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明細書 :オオムギ渦遺伝子の直接検出方法

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第4231919号 (P4231919)
公開番号 特開2004-215604 (P2004-215604A)
登録日 平成20年12月19日(2008.12.19)
発行日 平成21年3月4日(2009.3.4)
公開日 平成16年8月5日(2004.8.5)
発明の名称または考案の名称 オオムギ渦遺伝子の直接検出方法
国際特許分類 C12N  15/09        (2006.01)
A01H   1/00        (2006.01)
C12Q   1/68        (2006.01)
FI C12N 15/00 ZNAA
A01H 1/00 Z
C12Q 1/68 A
請求項の数または発明の数 11
全頁数 86
出願番号 特願2003-008560 (P2003-008560)
出願日 平成15年1月16日(2003.1.16)
新規性喪失の例外の表示 特許法第30条第1項適用 平成14年8月26・27日に帯広畜産大学において開催された日本育種学会第102回講演会において発表
審査請求日 平成15年1月16日(2003.1.16)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】501203344
【氏名又は名称】独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
【識別番号】504147243
【氏名又は名称】国立大学法人 岡山大学
発明者または考案者 【氏名】蝶野 真喜子
【氏名】本多 一郎
【氏名】最相 大輔
【氏名】武田 和義
個別代理人の代理人 【識別番号】100091096、【弁理士】、【氏名又は名称】平木 祐輔
【識別番号】100118773、【弁理士】、【氏名又は名称】藤田 節
【識別番号】100119183、【弁理士】、【氏名又は名称】松任谷 優子
【識別番号】100091096、【弁理士】、【氏名又は名称】平木 祐輔
【識別番号】100096183、【弁理士】、【氏名又は名称】石井 貞次
【識別番号】100118773、【弁理士】、【氏名又は名称】藤田 節
【識別番号】100119183、【弁理士】、【氏名又は名称】松任谷 優子
審査官 【審査官】田中 晴絵
参考文献・文献 高橋隆平他,渦性遺伝子の大麦の生産形質に及ぼす影響,農学研究,昭和36年-38年,49巻,67-87
Cell,1997,Vol.90,p.929-938
The Plant Cell,2000,Vol.12,p.1591-1605
調査した分野 C12N 15/00-15/90
C12Q 1/68
BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN)
JSTPlus(JDreamII)
GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq
SwissProt/PIR/GeneSeq
特許請求の範囲 【請求項1】
配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子における該アミノ酸配列の857番目のアミノ酸をコードするコドンを調べ、該コドンとしてヒスチジンではなくアルギニンをコードするコドンが検出された場合は渦遺伝子が存在すると判定することを特徴とする、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法。
【請求項2】
前記のアルギニンをコードするコドンがCGCである、請求項1記載の方法。
【請求項3】
配列番号1で示される塩基配列を有する遺伝子における該塩基配列の2612番目の塩基を調べ、該塩基としてアデニンではなくグアニンが検出された場合は渦遺伝子が存在すると判定することを特徴とする、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法。
【請求項4】
核酸試料について、dCAPS法、PCRダイレクトシークエンシング法、AP-PCR法、RAPD法、PCR-SSCP法からなる群より選ばれる少なくとも1つの方法によって前記変異を検出する、請求項1~3のいずれか1項記載の方法。
【請求項5】
配列番号17及び配列番号18で示されるそれぞれの塩基配列からなる2種のポリヌクレオチドからなるプライマー・セットと制限酵素Hha Iとを用いるdCAPS法によって、前記変異を検出する、請求項4記載の方法。
【請求項6】
請求項1~5のいずれか1項記載の方法により得られた判定結果に基づいて、渦性品種を識別する方法。
【請求項7】
請求項1~5のいずれか1項記載の方法により得られた判定結果に基づいて、育種親を選択することを特徴とする、渦性品種の育種方法。
【請求項8】
配列番号5で示される塩基配列の一部であって2612番目の塩基位置を含む少なくとも15塩基の連続した配列若しくはそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチド又はその標識物。
【請求項9】
以下の1)~3)からなる群より選択される1)及び2)、又は2)及び3)の組み合わせであるポリヌクレオチド又はその標識物からなるプライマー・セット。
1) 配列番号5で示される塩基配列の一部であって2612番目の塩基位置よりも5'側に位置する15~50塩基の連続した配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物、
2) 配列番号5で示される塩基配列の一部であって2612番目の塩基位置よりも3'側に位置する15~50塩基の連続した配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物、
3) 配列番号1で示される塩基配列の2611番目の塩基位置を3'末端とする15~50塩基の連続した配列について2610番目の位置の塩基をグアニンに変更した配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物。
【請求項10】
請求項8記載のポリヌクレオチド若しくはその標識物、及び/又は請求項9記載のプライマー・セットを含む、オオムギ渦遺伝子の有無を判定するためのキット。
【請求項11】
配列番号5で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
発明の詳細な説明 【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法、及びその判定結果に基づく渦性品種の育種方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
オオムギ渦遺伝子は、日本古来のオオムギ半矮性遺伝子として古くから知られている遺伝子であり、1922年にすでにその遺伝子の遺伝学的特徴について報告されている(非特許文献1)。渦遺伝子はオオムギ3番染色体の動原体付近に座乗すると考えられている(非特許文献2)単一の劣性遺伝子であるが、この渦遺伝子の多面発現により、オオムギの渦性(うずせい)系統は半矮性で直立した厚く短い濃緑色の葉をつけ、多肥・密植に適する草型となる。このようなタイプの矮性形質である渦性に対し、遺伝的に対立関係にある普通型の表現型が並性である。
【0003】
交配により渦遺伝子の導入されたオオムギは多収を示すことが後々の詳細な研究により示されている(非特許文献3)。この渦遺伝子は、現在でも、重要な短稈・多収遺伝子として、日本国内で栽培されているすべての裸性オオムギ、及び皮性オオムギの約半数に導入され利用されている(非特許文献4)。このように、渦遺伝子はオオムギの多収化に貢献している重要な短稈遺伝子であるが、その矮化機構に関し、遺伝的・生理的に制御しているその遺伝子の機能については不明であったため、通常の交配以外では渦遺伝子本体を利用した植物の改良方法は開発されていなかった。
【0004】
矮性植物の矮性化機構に関しては、植物ホルモンと称される化学伝達物質との関わりで数多く研究されている。近年ではそれらの遺伝子が単離され、遺伝子そのものの利用が可能となってきている。今日、一般に植物ホルモンとして認識されている物質としては、オーキシン類、ジベレリン類、サイトカイニン類、アブシジン酸、ブラシノステロイド、およびエチレンが挙げられるが、このうち特にジベレリンは古くから植物の伸長生長に不可欠の化合物と考えられ、イネのdy、d18や、トウモロコシd1, d2, d3, d5、D8、コムギRhtなどの多くの矮性変異体は、そのジベレリン反応性と内生ジベレリンの含量より、いずれもジベレリンの生合成や受容に関する変異体であることが予測されていた。その後、これらの矮性変異体のコードする遺伝子が次々と明らかになってきており、その遺伝子そのものの利用方法も提示されているが、いずれも予測されていた通りジベレリン生合成や受容・シグナル伝達関連遺伝子であった。
【0005】
一方、従来からジベレリンではその矮化原因が説明できなかった矮性植物も知られており、その矮化原因は長らく不明であった。近年、このような矮性変異体の一つであるシロイヌナズナの矮性変異体がブラシノステロイドの生合成変異であることが明らかとなったのを契機に、植物の矮化原因としてブラシノステロイドの生合成や受容の変異体が知られるようになった。その後多くの植物でブラシノステロイドの生合成遺伝子や受容体遺伝子が明らかになり、これらを利用した植物の改良方法も提示されてきている(特許文献1及び2、並びに非特許文献5~7)。しかしながら、その矮性植物の多彩な表現型と矮性の原因である遺伝子変異との関係については依然として不明な点が多い。例えば、矮化の原因遺伝子として報告されているイネのブラシノステロイド受容体遺伝子については、その相補鎖を過剰発現する形質転換イネの表現型には様々なバリエーションがあることが報告されている(非特許文献7)。
【0006】
オオムギの渦性系統については、従来からジベレリンとは無関係な矮性であることが指摘されており、その暗発芽の幼鞘の長さとオーキシン類であるインドール酢酸含量に相関があることから、オーキシン生合成関連の矮性の可能性があることが指摘されていた(非特許文献8)。一方で、オオムギの渦性系統においてこの関係がみられるのは暗発芽幼葉鞘においてのみであり、発芽から成熟までの様々な局面で見られる渦性系統の矮性としての特徴的な形態を説明できるとは考えにくく、疑問も呈されている(非特許文献9)。このように、オオムギの渦性系統はその育種的な有用性が古くから明らかになっている変異体であるにも関わらず、その矮化原因は全く不明であり、その遺伝子本体も提示されていなかった。
【0007】
ところで、育種的にある特定の形質を持つ遺伝子を別の系統に導入する場合、交配育種の場では、交配後得られた後代でその形質の導入を判断し選抜していくが、導入する形質が遺伝的に劣性な形質などの場合、雑種第1代では目的とする形質が見られないため、多くの年限を費やすのが一般的である。最近、この年限を短縮する選抜法として、当該遺伝子と同時に遺伝する(連鎖する)DNA断片を得、これを分子マーカーとして選抜に利用するMAS(Marker Assist Selection)法の有用性が指摘されている。すなわち、当該遺伝子に強く連鎖するDNAマーカーが得られれば、幼植物などの組織の一部から抽出するDNAからその存在が確認できるため、植物を十分に栽培しなくても、その遺伝子型の推定ができるものであり、かかるDNAマーカーは育種上極めて有用であると考えられる。しかしながら、これらの分子マーカーは、通常ランダムスクリーニングによって無作為に見いだされた目的遺伝子そのものとは無関係な配列である場合がほとんどである。これらは単純に目的形質を制御する遺伝子の近傍に座乗するため、同時に後代に伝わる確率が高いだけであり、目的遺伝子とはある低い確率ながら別々の遺伝をする。すなわち、分子マーカーによる遺伝子型の推定(MAS)には一定の誤りが起こりうることが知られている(非特許文献10)。
【0008】
渦性は遺伝的に劣性な形質であることから、雑種第1代で渦遺伝子の有無を検出できる分子マーカーは、育種を効率化するために重要である。従来、渦遺伝子との連鎖を示す分子マーカーが報告されているが(非特許文献11)、いずれもAFLP法やRFLP法などによって見いだされた単純に渦遺伝子に遺伝的に連鎖するだけのマーカーであり、渦遺伝子とは同座ではないと考えられる。そのため、これらの遺伝子マーカーによる渦遺伝子の有無の推定には一定の誤りが起こる危険性があることが十分に考えられることから、渦遺伝子を確実に検出できる手法の開発が待たれていた。
【0009】
