一方、サイトカラシンを10(mg/l)含有した培地では、カビの発生は全く見られず、シゾンのコロニーが生成されていた。また、カビ以外の、高温、強酸性の環境下で棲息可能な生物、例えば、シゾン以外の、紅藻のシアニジウム属の棲息もなかった。
このように、サイトカラシンにより、シゾン以外の生物の発生を抑制して、シゾンを選択的に培養することができた。
【0018】
次に、クエン酸を含有した第2実施例の培地について説明する。
クエン酸を含有したこの第2実施例の培地は、図4に示すように、基礎培養体、サイトカラシン溶液、支持体溶液を、上記第1実施例の培地と同様に作成するとともに、さらに、20(%)のクエン酸溶液を作製する。
そして、クエン酸溶液も、121℃で20分間の加熱滅菌処理を行い、加熱滅菌処理を済ませた他の溶液と一緒に混合して、培地用溶液を作成する。そして、この培地用溶液をシャーレに流しこんで冷やし固め、プレート培地を作製する。
なお、4種の溶液を混合する際には、予め、あら熱をとり、50℃くらいにしておく。また、クエン酸溶液以外の3種の溶液の混合比は、上記第1実施例と同じであり、これら3種の混合液1(l)に対して、上記クエン酸溶液を混合する。ただし、クエン酸溶液の混合量は、培地に対するクエン酸濃度に応じて調整する。
【0019】
また、上記培地用溶液を作製する過程で、基礎培養体と、支持体溶液と、クエン酸溶液とを別々に加熱滅菌した後、あら熱を取ってから混合したのは、支持体溶液に含まれるゲランガムが酸に弱いためである。もしも、ゲランガム溶液と基礎培養体とを混合してから、加熱滅菌処理を行うと、その後、温度を下げてもゲル状にならず、プレート培地を作成することができないことを確認している。このことは、加熱滅菌処理時のような高温で、かつ、強酸性の環境におかれると、ゲランガムの構造が破壊されてしまうためと予想される。
【0020】
上記のようにして作成したクエン酸を含有したプレート培地を用いて、シゾンの増殖状態を確認する実験2を行った。
(実験2)
上記した作成手順に従って、クエン酸濃度を0.05(%)、0.1(%)、1.0(%)、2.0(%)、5.0(%)にした培地と、クエン酸を含まない培地(コントロール)とを作成し、各培地で、紅藻のシアニジウム属としてシゾンを培養した。この際、各培地に植えつけるシゾンの細胞密度は、2.7×106(匹/ml)とした。
なお、培地に植えつける細胞密度が1.0×106(匹/ml)以上の場合、1.0×106(匹/ml)未満の場合と比べて、増殖率が高いことを確認している。
シゾンの培養の際、上記6つの培地は、インキュベータ内で、42℃~45℃、湿度約70%、光量5000(lx)という、全て同じ培養条件下においた。そして、培養開始から1週間後にカビの発生状体を顕微鏡観察し、その結果を図5の表3に示す。
この実験2で用いるコントロールは、上記第1実施例の培地と同じ、サイトカラシンを含んだ培地である。
【0021】
図5の表3および図6の写真に示すように、クエン酸を含んだ培地は、2ヶ月後の時点で、クエン酸を含まない培地(コントロール)と比べてシゾンの増殖率が上がっていることがわかった。この実験2の結果からは、クエン酸濃度が2.0(%)の培地で、最もシゾンの増殖率が高いことがわかるが、他の濃度、すなわち、0.05(%)、0.1(%)および1.0(%)でも、コントロールとの差は明らかであった。一方、5.0(%)の濃度になると生育阻害をもたらした。
また、詳細は省略するが、クエン酸の替わりに酢酸を含んだ培地についても実験を行ったが、酢酸の場合、コントロールとの差はなかった。
【0022】
上記のように、クエン酸を含むことによってシゾンの増殖率が高まる理由は、以下のように推測できる。
シゾンなどの光合成は、細胞内の葉緑体で行われ、太陽エネルギーを使って、CO(二酸化炭素)と水から、デンプンを合成して酸素を放出する。合成したデンプンは、ミトコンドリア内のTCA(トリカルボン酸)回路で酸素を使って分解され、エネルギー源(ATP)となる。このエネルギー源が豊富ならば、生物の生育が早まり、その結果増殖率も高まると考えられる。
【0023】
一方、細胞に取り込まれたCOは、葉緑体内でクエン酸、オキザロ酢酸、リンゴ酸などの合成にかかわる多数の酵素の連鎖からなるカルビン回路を経てデンプンを合成する。