最近、オオムギ渦性系統におけるブラシノステロイド非感受性及び内生ブラシノステロイドの大量蓄積が報告された。ブラシノライド(BL)は、ブラシノステロイド(BRs)の1種である植物ホルモンである。これまでにも、シロイヌナズナ等の複数の植物で、ブラシノステロイドの欠損や非感受性が矮性原因となっている様々なブラシノステロイド関連変異体が報告されている(例えば、非特許文献6[シロイヌナズナbri1]、非特許文献7[イネd61]、非特許文献12[ブラシノステロイドと植物のステロイドホルモンの情報伝達]、及び非特許文献13[シロイヌナズナbin2] を参照されたい)。なおシロイヌナズナbri1とbin2は、別個の遺伝子の変異体であるにも関わらず、よく似た表現型を現すことが報告されている(非特許文献13)。これらの知見から、オオムギでもブラシノステロイド非感受性と渦性系統の矮性とが関連することが示唆された。
【0010】
【特許文献1】
特表2002-508665号公報
【特許文献2】
特表2001-327287号公報
【非特許文献1】
三宅、今井, 植物学雑誌, 東京植物学会, (1922) 第36巻, p.25-38
【非特許文献2】
Barley Genetics Newsletter, (United States of America), The American Malting Barley Association, Inc., (1997), Vol.26, p.136
【非特許文献3】
高橋隆平ら、農学研究, 岡山大学資源生物科学研究所, (1961), 49, p.67-87
【非特許文献4】
河田尚之、転作全書, 農山漁村文化協会, (2001), 「第1巻」ムギ, p.141-149
【非特許文献5】
Fujioka, S., et al., The Plant Cell, (1997), 9, p.1951-1962
【非特許文献6】
A putative leucine-rich repeat receptor kinase involved in brassinosteroid signal transduction., Cell, (1997), Vol.90, p.929-938
【非特許文献7】
"Loss of function of a rice brassinosteroid insensitive1 homolog prevents internode elongation and bending of the lamina joint.", The Plant Cell, (2000), Vol.12, p.1591-1605
【非特許文献8】
Inoue, M. et al., Plant & cell physiology, (1982), 23, p.689-698
【非特許文献9】
Honda, I. et al., "Dwarfism of dwarf barley "uzu"", Proceeding of seventh international symposium of Pre-harvest sprouting in cereals 1995, Center for Academic Societies Japan, Osaka, (1996), p.477-482
【非特許文献10】
池田、農林水産文献解題No23, 農林統計協会, (2000), p.601-615
【非特許文献11】
Mano, Y., et al. Genome/National Research Council Canada, (2001), 44, p.284-292
【非特許文献12】
Bishop G.J. and Koncz C., The Plant Cell, Supplement 2002, S97-110
【非特許文献13】
Li, J., et al., Plant physiology, September 2001, Vol. 127, p. 14-22
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物試料中のオオムギ渦遺伝子の有無を特異的かつ効率的に判定する方法、渦性品種の識別方法、及び簡便かつ確実に渦性品種を作出することができる渦性品種の育種方法を提供することを目的とする。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、オオムギ渦遺伝子が、配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードするブラシノステロイド受容体相同遺伝子において、該アミノ酸配列の857番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの1アミノ酸変異を伴う塩基の変異を有する変異型遺伝子であることを見出した。そして、オオムギの渦性の原因は、ブラシノステロイド受容体におけるそのような1アミノ酸変異であることを見出した。そこで本発明者らは、その1アミノ酸変異を伴う遺伝子変異を検出することにより渦遺伝子を特異的かつ直接的に検出する手法を開発し、それによって植物試料中のオオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法を完成させた。本発明者らはさらに、その判定結果に基づいて、前記植物試料の由来する植物が渦性品種であるか否かを識別する方法、及び前記植物試料の由来する植物を育種親として選択することを特徴とする渦性品種の育種方法を開発した。
すなわち本発明は、以下の通りである。
【0013】
[1] 配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子における、該アミノ酸配列の857番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの変異を伴う塩基の変異を検出することを特徴とする、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法。ここで、前記の塩基の変異は、主として、857番目のアミノ酸に対応するコドンのCACからCGCへの変異である。
[2] 配列番号1で示される塩基配列を有する遺伝子における、該塩基配列の2612番目の塩基のアデニンからグアニンへの変異を検出することを特徴とする、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法。
[3] 核酸試料について、好ましくはdCAPS法、PCRダイレクトシークエンシング法、AP-PCR法、RAPD法、PCR-SSCP法からなる群より選ばれる少なくとも1つの方法によって前記変異を検出する、上記[1]又は[2]の方法。
ここで、上記[3]の方法の中でも、配列番号17及び配列番号18で示される塩基配列をそれぞれ有する2種のポリヌクレオチドからなるプライマー・セットと制限酵素Hha Iとを用いるCAPS法によって、前記変異を検出する方法が好適である。
[4] 上記[1]~[3]のいずれか1つの方法により得られた判定結果に基づいて、渦性品種を識別する方法。
[5] 上記[1]~[3]のいずれか1つの方法により得られた判定結果に基づいて、育種親を選択することを特徴とする、渦性品種の育種方法。
[6] 配列番号5で示される塩基配列の一部であって2612番目の塩基位置を含む少なくとも12塩基の連続した配列若しくはそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチド又はその標識物。
[7] 以下の1)~3)からなる群より選択される少なくとも1つのポリヌクレオチド又はその標識物からなるプライマー。
1) 配列番号5で示される塩基配列の一部であって2612番目の塩基位置よりも5'側に位置する12~50塩基の連続した配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物、
2) 配列番号5で示される塩基配列の一部であって2612番目の塩基位置よりも3'側に位置する12~50塩基の連続した配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物、
3) 配列番号1で示される塩基配列の2611番目の塩基位置を3'末端とする12~50塩基の連続した配列について2610番目の位置の塩基をグアニンに変更した配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物。
[8] 上記[6]記載のポリヌクレオチド若しくはその標識物、及び/又は上記[7]記載のプライマーを含む、オオムギ渦遺伝子の有無を判定するためのキット。
[9] 配列番号5で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【0014】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、オオムギの渦性の原因遺伝子であるオオムギ渦遺伝子を単離して、その塩基配列及びアミノ酸配列を決定することができれば、オオムギにおいて渦性を引き起こす遺伝子変異を特定できると考えた。そして、そのような遺伝子変異を簡便に検出することができれば、オオムギ渦遺伝子を直接検出できるため、植物試料中のオオムギ渦遺伝子の有無を確実に判定することが容易になるであろうと考えた。また上記判定方法を利用して育種親を選択することにより、育種において渦性品種を確実に作出できるであろうと考えた。本発明は、このような着想に基づいて完成されたものである。
【0015】
本発明の方法によれば、幼植物体等を含む任意の植物試料について、渦遺伝子を含有するか否か(渦遺伝子の有無)を判定することができる。すなわち本発明の方法は、育種現場における渦遺伝子の導入に伴う従来の労力を大幅に軽減できる点で特に有用である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【0016】
1.オオムギ渦遺伝子
日本の関東以西と韓国南端部に限定的に、渦性と呼ばれる形質を有するオオムギ半矮性系統が存在する。この渦性を支配する遺伝子がオオムギ渦遺伝子である。オオムギ渦遺伝子をホモ接合体として有するオオムギ系統は、マイルドな短稈となり、多肥・密植に適していて多収・耐倒性を示すことから、育種において非常に有用に使用されてきた。
【0017】
本明細書において、「オオムギ渦遺伝子」とは、オオムギの渦性の原因遺伝子でありオオムギ3番染色体の動原体付近に座乗する単一劣性遺伝子、又はその単離された遺伝子を指す。オオムギ渦遺伝子は、渦性を引き起こす変異型遺伝子であることから、この遺伝子に対応する野生型の遺伝子(渦性を引き起こさない)は渦遺伝子ではない。本発明において検出対象とするオオムギ渦遺伝子は、単離された形態であってもよく、ゲノム中に組み込まれた形態であってもよく、mRNAの形態であってもよく、PCR増幅断片やcDNAのように人工的に増幅又は合成されたポリヌクレオチド断片であってもよく、ベクター中に組み込まれた形態であってもよい。検出対象とするオオムギ渦遺伝子は、生体中に存在していてもよいし(in vivo)、生体外に取り出されていてもよい(in vitro)。さらに、アミノ酸変異を伴わない塩基変異が少数(例えば1~数個)含まれる渦遺伝子も、本発明の検出対象とするオオムギ渦遺伝子に包含される。また本明細書において、用語「オオムギ渦遺伝子」は、単に「渦遺伝子」と表すこともある。また用語「渦遺伝子」は、一般に「渦性遺伝子」と称されることもある。
【0018】
本明細書において、「オオムギ渦遺伝子の有無を判定する」とは、植物試料中にオオムギ渦遺伝子が存在するか否かを決定することを意味する。このようなオオムギ渦遺伝子の有無は、従来行われてきた方法、すなわち生長後の植物体又は交配により作出した雑種第2代の生長後の植物体について渦性の特徴を有するか否かを調べることによって、さらに確認することもできる。
【0019】
さらに、本明細書において「渦性」とは、幼植物体ではしょう葉の長さが短く幼芽鞘先端に突起状の構造があり、また、成熟植物体では葉身の長さ、桿長、芒長、及び粒長が普通型の形質よりも短く、全体としてずんぐりした型となる多面的な形質を言う。用語「渦性」は、一般に「渦」と称されることもある。一方「並性」とは、渦性に対応する普通型の表現型を言う。具体的には「並性」は、渦性について前記で挙げた各項目に関して野生オオムギssp. spontaneum (例えば、OUH602系統)で見られる表現型を基準とする。
【0020】
本明細書において、用語「渦性系統」は、渦遺伝子を有し渦性を示すオオムギの野生種若しくは栽培品種の個々の植物系統に対して又はそれらの植物系統を総称して使用される。さらに用語「並性系統」は、渦遺伝子をもたず渦性に対応する普通型の形質を示すオオムギの野生種若しくは栽培品種の個々の植物系統に対して又はそれらの植物系統を総称して使用される。一般に、「渦性系統」は「渦系統」と、「並性系統」は「並系統」と、称されることもある。
【0021】
本明細書において、「渦性品種」とは、渦遺伝子をホモ接合体として有する植物系統又は植物個体を意味する。さらに「並性品種」とは、渦遺伝子を有しない植物系統又は植物個体を意味する。なお通常、渦遺伝子をヘテロ接合体として有する植物個体は並性を示すが、その植物個体の自家交配により、渦遺伝子をホモ接合体として有する渦性を示す植物個体(渦性品種)を得ることができる。ここで、「渦性品種」「並性品種」は、任意の植物分類に属するものであってよく、例えば双子葉植物であっても単子葉植物であってもよいし、種間又は属間雑種植物であってもよい。「渦性品種」「並性品種」は、限定するものではないが、例えばイネ科植物(イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシなど)、ユリ科植物(ネギ、タマネギ、アスパラガスなど)、マメ科植物(ダイズ、インゲンマメ、アズキ、エンドウマメなど)、ウリ科植物(スイカ、メロン、キュウリなど)、ナス科植物(ナス、トマトなど)、アブラナ科植物(キャベツ、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、ナタネなど)、キク科植物(ゴボウ、レタスなど)、セリ科植物(ニンジンなど)、アカザ科植物(ホウレンソウなど)、ヒルガオ科植物(サツマイモなど)、バラ科(リンゴ、ナシ、モモ、イチゴなど)、ブナ科(クリなど)、ミカン科(ミカン、レモンなど)、カキノキ科(カキなど)、ツツジ科(ブルーベリーなど)等であってよいが、イネ科植物であることが好ましく、オオムギであることがより好ましい。また「渦性品種」「並性品種」は、野生種であっても栽培品種であってもよく、交配育種により新たに作出された植物であってもよく、放射線照射等の突然変異誘発技術、細胞融合等の細胞工学技術又は遺伝子組換え等の分子生物学的技術などを用いて遺伝的に改変された植物であってもよい。なお、用語「渦性品種」「並性品種」は、植物体だけでなく、例えば幼植物体、植物器官(例えば、葉、穂、花弁、皮、茎、根、種子、種子胚、胚乳部等)、植物組織(表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)、植物細胞、植物細胞培養物、カルス等に対しても使用される。
【0022】
2.オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離
本発明を完成するためには、まず、渦遺伝子の単離を行う必要がある。そこで本発明者らは最初に、ブラシノステロイド非感受性の原因遺伝子の1つとして報告されている、ブラシノステロイド受容体遺伝子の変異型遺伝子であるシロイヌナズナbri1及びイネd61に着目した。そしてこれらの変異型遺伝子と渦遺伝子との関連を調べるため、近年明らかになったイネ・オオムギ間のゲノムシンテニー(染色体上における遺伝子の配列順序の保存性)に注目して、渦遺伝子とイネd61のそれぞれに関する遺伝学的知見を詳細に調査した。その結果、イネ1番染色体に座乗するイネd61に強連鎖すると報告されているRFLPマーカーC1370と強連鎖が検出されているイネRFLPマーカーC1271について、オオムギ3番染色体の動原体付近に座乗するという報告(Smilde, W. D., Genome, 44:361-367 (2001))が存在することを見出した。この調査結果と渦遺伝子がオオムギ3番染色体の動原体付近に座乗することを考え合わせて、本発明者らは、渦遺伝子は、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子の相同遺伝子(本明細書では、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子と称する)に対する変異型遺伝子である可能性が高いと考えるに至った。本発明者らは、この仮説に基づき、まずオオムギ並性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離を試みた。その結果、配列番号3で示される塩基配列を有するオオムギ並性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子を得ることに成功した。また、この遺伝子がコードするタンパク質は、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有することが示された。
【0023】
オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離は、限定するものではないが、具体的には例えば、以下のような方法に従って行うことができる。まず、オオムギ並性系統由来の植物試料(例えば、オオムギ栽培品種「ミサトゴールデン」又は「はるな二条」の種子胚)から常法により全RNAを抽出し、さらに全RNAからmRNAを精製する(例えば、Dynabeads Olygo (dT)25 resin (Dynal Biotech)使用)。このmRNAを鋳型として常法により逆転写を行ってcDNAを調製する。次いで、調製したcDNAを鋳型とし、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子に対して設計した縮重プライマーを合成して用いて、PCR増幅を行う。縮重プライマーは、シロイヌナズナとイネで報告されているブラシノステロイド受容体遺伝子の塩基配列(シロイヌナズナ:アクセッション番号 AF017056、イネ:アクセッション番号 AP003453)に基づいて設計する。塩基配列より推定されるシロイヌナズナとイネのブラシノステロイド受容体タンパク質のアミノ酸配列には高度に保存された領域が見出されるため、前記プライマーはその保存領域に対する縮重プライマーとして設計することが好ましい。この場合のプライマーの設計は、当技術分野で公知の方法に従って行えばよい。これらのプライマーには、アデニン・チミン・グアニン・シトシン以外の塩基(修飾塩基又は人工塩基等を含む)を使用することもできる。限定するものではないが、具体的には例えば、チミンの代わりにウラシル、アデニン・チミン・グアニン・シトシンの4種の混合塩基の代わりにイノシンを用いることができる。
【0024】
ところで、シロイヌナズナとイネとの間で見出される保存領域は、ロイシンリッチリピートを持つ膜貫通型レセプター型タンパク質リン酸化酵素であるブラシノステロイド受容体のタンパク質リン酸化酵素ドメインに相当するため、ブラシノステロイド受容体以外のタンパク質リン酸化酵素でも保存されているものと思われる。また植物では、ブラシノステロイド受容体と同様のレセプター型タンパク質リン酸化酵素が複数種存在するという報告もある(非特許文献12)。すなわち、上記保存領域に対するプライマーを用いるPCR(Polymerase Chain Reaction)は、ブラシノステロイド受容体以外のタンパク質リン酸化酵素遺伝子を増幅する可能性が高い。さらに、シロイヌナズナとイネのブラシノステロイド受容体においてはブラシノステロイドの受容に関与する部分の保存性はあまり高くなく、それらの遺伝子内には繰り返し配列が多いという問題もある。従って、上記縮重プライマーは、ブラシノステロイド受容体遺伝子を特異的に増幅可能となるように設計する必要がある。
【0025】
以上のように設計される縮重プライマーとして、本発明において好適に使用できる第1の組み合わせとしては、例えば次のようなものが挙げられる。
5'-縮重プライマー: 5'-AARTGYACIAAIYTIAAYTGGAT-3'(配列番号7)
3'-縮重プライマー1:5'-ARIGGYTTYTCRAAIGCIGC-3'(配列番号8)
【0026】
この第1の組み合わせのプライマーを用いてPCR増幅を行う場合、得られたPCR断片を鋳型とし、さらにnestid-PCRを行うことが好ましい。このnestid-PCRで使用するプライマーは、上記PCR増幅断片の内側を特異的に増幅することができる縮重プライマーである。このような縮重プライマーも、上記と同様の方法で設計すればよい。この工程で好適な縮重プライマーの組み合わせは次の通りである。なお、3'-縮重プライマー2は、増幅断片の内側の別の保存配列に対して設計した縮重プライマーである。
5'-縮重プライマー: 5'-AARTGYACIAAIYTIAAYTGGAT-3'(配列番号7)
3'-縮重プライマー2:5'-ARISWRAAIARIARICCCATIGC-3'(配列番号9)
【0027】
このようにして得られるPCR増幅断片のサイズは、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子の塩基配列に基づいて予想することができる。例えば、上記に具体的に示した塩基配列(配列番号7~9)の縮重プライマーを使用した場合、得られるPCR増幅断片の長さは、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子の塩基配列から約875bpと予想される。続いてこの増幅断片を常法によりクローニングし、塩基配列を決定する。
【0028】
次に、完全長cDNAを単離するため、得られた増幅断片の塩基配列に基づいて遺伝子特異的プライマーを設計・作製し、それを用いて常法によりRACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)を行う。RACEに用いる鋳型としては、例えば、オオムギ並性系統由来の植物試料(例えば、オオムギ栽培品種「ミサトゴールデン」の種子胚)から常法により抽出した全mRNAを用いて調製した、5'及び3'末端にアダプターを付加したcDNA(Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech)を使用説明書に従って使用)を用いればよい。ここで、5'-RACE及びnestid-PCRに使用する好適な遺伝子特異的プライマーは、以下の通りである。
アンチセンスプライマー1:5'-TCATCTTCCCCGACTGCTCTGCCA-3'(配列番号10)
アンチセンスプライマー2:5'-TTGAGGGCGGTGAGCGAGGTGAG-3'(配列番号11)
アンチセンスプライマー3:5'-TCTCCGGCGATCTTGTTGCTGGAC-3'(配列番号12)
アダプタープライマーAP1:5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(配列番号13)(Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech))
【0029】
また3'-RACEに使用する好適な遺伝子特異的プライマーは、以下の通りである。
センスプライマー:5'-TGGCAGAGCAGTCGGGGAAGATGA-3'(配列番号14)
アダプタープライマーAP1:5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(配列番号13)(Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech))
次いで、上記の通りRACEを行って得られるPCR断片について、常法により塩基配列決定を行う。このようにして、オオムギのブラシノステロイド受容体をコードすると推定される遺伝子のcDNA全長の塩基配列を決定することができる(3.6 kbp以上にわたる領域について決定することが好ましい)。
【0030】
さらに、この塩基配列を確実なものにするため、全長cDNAの塩基配列情報を基に、5'側の非翻訳領域に対して設計した遺伝子特異的プライマー(5'-CGCTTCTCGCATGGTCTCAAGGTAG-3'(配列番号15))及び3'の非翻訳領域に対する遺伝子特異的プライマー(5'-AGCTTGCGTGGGAACCTCAGAATG-3'(配列番号16))を作製し、これらプライマーを用いて、オオムギ並性系統(例えば、栽培品種「ミサトゴールデン」)から常法により調製したcDNAを鋳型とするhigh fidelity PCRを行うことが好ましい。好適なPCR反応条件の例としては、Pyrobest DNA polymerase(TaKaRa)を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りとすればよい。好適なPCR反応の温度サイクルは、変性98℃10秒、アニーリングおよび伸長反応72℃4分を5サイクル、次いで変性98℃10秒、アニーリングおよび伸長反応70℃4分を25サイクルである。このようにして増幅されるPCR断片(3,558 bp)をベクター(例えば、pCR4Blunt-TOPO ベクター(Invitrogen))中にクローニングし、複数のクローンについて常法により塩基配列を決定して、クローン間で全長cDNA増幅断片の塩基配列が一致することを確認することができる。さらに、以上のようにして決定された塩基配列から推定されるアミノ酸配列をイネのブラシノステロイド受容体のアミノ酸配列と比較することにより、それらが高度の相同性(82.3%の同一性)を有すること、並びにシロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体に見出される特徴的なドメインを共通して含んでいることに基づいて、単離された全長cDNAがブラシノステロイド受容体相同遺伝子であると判断することができる。