また、ミトコンドリア内の細胞内呼吸では、糖分がピルビン酸に分解され、ピルビン酸はミトコンドリア内にあるTCA(トリカルボン酸)回路に入り、エネルギー源(ATP)を合成し、その過程でCOを放出する。
そこで、上記カルビン回路やTCA回路を早く回転させることによって、代謝活性が上がり、その結果としてシゾンの増殖率を高めることができると考えられる。
【0024】
そのために、上記TCA回路の中間物質であるクエン酸を培地に添加すると、このクエン酸が細胞内に取り込まれ、TCA回路がよりスムーズに回転させられると考えられる。
【0025】
また、カルビン回路やTCA回路の光合成や呼吸に関与する代謝物であれば、クエン酸以外であっても、増殖率を高める効果を期待できるが、カルビン回路やTCA回路の光合成や呼吸に関与する代謝物であっても、細胞内に取り込まれなければ、上記のような効果は得られない。つまり、クエン酸は、細胞内に取り込まれやすい物質と考えられる。
なお、クエン酸以外の物質についても、増殖率を高める効果がないか確認するために、実験3を行い、その結果を図7の表4に示す。
【0026】
(実験3)
上記した第2実施例の培地の作製方法に従って、クエン酸の代わりに、図7の表4に示すアミノ酸、核酸、糖、その他の各物質を用いて、それぞれプレート培地を作製した。具体的には、クエン酸溶液の代わりに、各物質の水溶液を作成し、その水溶液を加熱滅菌後、それぞれ加熱滅菌後の、上記基礎培養体およびゲランガム溶液に混合して冷やし固めた。
そして、それぞれの培地に、シゾンを植え付け、42℃~45℃、湿度70%を保ち、光量なども同一条件で培養した。
【0027】
実験結果は、図7に示すように、いずれの物質も、図5の表3に示すコントロールと比べて増殖率を高める効果は無かった。しかも、尿素と、NaClを添加した培地では、コントロールよりも増殖率が下がり、2週間後には死滅してしまった。
【0028】
以上のように、クエン酸を含んだプレート培地は、シゾンの増殖率を高めることがわかった。また、詳細は省略するが、支持体であるゲランガムを含まない液体培地であっても、クエン酸を含むことによって、上記実施例と同様に、増殖率が高くなることをシゾンで確認済みである。
ただし、プレート培養なら、例えば、生育状態の異なる突然変異体を採取することが可能であるが、液体培養では、個々の細胞を区別することは、ほとんど不可能である。
【0029】
なお、上記第1,第2実施例で説明した培地の組成は、一例であり、この発明の培地はこれに限定されるものではない。要するに、シゾンが生息可能な強酸性であって、アクチン重合阻害剤を含有していれば、他の生物の混入を阻止してシゾンを選択的に培養することができる。
特に、基礎培養体には、硫酸とアンモニウムを含むことが好ましい。硫酸によって、硫酸環境に生息するシゾンにとって好ましい環境を作ることができる。また、アンモニウムは、光合成を行う際の窒素源となるからである。
【0030】
また、支持体としてゲランガム濃度は、上記実施例では、培地全体に対して約0.5%にしているが、プレート培地とするためには、0.4~0.6(%)くらいが好ましい。ゲランガム濃度が高すぎると、プレートが硬くなってしまい、培地が硬すぎると紅藻の生育が悪いという結果が出ている。一方で、ゲランガム濃度が低すぎた場合、生育には問題がない。しかし、ゲランガム濃度が低すぎて、培地が液体状になってしまうと、特定の細胞を採取できるという、プレート培地のメリットは得られなくなる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】第1実施例の培地の作成手順を示した図である。
【図2】基礎培養体の組成の一例を示した表である。
【図3】実験1の結果を示した表である。
【図4】第2実施例の培地の作成手順を示した図である。
【図5】実験2の結果を示した表である。
【図6】実験2の結果を示した写真である。
【図7】実験3の結果を示した表である。
【図8】アレン培地の組成を示した表である。
【図9】アレン培地に用いるP4metalの組成を示した表である。
図面
【図1】
0
【図2】
1
【図3】
2
【図4】
3
【図5】
4
【図6】
5
【図7】
6
【図8】
7
【図9】
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