【0031】
3.ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の単離と変異の同定
本発明者らは、上記のブラシノステロイド受容体相同遺伝子をさらに渦性系統から単離して、塩基配列を決定した。その結果、渦性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子は、配列番号5で示される塩基配列を有することが示された。また渦性系統の該遺伝子がコードするタンパク質は、配列番号6で示されるアミノ酸配列を有することが示された。
【0032】
並性系統と渦性系統との間でブラシノステロイド受容体相同遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を比較すると、両者の塩基配列には、2612番目の塩基の位置(塩基位置)に1塩基の違いが認められる。すなわち並性系統では2612番目の塩基がアデニンであるのに対し、渦性系統ではグアニンである(配列番号3及び5の塩基番号2612を参照)。本明細書ではこの塩基の変異を「2612A→G」としても表す。またこの位置の塩基を、それぞれ「2612A」「2612G」のように表す。この1塩基の違いによって、配列番号2で示されるアミノ酸配列における857番目のアミノ酸は、並性系統ではヒスチジンであるのに対し、渦性系統ではアルギニンとなる(配列番号4及び6のアミノ酸番号857、並びに図2を参照)。本明細書ではこのアミノ酸の変異を「857His→Arg」としても表す。またこの位置のアミノ酸を、それぞれ「857His」「857Arg」のように表す。この1アミノ酸変異部位は、ブラシノステロイド受容体の機能性部位であるタンパク質リン酸化酵素の保存ドメインIV中にあるため(図1)、渦性系統では、ブラシノステロイド受容体タンパク質の機能が変化していると考えられる。従って、本明細書では、渦性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子をブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体と称する。
【0033】
なお本明細書においては、1塩基の違いが存在する並性系統と渦性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子の塩基配列を、便宜上1つの塩基配列として配列番号1として示す。同様に、1アミノ酸の違いが存在する並性系統と渦性系統のブラシノステロイド受容体タンパク質のアミノ酸配列を、便宜上1つのアミノ酸配列として配列番号2として示す。
【0034】
上述したブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の単離は、具体的には以下の通り行うことができる。まず、オオムギ渦性系統由来の植物試料から、核酸試料を調製する。オオムギ渦性系統としては任意の渦性系統を用いることができるが、例としては、例えば日本および朝鮮半島のオオムギ栽培品種である「赤神力」、「カシマムギ」、「清源在来」、「青麦」、「谷風」、「関取」及び「コビンカタギ」等の渦性系統が挙げられる。また植物試料としては、特に限定されるものではなく、植物より採取される任意の試料を使用できるが、例としては、例えば植物体、幼植物体、植物器官(例えば、葉、穂、花弁、皮、茎、根、種子、種子胚、胚乳部等)、植物組織(表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)、植物細胞、植物細胞培養物、カルス等が挙げられる。また植物試料から調製する核酸試料としては、限定するものではないが、ゲノムDNA、cDNA、及びmRNA、並びにそれらの核酸増幅断片が挙げられる。なおブラシノステロイド受容体相同遺伝子は、ゲノムDNA上でイントロンを含まないことが判明したことから、ゲノムDNAとcDNAのいずれに含まれるブラシノステロイド受容体相同遺伝子をPCR増幅しても得られる塩基配列は同一である。これらの核酸試料の調製は当業者に公知の方法、例えばCTAB法等によって行うことができる。核酸試料は精製されていることが好ましい。
【0035】
次に、調製した核酸試料を鋳型として、5'側の非翻訳領域に対する遺伝子特異的プライマー(例えば、5'-CGCTTCTCGCATGGTCTCAAGGTAG-3'(配列番号15))及び3'の非翻訳領域に対する遺伝子特異的プライマー(例えば、5'-AGCTTGCGTGGGAACCTCAGAATG-3'(配列番号16))を使用するPCR等の任意の核酸増幅法(好ましくは、high fidelity PCR)を実施する。好適なPCR反応条件の例としては、Pyrobest DNA polymerase(TaKaRa)を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りとすればよい。好適なPCR反応の温度サイクルは、変性98℃10秒、アニーリングおよび伸長反応72℃4分を5サイクル、次いで変性98℃10秒、アニーリングおよび伸長反応70℃4分を25サイクルである。以上のようにして増幅される核酸断片(3,558 bp)は、本発明において単離されるブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体である。
【0036】
4.dCAPSマーカーを利用したブラシノステロイド受容体相同遺伝子における一塩基の違い(2612AGSNP)の検出
本発明者らは、並性系統と渦性系統との間のブラシノステロイド受容体相同遺伝子における一塩基の違い(2612A→GのSNP)を簡便に検出できるdCAPSマーカーを開発した。dCAPSマーカーを用いたそのような一塩基の違い(2612A→GのSNP)の検出は、例えば以下のような手順で行うことができる。
【0037】
まず、並性系統又は渦性系統由来の植物試料から調製した核酸試料を鋳型とし、dCAPSプライマー1(5'-GAAATGGAGACCATTGGCAAGATCAAGC-3'/配列番号:17)及びdCAPSプライマー2(5'-CCTTGCCTCCAGATTCTCATCAAC-3'/配列番号:18)を用いて一塩基の違い(2612A→GのSNP)が存在する部位を含むブラシノステロイド受容体相同遺伝子の部分断片をPCR増幅する。PCRの場合の反応条件の例は以下の通りである。好適なPCR反応条件の例としては、Ex TaqTM(TaKaRa)を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りとすればよい。好適なPCR反応の温度サイクルは、94℃2分の後,変性94℃30秒、アニーリング60℃30秒、および伸長反応72℃1分を35サイクルである。ブラシノステロイド受容体相同遺伝子上では、dCAPSプライマー1は2612A→GのSNP部位のすぐ上流、dCAPSプライマー2は2612A→GのSNP部位を挟んで下流に位置する(図3)。こうして得られる増幅断片においては、図3に示すように、2612番目の塩基がグアニンである渦性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子の場合はHha I認識部位が形成されるが、2612番目の塩基がアデニンである並性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子の場合はHha I認識部位は形成されない。従って、増幅断片を制限酵素Hha Iを用いて消化して電気泳動等により分画すると、渦性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子については294 bpの増幅断片が消化されて265 bpに相当するバンドが観察されるが、並性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子については294 bpに相当するバンドが観察される。逆にいえば、265 bpに相当するバンドが観察される試料中に含まれるブラシノステロイド受容体相同遺伝子においては、2612番目の塩基は2612Gであり、294 bpに相当するバンドが観察される試料中に含まれるブラシノステロイド受容体相同遺伝子においては、2612番目の塩基は2612Aである。このようにdCAPSマーカーを用いることにより、観察されるバンドのサイズから、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子における2612番目の塩基が2612Aと2612Gのいずれであるかを判別することができ、その1塩基の違いを検出することができる。
【0038】
5.遺伝学的解析による渦遺伝子の確認
上記の通りブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体がコードするブラシノステロイド受容体は、1アミノ酸変異により機能が変化していると考えられるため、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体が渦遺伝子であるとすれば、渦性系統のブラシノステロイド非感受性やブラシノステロイド蓄積を十分に説明するものと思われる。そこで、本発明者らは前述のdCAPSマーカーを用いて、渦遺伝子の分離集団に対して、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の1塩基の違い(2612A→GのSNP)をマッピングした。その結果、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の2612A→GのSNPは、渦遺伝子と同一の遺伝子座に位置付けられたため、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体は渦遺伝子そのものであることが証明された。
【0039】
dCAPSマーカーを用いたブラシノステロイド受容体相同遺伝子(HvBRI1)変異体の1塩基の違い(2612A→GのSNP)のマッピングは、具体的には以下のようにして行えばよい。まず、渦性系統と並性系統を両親(例えば、渦性系統の赤神力と野生オオムギssp. spontaneum (OUH602;並性系統))とする雑種第2代(F2)集団について、dCAPSマーカーを用いてジェノタイピングを行う。ここで、並性系統型とは、並性系統のHvBRI1をホモ接合で有するタイプ、ヘテロ型とは、並性系統のHvBRI1とHvBRI1変異体をヘテロ接合で有するタイプ、渦性系統型とは、HvBRI1変異体をホモ接合で有するタイプ、を示すものとする。その結果、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体中に見出したSNPの2612Gをホモ接合で持つ個体の分離と、渦性を示す個体の分離とが、完全に一致すること、さらに並性系統型/ヘテロ型/渦性系統型の分離が、1 : 2 : 1となり、渦遺伝子が単因子劣性の遺伝様式を示すことと合致することが確認されれば、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の2612A→GのSNPは、渦遺伝子と同一の遺伝子座に位置付けられる。
【0040】
6.渦遺伝子の有無を判定する方法
本発明により、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子における塩基の変異に伴い、該遺伝子にコードされる配列番号2で示されるアミノ酸配列の857番目のアミノ酸がヒスチジンからアルギニンへ変異することによって、オオムギの渦性が引き起こされることが明らかになった。
【0041】
従って、本発明において、渦性の原因遺伝子である渦遺伝子の有無の判定は、植物試料から調製した核酸試料について、配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子(すなわちブラシノステロイド受容体相同遺伝子)の塩基配列を調べ、該アミノ酸配列の857番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの変異を伴う塩基の変異を検出することによって、実施すればよい。より具体的には、この渦遺伝子の有無の判定は、配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子(すなわち、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子)上の、該アミノ酸配列の857番目のアミノ酸に対応するコドン(配列番号1で示される塩基配列においては2611番目~2613番目の塩基位置に相当する)を調べて、そのコドンがヒスチジンをコードするCACである場合には「渦遺伝子が存在しない」、アルギニンをコードするCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGGのいずれかである場合には「渦遺伝子が存在する」、と判定すればよい。より単純な判定基準としては、オオムギ栽培品種に由来する渦遺伝子を検出対象とする場合には、オオムギ栽培品種のブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体は857番目のアミノ酸に対応するコドンとしてCGCを有するため、857番目のアミノ酸に対応するコドンがCACであれば「渦遺伝子は存在しない」、CGCであれば「渦遺伝子が存在する」、と判定することができる。さらには、渦遺伝子の有無の判定は、植物試料から調製した核酸試料について配列番号1で示される塩基配列を調べて、2612番目の塩基がアデニン(A)であれば「渦遺伝子は存在しない」、グアニン(G)であれば「渦遺伝子が存在する」、と判定することができる。
【0042】
また、植物は通常2倍体であるため、渦遺伝子を有する植物としてはヘテロ接合体とホモ接合体との2通りがある。渦遺伝子のヘテロ接合体植物は、渦遺伝子と、渦遺伝子に対応する野生型遺伝子との両方を有する。一方、渦遺伝子のホモ接合体植物は、2つの渦遺伝子を有する。このことから、2倍体の植物個体から得られたある植物試料について上記のようにヒスチジンからアルギニンへの変異を伴う遺伝子変異を検出する際に、「渦遺伝子が存在する」と判定されるべき結果と「渦遺伝子が存在しない」と判定されるべき結果の両方が得られた場合(例えば、配列番号1で示される塩基配列の2612番目の塩基として、アデニンとグアニンの両方が検出された場合)には、「渦遺伝子がヘテロ接合体で存在する」と判定することができる。同様に、「渦遺伝子が存在する」と判定されるべき結果のみが得られた場合(例えば、配列番号1で示される塩基配列の2612番目の塩基として、グアニンのみが検出された場合)には、「渦遺伝子がホモ接合体で存在する」と判定することができる。また「渦遺伝子が存在しない」と判定されるべき結果のみが得られた場合(例えば、配列番号1で示される塩基配列の2612番目の塩基として、アデニンのみが検出された場合)には、「渦遺伝子が存在せず、渦遺伝子に対応する野生型遺伝子がホモ接合体で存在する」と判定することができる。しかしながら、半数体若しくは3倍体以上の倍数体の植物又はゲノム中に組み込まれていない導入遺伝子を有するトランスジェニック植物等に由来する植物試料について上記検出を行う場合には、「渦遺伝子が存在する」と判定されるべき結果と「渦遺伝子が存在しない」と判定されるべき結果の両方が得られたとき(例えば、配列番号1で示される塩基配列の2612番目の塩基として、アデニンとグアニンの両方が検出された場合)には、単に「渦遺伝子が存在する」と判定することが好ましい。この場合、同様にして「渦遺伝子が存在する」と判定されるべき結果のみが得られた場合(例えば、配列番号1で示される塩基配列の2612番目の塩基として、グアニンのみが検出された場合)にも、単に「渦遺伝子が存在する」と判定することが好ましい。さらにこの場合に「渦遺伝子が存在しない」と判定されるべき結果のみが得られたとき(例えば、配列番号1で示される塩基配列の2612番目の塩基として、アデニンのみが検出された場合)にも、「渦遺伝子が存在しない」と判定することが好ましい。
【0043】
なお、渦遺伝子の有無の判定において、配列番号2で示されるアミノ酸配列の塩基配列を調べる際に、該アミノ酸配列の857番目のアミノ酸に対応するコドンとは異なる位置の塩基配列における塩基の変異が1~数個の範囲で追加的に検出される場合もありうるが、そのような追加的な塩基の変異によって配列番号2で示されるアミノ酸配列のアミノ酸が変化しない(その塩基の変異によってアミノ酸が置換、欠失又は付加されることなく、フレームシフトも起こらない場合)限りにおいては、そのような場合も本発明の「渦遺伝子の有無を判定する方法」に含まれる。
【0044】
渦遺伝子の有無を判定する方法において被検体として使用される植物試料は、特に限定されるものではなく、植物より採取される任意の試料を使用できるが、例としては、例えば植物体、幼植物体、植物器官(例えば、葉、穂、花弁、皮、茎、根、種子、種子胚、胚乳部等)、植物組織(表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)、植物細胞、植物細胞培養物、カルス等が挙げられる。植物試料の供給源となる植物は、任意の植物であってよく、渦性系統であっても並性系統であってもよいし、オオムギ以外の植物、例えば双子葉植物又は単子葉植物であってもよいし、種間又は属間雑種植物であってもよい。そのような植物はさらに、野生種であっても栽培品種であってもよく、交配育種により新たに作出された植物であってもよく、放射線照射等の突然変異誘発技術、細胞融合等の細胞工学技術又は遺伝子組換え等の分子生物学的技術などを用いて遺伝的に改変された植物であってもよい。植物種としては、限定するものではないが、例えばイネ科植物(イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシなど)、ユリ科植物(ネギ、タマネギ、アスパラガスなど)、マメ科植物(ダイズ、インゲンマメ、アズキ、エンドウマメなど)、ウリ科植物(スイカ、メロン、キュウリなど)、ナス科植物(ナス、トマトなど)、アブラナ科植物(キャベツ、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、ナタネなど)、キク科植物(ゴボウ、レタスなど)、セリ科植物(ニンジンなど)、アカザ科植物(ホウレンソウなど)、ヒルガオ科植物(サツマイモなど)、バラ科(リンゴ、ナシ、モモ、イチゴなど)、ブナ科(クリなど)、ミカン科(ミカン、レモンなど)、カキノキ科(カキなど)、ツツジ科(ブルーベリーなど)等が挙げられるが、イネ科植物であることが好ましく、オオムギであることがより好ましい。
【0045】
また植物試料から調製する核酸試料としては、限定するものではないが、ゲノムDNA、cDNA、及びmRNA、並びにそれらの核酸増幅断片が挙げられる。なおブラシノステロイド受容体相同遺伝子は、ゲノムDNA上でイントロンを含まないことが判明したことから、ゲノムDNAとcDNAのいずれに含まれるブラシノステロイド受容体相同遺伝子をPCR増幅しても得られる塩基配列は同一である。これらの核酸試料の調製には、当業者が利用可能なものであればいずれの方法を利用してもよく(例えば、J.Sambrook et al. (Eds.), Molecular Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.9.16-9.23, 1989)、CTAB法等を用いることもできる。なお核酸試料は、塩基の変異の検出を行う前に、精製されていることが好ましい。
【0046】
渦遺伝子の有無を判定する方法において、塩基の変異の検出は、SNP、塩基多型又は塩基変異を検出するために当業者が利用可能なものであれば公知の様々な方法を任意に使用して行うことができる(Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 2766-2770等を参照されたい)。例えば、dCAPS法〔Plant J 14, 381-385 (1998)〕、CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)法〔「モデル植物の実験プロトコール」細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ15、2001年4月2日発行、秀潤社、p.69-76〕、PCRダイレクトシークエンス法〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕、AP-PCR(Arbitrarily Primed-PCR)法〔Nucl. Acids Res., 18, 7213-7218 (1990)〕、PCR-SSCP(一本鎖DNA高次構造多型)法〔Biotechniques, 16,296-297 (1994), Biotechniques, 21, 510-514 (1996)〕、ASO(Allele Specific Oligonucleotide)ハイブリダイゼーション法〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、ARMS(Amplification Refracting Mutation System)法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991), Nuc. Acids. Res., 20,4831-4837 (1992)〕、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis; DGGE)法〔Biotechniqus, 27, 1016-1018 (1999)〕、RNaseA切断法〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕、化学切断法〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、DOL(Dye-labeled Oligonucleotide Ligation)法〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕、MALDI-TOF/MS法(Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry)法〔Genome Res., 7, 378-388 (1997), Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、TDI(Template-directed Dye-terminator Incorporation)法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、パドロック・プローブ(Padlock Probe)法〔Nat. Genet., 3, p225-232 (1998)、遺伝子医学, 4, p50-51 (2000)〕、モレキュラー・ビーコン(Molecular Beacons)法〔Nat. Biotechnol.,1, p49-53 (1998)、遺伝子医学、4, p46-48(2000)〕、TaqMan PCR法〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕、インベーダー法〔Science, 5109, 778-783(1993), J. Biol. Chem., 30, 21387-21394 (1999), Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕、ダイナミック・アレル-スペシフィック・ハイブリダイゼーション法(Dynamic Allele-Specific Hybridization (DASH)法〔Nat. Biotechnol.,1, p87-88, (1999)、遺伝子医学, 4, p47-48 (2000)〕、UCAN法〔タカラ酒造株式会社ホームページ(http://www.takara.co.jp)参照〕、及びDNAチップまたはDNAマイクロアレイを用いる方法〔Genomics 4, (1989), Drmanae, R., Labat, I., Brukner, I. and Crkvenjakov, R., p114-128、Bio Industry Vol.17 No.4, 「DNAチップ技術」 p5-11 (2000)〕等が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。
【0047】
これらの方法において好適に用いることができる、変異部位を検出するためのプライマー又はプローブは、並性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子と渦遺伝子(ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体)とを識別する上で有用であるように、配列番号1に基づいて任意に設計することができる。プライマー又はプライマー対の設計は、当業者には公知の方法に従って行えばよい。これらのプライマー又はプローブは、配列番号5で示される塩基配列を有するブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体のポリヌクレオチドを鋳型として又は供給源として利用して、作製することもできる。
【0048】
ダイレクトシークエンシング法、PCR-SSCP法、DOL法等による、塩基多型部位を含むPCR増幅断片を検出に用いる上記方法では、配列番号5で示される塩基配列に基づいて2612番目の塩基位置を挟むように設計したプライマーを用いることが好ましい。このプライマーは、限定するものではないが、通常は12~50塩基長、好ましくは15~30塩基長のものである。
【0049】
またARMS法等による、塩基多型部位に対するミスマッチを利用したPCRを検出に利用する方法では、3'末端に多型部位を含む、配列番号5で示される塩基配列に基づいて設計した12~50塩基長、好ましくは15~30塩基長のプライマーを用いることが好ましい。例えば、配列番号1で示される塩基配列の2612番目の塩基がアデニン(A)であるかグアニン(G)であるかを判別する目的では、検出感度を高めるために、このように3'末端に多型部位(本発明では857番目のアミノ酸の変異を伴う塩基の変異部位)を含むプライマーを使用することが好ましい。
【0050】
本発明においては、上記「3.ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の単離と変異の同定」に記載した方法を、任意の植物試料から調製した核酸試料に適用して、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子全長を単離し、その塩基配列を決定し、1611番目~1613番目の塩基位置のコドンを調べることにより、857番目のアミノ酸の変異を伴う塩基の変異を検出してもよい。
【0051】
ところで、SNP検出の方法としてよく知られた手法の一つとして、CAPS法が挙げられる。CAPS法とは、主にRFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)マーカーをPCRマーカーに転用する際に利用する方法である。RFLPとは、ゲノム上の制限酵素認識部位の変異を、種々の制限酵素により切断した際に生じる相同領域を含むDNA断片の長さの差として検出する方法である。しばしばRFLPマーカーのCAPSマーカー化では、RFLPマーカーの塩基配列からプライマーを設計し、PCR増幅した断片を制限酵素で切断して多型を検出する。
【0052】
本発明では、CAPS法の変法であるdCAPS法を、塩基の変異を検出するために好適に使用することができる。dCAPS法は、多型部位がもともと制限酵素認識部位を形成していない場合に、その多型部位を含む形で制限酵素認識部位をprimer部位に導入するようにプライマー配列を改変して用いるCAPS法である。例えば渦遺伝子に特異的にみられる2612A→GのSNPだけを認識して切断するような制限酵素認識部位を含むPCR断片が増幅されるように、プライマーの配列を改変し、そのプライマーを用いてPCR増幅し、増幅断片の制限酵素処理を行い、その酵素による切断の有無によって本発明の配列番号5で示される塩基配列における2612A→GのSNPを検出する。2612A→GのSNPを検出する場合のdCAPS法では、配列番号1で示される塩基配列の2611番目の塩基位置を3'末端とするように設計した12~50塩基長、好ましくは15~30塩基長のプライマーについて、2610番目の位置の塩基をグアニンに変更した改変プライマーを用いて核酸試料を増幅し、制限酵素Hha Iを用いて消化する。このdCAPS法を用いる最適な手法としては、上記「4.dCAPSマーカーを利用したブラシノステロイド受容体相同遺伝子における一塩基の違い(2612A→GのSNP)の検出」に記載したdCAPSマーカーを用いたdCAPS法を適用すればよい。使用するプライマーは、dCAPSプライマー1(5'-GAAATGGAGACCATTGGCAAGATCAAGC-3'/配列番号:17)及びdCAPSプライマー2(5'-CCTTGCCTCCAGATTCTCATCAAC-3'/配列番号:18)である。この場合、制限酵素Hha Iで消化された265 bpの増幅断片のバンドのみが観察される植物試料は、「渦遺伝子がホモ接合体で存在する」と判定され、制限酵素Hha Iで消化されない294 bpの増幅断片のみが観察される植物試料は、「渦遺伝子が存在しない」と判定される。また、制限酵素Hha Iで消化された265 bpの増幅断片のバンドと、制限酵素Hha Iで消化されない294 bpの増幅断片の両方が観察される植物試料は、「渦遺伝子がヘテロ接合体で存在する」と判定される。
【0053】
以上のようにして植物試料について渦遺伝子の有無を判定することにより、「渦遺伝子が存在する」、「渦遺伝子がホモ接合体で存在する」、又は「渦遺伝子がヘテロ接合体で存在する」と判定される場合、その植物試料の由来する植物は渦遺伝子を少なくとも1つ有する。一方、「渦遺伝子が存在しない」又は「渦遺伝子が存在せず、渦遺伝子に対応する野生型遺伝子がホモ接合体で存在する」と判定される場合、その植物試料の由来する植物は渦遺伝子を有しない。
【0054】
7.渦性品種の識別方法及び渦性品種の育種方法
植物試料について上記方法により渦遺伝子の有無を判定した結果、「渦遺伝子がホモ接合体で存在する」と判定された場合には、その判定対象の植物試料が由来する植物を、渦性品種であるとして識別することができる。逆に、渦遺伝子の有無を判定した結果、「渦遺伝子が存在しない」と判定された場合は、その判定対象の植物試料が由来する植物を、渦性品種ではなく並性品種であるとして識別することができる。このような渦性品種の識別方法は、幼植物体、種子、葉、カルス等の矮性の判断が困難な植物試料を含む任意の植物試料にも適用できることから、例えばホモ接合体植物において早期の生長段階でその植物が渦性を示すか否かを予測することが可能になる。この渦性品種の識別方法は、任意の植物種に適用することができる。
【0055】
さらに本発明では、植物試料について上記方法により渦遺伝子の有無を判定した結果に基づいて、渦遺伝子を有する植物を育種親として選択し、その育種親を任意の育種方法(育種技術)に用いることにより、確実に渦性品種を育種することができる。限定するものではないが、例えば、ある植物について「渦遺伝子がヘテロ接合体で存在する」と判定された場合には、その植物の示す形質は並性であるが、その自家交配により渦性を示す植物個体(ホモ接合体)がF2集団中で1/4の確率で得られることが予測される。従って、「渦遺伝子がヘテロ接合体で存在する」と判定された植物を育種親として選択し、その植物を自家交配することにより、渦性品種を確実に作出することができる。このような渦性品種の育種方法は、雑種第1代の自家交配を実際に行う前に、その自家交配により渦性品種を得られるか否かを予測することができることから、育種に要する時間的・経済的コストを最小限に抑えることが可能になるという利点を有する。この渦性品種の育種方法は、特にオオムギを対象とする場合に好適に用いることができる。なお、本明細書において「育種親」とは、育種方法において親系統として用いる父方と母方のいずれか一方又はその両方の植物を意味する。また、本発明において育種親を用いる育種技術としては、育種分野で公知の任意の技術を使用することができるが、具体的には例えば、自家交配、他家交配、細胞融合、戻し交配、栄養繁殖、突然変異誘発、染色体操作等が挙げられる。
【0056】
8.その他の実施形態
本発明の他の実施形態としては、配列番号5で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。このポリヌクレオチドは、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の全体を含む。このポリヌクレオチドは、DNAであってもRNAであってもよく、RNAである場合には配列番号5で示される塩基配列中の「T(チミン)」は「U(ウラシル)」に読み換えるものとする。配列番号5で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体における塩基の変異を検出する際のプローブ又はプライマーを作製するために使用することもできる。この場合のプローブ又はプライマーの設計は、当技術分野で公知の方法に従って行えばよい。このようなプローブ又はプライマーも、DNAであってもRNAであってもよく、RNAである場合には配列番号5で示される塩基配列中の「T(チミン)」は「U(ウラシル)」に読み換えるものとする。これらのプローブ又はプライマーには、アデニン・チミン・グアニン・シトシン以外の塩基(修飾塩基又は人工塩基等を含む)を使用することもできる。限定するものではないが、具体的には例えば、チミンの代わりにウラシル、アデニン・チミン・グアニン・シトシンの4種の混合塩基の代わりにイノシンを用いることができる。
【0057】
本発明のプローブ又はプライマーは、本発明における渦遺伝子の有無の判定に使用する上で非常に有用である。特に、その塩基配列に2612A→Gの変異部位を含む本発明のプローブ又はプライマーは、該変異部位を含む領域に対するハイブリダイゼーションを利用した変異検出法において、好適に使用することができる。このような2612A→Gの変異部位を含む本発明のプローブ又はプライマーとしては、配列番号5で示される塩基配列の一部であって2612番目の塩基位置を含む、少なくとも12塩基、好ましくは12~300塩基、より好ましくは12~100塩基、さらに好ましくは12~50塩基、特に15~30塩基の連続した配列若しくはそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【0058】
さらに、本発明のプライマーであって、その塩基配列に2612A→Gの変異部位を含まず、該変異部位を挟む領域を増幅するためのプライマーは、主にPCR法を用いる変異検出法(例えば、PCRダイレクトシークエンス法、PCR-SSCP法等)において好適に使用することができる。そのようなプライマーとしては、以下の1)~3)が挙げられる。
1) 配列番号5で示される塩基配列の一部であって2612番目の塩基位置よりも5'側に位置する12~50塩基、好ましくは15~30塩基の連続した配列からなるポリヌクレオチド。
2) 配列番号5で示される塩基配列の一部であって2612番目の塩基位置よりも3'側に位置する12~50塩基、好ましくは15~30塩基の連続した配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチド。
3) 配列番号1で示される塩基配列の2611番目の塩基位置を3'末端とする12~50塩基、好ましくは15~30塩基の連続した配列について2610番目の位置の塩基をグアニンに変更した配列からなるポリヌクレオチド。
【0059】
ところで、これらの1)~3)のポリヌクレオチドの具体的な塩基配列を設計する際に、使用する検出法や実験条件により、配列番号1で示される塩基配列上の変異部位からの設計位置を考慮すべき場合がある。そのような場合、2612A→Gの変異部位から離れた位置の5'プライマーが必要な場合には、配列番号1で示される塩基配列上の塩基位置の1番目~1600番目、好ましくは1番目~1400番目、より好ましくは1番目~1000番目の領域、又は、800番目~1600番目、好ましくは1000番目~1500番目、より好ましくは1200番目~1400番目の領域、あるいは、300番目~1000番目、好ましくは500番目~800番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。また、上記変異部位から中程度に離れた位置のプライマーが必要な場合には、配列番号1で示される塩基配列上の塩基位置の1600番目~2000番目、好ましくは1700番目~1900番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。さらに、上記変異部位と近い位置のプライマーが必要な場合には、配列番号1で示される塩基配列上の塩基位置の2000番目~2611番目、好ましくは2200番目~2611番目、より好ましくは2300番目~2611番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。
【0060】
同様に、2612A→Gの変異部位から離れた位置の3'プライマーが必要な場合には、配列番号1で示される塩基配列上の塩基位置の3000番目~3558番目、好ましくは3200番目~3558番目、より好ましくは3400番目~3558番目の領域、又は、3000番目~3300番目、好ましくは3000番目~3200番目、より好ましくは3000番目~3100番目の領域、あるいは、3200番目~3400番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。また、上記変異部位から中程度に離れた位置のプライマーが必要な場合には、配列番号1で示される塩基配列上の塩基位置の2700番目~3000番目、好ましくは2800番目~3000番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。さらに、変異部位と近い位置のプライマーが必要な場合には、配列番号1で示される塩基配列上の塩基位置の2613番目~2700番目、好ましくは2613番目~2680番目、より好ましくは2613番目~2650番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。
【0061】
上記のプライマー又はプローブは、検出用に好適となるように標識されたものであってもよい。例えば、プライマー又はプローブは、蛍光色素、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等の標識が付加されたものであってよい。また本明細書では、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに付加することによって検出用に使用するオリゴヌクレオチド(例えば、変異検出のためのインベーダー法における、鋳型とは無関係な配列「フラップ」など)も、「標識」に包含する。
【0062】
例えば、蛍光色素を用いる場合には、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の定量、検出等に用いられる蛍光が好適に使用でき、例えば、ビオチン(Hexahydro-2-oxo-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-pantanoic acid、vitamin H)、HEX(4,7,2',4',5',7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein、緑色蛍光色素)、フルオレセイン(fluorescein)、ローダミン(rhodamin)またはその誘導体(例えば、テトラメチルローダミン(TMR))等を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用できる〔Nature Biotechnology, 14, p303-308 (1996)〕参照」。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる(例えば、アマシャム・ファルマシア社製 オリゴヌクレオチドECL 3' -オリゴラベリングシステム等)。
【0063】
プライマー又はプローブに上記のような標識を付加することにより、変異の検出を簡便かつ高感度に行うことができる。標識を用いる各種検出方法は、当業者には公知の技術である。なお本発明における、ポリヌクレオチドの「標識物」とは、ポリヌクレオチドに上記のような任意の標識を付加したものである。
さらに、上記のプライマー及び/又はプローブを含めたオオムギ渦遺伝子の有無を判定するためのキットも、本発明の実施形態の1つである。
【0064】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例によって制限されるものではない。
なお、以下の実施例で用いた、「ミサトゴールデン(Misato Golden)」、「赤神力(Akashinriki)」、「カシマムギ(Kashimamugu)」、「清源在来(Cheongweon Native)」、「青麦(Aomugi)」、「谷風(Tanikaze)」、「関取(Sekitori)」及び「コビンカタギ(Kobinkatagi)」は、オオムギ(Hordeum vulgare L.)栽培品種である。これらの品種は、ミサトゴールデン及びカシマムギは独立行政法人農業技術研究機構作物研究所より入手した。それ以外は岡山大学資源生物科学研究所より入手した。また野生オオムギssp. spontaneum (OUH602;並性系統)は、岡山大学資源生物科学研究所より入手した。
【0065】
[実施例1] ブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離及び渦性系統における該遺伝子の変異の同定
本発明者らは、渦遺伝子が、シロイヌナズナやイネのブラシノステロイド非感受性変異体の原因遺伝子の1つとして報告されているブラシノステロイド受容体遺伝子変異体と類似した遺伝子である可能性を検討した。そのため、本発明者らはまず、オオムギにおけるブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離を行った。
【0066】
オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離には、並性系統として「ミサトゴールデン」、渦性系統として「赤神力」及び「カシマムギ」の計3品種を用いた。植物材料としては、前記3品種のそれぞれについて、開花後3週間程度の未熟種子より胚を採取して使用した。遺伝子の単離は、下記の手順に従い、各品種について調製したcDNAを用いてブラシノステロイド受容体をコードすると思われるcDNAの部分断片を単離し、その部分断片を利用して全長cDNAを単離することによって行った。
【0067】
まず、ミサトゴールデンの種子胚から、CTAB法(Chang et al. Plant Mol. Biol. Rep. 11, 113-116 (1993))を用いて全RNAを抽出し、Dynabeads Olygo (dT)25 resin (Dynal)によりmRNAを精製した。このmRNAを鋳型として、Marathon cDNA Amplification Kit(Clontech)の使用説明書に従って逆転写反応を行い、cDNAを調製した。次いで調製したcDNAを鋳型として、既知のブラシノステロイド受容体の保存配列に対して設計した縮重プライマー(5'-縮重プライマー:5'-AARTGYACIAAIYTIAAYTGGAT-3'/配列番号7、3'-縮重プライマー1:5'-ARIGGYTTYTCRAAIGCIGC-3'/配列番号8)を合成して用いて、PCRを行った。PCR反応はTaq DNA polymerase(GibcoBRL)とその添付バッファーを用い、説明書に従って反応溶液を調製した。PCR反応は、10 ng相当のmRNA由来のcDNA、25 pmolの各プライマーと2.5 unitのTaq DNA polymeraseを含む終濃度1x PCR buffer(20 mM Tris-Cl pH8.4、50 mM KCl(Taq DNA polymeraseに添付))、0.2 mMのdNTPs、1.5 mMのMgCl2の反応液 20μl中で行った。温度サイクルは以下の通りである。94℃30秒の熱変性の後、熱変性を94℃30秒、アニーリングを50℃1分、伸長反応を72℃ 1.5分の反応を5サイクル、次いで、熱変性を94℃ 30秒、アニーリングを45℃ 1分、伸長反応を72℃ 1.5分の反応を5サイクル、さらに、熱変性を94℃ 30秒、アニーリングを40℃ 1分、伸長反応を72℃ 1.5分の反応を25サイクルの反応を行った。得られたPCR断片を鋳型として、増幅断片の内側の異なる保存配列に対して設計した縮重プライマー(3'-縮重プライマー2:5'-ARISWRAAIARIARICCCATIGC-3'/配列番号9)と配列番号:5のプライマーを用いてnestid-PCRを行い、得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により確認したところ、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子の塩基配列から予想されるサイズに対応する875bpのDNA断片が得られた。次いでこのDNA断片をクローニングし、塩基配列を決定した。
【0068】
次に、全長cDNAを単離するため、得られたDNA断片の塩基配列を基に遺伝子特異的プライマーを調製し、これらプライマーを用いてRACEを行った。上記と同様にしてミサトゴールデンの種子胚より調製した全mRNAを用いて、5'及び3'末端にアダプターを付加したcDNAを調製し(Marathon cDNA Amplification Kit, Clontechを使用説明書に従って使用)、RACEのための鋳型とした。また、RACE反応は、Advantage2 PCR kit(Clontech)を用いてその説明書に従って行った。5'-RACE及びnestid-PCRには、遺伝子特異的プライマー(アンチセンスプライマー1:5'-TCATCTTCCCCGACTGCTCTGCCA-3'/配列番号10、アンチセンスプライマー2:5'-TTGAGGGCGGTGAGCGAGGTGAG-3'/配列番号11、 アンチセンスプライマー3:5'-TCTCCGGCGATCTTGTTGCTGGAC-3'/配列番号12)及びアダプタープライマーAP1(5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(Marathon cDNA Amplification Kit, Clontech)/配列番号13)を用いた。3'-RACEには、遺伝子特異的プライマー(センスプライマー:5'-TGGCAGAGCAGTCGGGGAAGATGA-3'/配列番号14)及び前記のアダプタープライマーAP1(配列番号13)を用いた。続いて、このようにしてRACEにより得られた増幅断片を塩基配列決定した。
【0069】
上記の方法により、ミサトゴールデンにおいてブラシノステロイド受容体をコードすると推定される遺伝子のcDNA全長の塩基配列が明らかになった。さらにこの塩基配列を確実なものにするために、5'側の非翻訳領域に対して設計した遺伝子特異的プライマー(5'-CGCTTCTCGCATGGTCTCAAGGTAG-3'/配列番号15)及び3'の非翻訳領域に対する遺伝子特異的プライマー(5'-AGCTTGCGTGGGAACCTCAGAATG-3'/配列番号16)を合成し、これらプライマーを用いてミサトゴールデンcDNAを鋳型としPyrobest DNA polymerase(TaKaRa)によるhigh fidelity PCRを行った。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(TaKaRa)を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りで行った。PCR反応の温度サイクルは、変性98℃ 10秒、アニーリングおよび伸長反応72℃ 4分を5サイクル、次いで変性98℃ 10秒、アニーリングおよび伸長反応70℃ 4分を25サイクル行った。このようにして増幅された遺伝子断片(3,558 bp)をpCR4 Blunt-TOPO ベクター(Invitrogen)中にクローニングし、5クローンについて塩基配列の決定を行い、増幅遺伝子断片について全ての塩基配列が一致することを確認した。このようにして得られた塩基配列(ミサトゴールデンのブラシノステロイド受容体をコードすると思われる遺伝子の配列)を、配列番号3として示す。さらにこの遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を、配列番号4として示す。この推定アミノ酸配列(配列番号4)を、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体のアミノ酸配列(アクセッション番号:シロイヌナズナについてはDDBJ:AF017056、Genbank:AAC49810、イネについてはDDBJ:AP003453、Genbank:BAB68053)と比較したところ、それらは高度の相同性(イネとの間で82.3%の同一性)を示し、かつ、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子に見出される特徴的なドメインを全て含んでいた(図1)。すなわち、オオムギの並性系統のミサトゴールデンから得られた配列番号3に示される塩基配列を有する遺伝子は、シロイヌナズナ及びイネで報告されているブラシノステロイド受容体遺伝子の相同遺伝子であることが示された。本発明者らは、このようにして単離したオオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子を、HvBRI1と名付けた。
【0070】
なお、PCR断片の塩基配列決定は、自動シークエンシングシステム(ABI373A及びABI3100Avant, Applied Biosystems)を用いたジデオキシヌクレオチド・チェーン・ターミネーション法により行った。また、配列の解析は、GENETYXコンピューターソフトウェア(Software Kaihatu Co.、日本)を用いて実施した。
【0071】
続いて、「赤神力」及び「カシマムギ」の渦性系統について、上記のようにして得たブラシノライド受容体相同遺伝子(HvBRI1)を単離し、その塩基配列を決定した。すなわち、上述のミサトゴールデンと同様の方法で赤神力及びカシマムギの未熟種子の胚よりそれぞれcDNAを調製し、得られたcDNAを鋳型としてブラシノステロイド受容体相同遺伝子の5'及び3'非翻訳領域に対する遺伝子特異的プライマー(配列番号15及び16)を用いてhigh fidelity PCRを行い(反応条件はミサトゴールデンの場合と同じである)、得られたPCR産物の塩基配列を決定した。この塩基配列の決定は、ミサトゴールデンと同様に各5クローンについて行い、赤神力とカシマムギのそれぞれについて各クローンの塩基配列が全て一致することを確認した。さらにこれらの塩基配列は、赤神力とカシマムギの間でも完全に一致していた。このようにして決定された赤神力及びカシマムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子の塩基配列を、配列番号5として示す。さらにこの遺伝子の推定アミノ酸配列を、配列番号6として示す。
【0072】
続いて、ミサトゴールデン(並性系統)と赤神力及びカシマムギ(渦性系統)との間で、上記のようにして決定されたブラシノステロイド受容体相同遺伝子の塩基配列と推定アミノ酸配列について比較した。まず、決定された塩基配列長、すなわち、PCRでの増幅断片長は両者間で完全に一致していた。一方、比較した両者の塩基配列は、2612番目の位置に1塩基の違いが認められた。すなわち2612番目の塩基は、ミサトゴールデンでアデニンであったのに対し、赤神力及びカシマムギではグアニンであった(配列番号3及び5の塩基番号2612を参照)。さらにこの1塩基の違いは、配列番号3及び5に示される塩基配列とそれに対応したアミノ酸配列からも分かるように、推定アミノ酸配列において1アミノ酸変異を引き起こすことが判明した。すなわち、ミサトゴールデンではヒスチジンである857番目のアミノ酸が、赤神力及びカシマムギではアルギニンに変異していた(配列番号4及び6のアミノ酸番号857を参照)。なお、この推定アミノ酸配列の857番目以外のアミノ酸は、ミサトゴールデン(並性系統)と赤神力及びカシマムギ(渦性系統)との間で完全に一致していた(図2)。以上の解析から、オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子に存在する遺伝子配列の変異によって引き起こされる857番目のアミノ酸(配列番号4及び6で示されるアミノ酸配列の857番目のアミノ酸)のヒスチジンからアルギニンへの変異が、渦性の原因となっている可能性が示された。すなわち、857番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの変異を引き起こす遺伝子変異を有するブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体が、渦遺伝子本体である可能性が示された。
【0073】
さらに、このオオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子における1アミノ酸変異を、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド感受性変異体の原因遺伝子として報告されているブラシノステロイド受容体遺伝子変異体における変異と比較した。本発明における1アミノ酸変異は、857番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの変異であり、この変異部位は、既知タンパク質リン酸化酵素との比較からタンパク質リン酸化酵素の保存ドメインIVと推定される領域中に存在していた(図1)。一方、シロイヌナズナのブラシノステロイド受容体遺伝子変異体において報告されている変異は、611番目のアミノ酸のグリシンからグルタミン酸への変異であり(特許文献1及び非特許文献6)、この変異部位は、21番目と22番目のロイシンリッチリピートの間に存在する77アミノ酸領域中に存在していた(図1)。それ以外にもシロイヌナズナのbri1変異体アレルについては報告されているが、今回オオムギにおいて明らかにされた変異は、それらシロイヌナズナの変異とは異なるものであった(Plant Physiol. 1999, Vol.121, pp743-752)。またイネのブラシノステロイド受容体遺伝子変異体において報告されている変異は、989番目のアミノ酸のトレオニンからイソロイシンへの変異、及び491番目のアミノ酸のバリンからメチオニンへの変異であり、これらの変異部位は、既知タンパク質との比較から、タンパク質リン酸化酵素ドメインのサブドメインIXと推定される領域中、及び17番目のロイシンリッチリピートと推定される領域中にそれぞれ存在していた。このように、オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子における並性系統と渦性系統の間の1アミノ酸変異は、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子変異体において報告されているいずれの変異とも異なるものであった。
【0074】
[実施例2] ブラシノステロイド受容体相同遺伝子(HvBRI1)における一塩基の違い(2612A→GのSNP)を直接検出できるdCAPSマーカーの開発
実施例1で見出された並性系統と渦性系統との間のブラシノステロイド受容体相同遺伝子における一塩基の違い(2612A→GのSNP)を簡便に検出できる分子マーカーの開発を試みた。
【0075】
まず、配列番号1で示される塩基配列に基づいて、並性系統と渦性系統との間で見出されたSNP部位(2612A→G)の1塩基上流までを含む28塩基長の配列からdCAPSプライマー1(5'-GAAATGGAGACCATTGGCAAGATCAAGC-3'/配列番号:17)を、該SNP部位の約250bp下流の24塩基長の配列からdCAPSプライマー2(5'-CCTTGCCTCCAGATTCTCATCAAC-3'/配列番号:18)をそれぞれ設計した。dCAPSプライマー1の配列については、配列番号1で示される塩基配列においてSNP部位(2612A→G)の2塩基上流の位置に当たるアデニンをグアニンに変更した。dCAPSプライマー1及び2の塩基配列及びSNP部位(2612A→G)との位置関係を、図3に示す。このようなdCAPSプライマー1及び2を用いて、オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子の部分断片を増幅すれば、2611~2613番目の塩基配列が「CGC」である場合(渦性系統)には、dCAPSプライマーの3'側の2塩基(GC)とそれに連続する塩基配列(GC)とで制限酵素Hha Iの認識部位(GCGC)が出来るはずである(図3)。
【0076】
次いで、オオムギ栽培品種「はるな二条」と野生オオムギ「ssp. spontaneum (OUH602)」の2種の並性系統、および、オオムギ栽培品種「赤神力」の1種の渦性系統について、CTAB法でゲノムDNAを調製し、それを鋳型としてdCAPSプライマー1及び2を用いるPCRを行った。PCR反応は、Ex TaqTM(TaKaRa)を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りに行った。PCR反応の温度サイクルは、94℃2分の後,変性94℃ 30秒、アニーリング60℃ 30秒、および伸長反応72℃ 1分を35サイクルである。このようにして得られた増幅断片を含むPCR反応液10μlを、2 unitのHha I を含む1x制限酵素バッファー中で1時間かけて切断した。制限酵素の反応液組成は用いた制限酵素に添付される説明書通りである。さらに、制限酵素処理を行った反応液を、0.5xTBEを含む7%アクリルアミドゲル、または、3% Metaphor(FMC BioProducts, Rockland, ME)アガロースゲルで電気泳動した。
【0077】
その結果、はるな二条およびssp. spontaneum (OUH602)の並性系統由来のDNA試料については約290 bpのバンドが観察されるのに対し、赤神力の渦性系統由来のDNA試料については、約260 bpのバンドが検出された(図4)。これらのバンドサイズは、配列番号3及び5で示される塩基配列からそれぞれ予想されるバンドサイズの294 bp及び265 bpと正確に一致していた。この結果は、並性系統について観察される約290 bpの増幅断片が、Hha I処理により消化されてdCAPSプライマーの一部分が失われることにより、渦性系統についてはサイズがより小さい増幅断片となったことを示す。このように、開発したdCAPSプライマー1及び2を用いて、PCR増幅とその増幅断片のHha Iによる制限消化とを行うことにより、並性系統と渦性系統の間のブラシノステロイド受容体相同遺伝子における一塩基の違い(SNP)を簡便に検出できることが示された。
【0078】
[実施例3] 遺伝学的解析による渦遺伝子の確認
実施例1において渦性系統から単離した2612A→GのSNPを有するHvBRI1変異体が、渦遺伝子本体であることを遺伝学的に確認することにより、渦遺伝子を特定するため、渦性系統の分離集団に対し、実施例2で開発したdCAPSマーカーを用いてHvBRI1変異体中に見出したSNPをマッピングした。マッピングには、赤神力(渦性系統)及び野生オオムギssp. spontaneum (OUH602;並性系統)を両親とするF2集団120個体を用いた。この120個体全てについて、実施例2で開発したdCAPSマーカーを用いてジェノタイピングを行った結果、HvBRI1変異体中に見出したSNPの2612Gをホモで持つ個体の分離は渦性を示す個体の分離と完全に一致しており、ssp. spontaneum 型/ヘテロ型/「赤神力」型の分離は、1 : 2 : 1となり、渦遺伝子が単因子劣性の遺伝様式を示すことと合致した。この結果から、実施例1において赤神力及びカシマムギから単離した2612A→GのSNPを有するHvBRI1変異体は、渦遺伝子本体であることが遺伝学的に証明された。従って、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子(HvBRI1)における一塩基の違い(2612A→GのSNP)を検出すれば、渦遺伝子を直接検出できることが示された。この2612A→GのSNPの検出には、実施例2で開発したdCAPSマーカーを有利に使用できると考えられる。
【0079】
[実施例4] オオムギの各種栽培品種由来の核酸試料における、dCAPSマーカーを用いたオオムギ渦遺伝子の有無の判定
実施例2及び3により、dCAPSマーカーによって渦遺伝子を直接検出できることが示されたことに基づいて、オオムギの他の渦性系統でも、赤神力及びカシマムギで見出された渦遺伝子を共通して検出できるかどうかを試験した。用いた栽培品種は、「清源在来(Cheongweon Native);皮性、秋播型、韓国」「青麦(Aomugi);裸性、春播型、韓国」「谷風(Tanikaze);皮性、春播型、日本」「関取(Sekitori);皮性、秋播型、日本」「コビンカタギ(Kobinkatagi);裸性、秋播型、日本」のそれぞれの渦性系統である。これらの品種は、例えば、種子外皮のタイプ(皮性であるか裸性であるか)、春化処理の必要性の程度(秋播型であるか春播型であるか)及び採集地(日本であるか韓国であるか)の点で、それぞれがかなり異なる表現型を有している。
【0080】
dCAPSマーカーを用いた渦遺伝子の検出は、実施例2に記載したのと同様の方法に従って行った。すなわち、各品種の種子胚から調製した鋳型DNAに対して、dCAPSプライマー1及び2を用いるPCR増幅を行って増幅断片を得た。次いでその試料を2つに分け、一方は制限酵素で無処理の対照試料とし、もう一方はHha Iを用いて制限消化した検出試料とした。続いて、これらの試料をアガロースゲル電気泳動にかけた。このようにして得られた電気泳動の結果を図5に示す。図中、「M」は分子量マーカーφX174 Hae III、「-」はHha Iで無処理の対照試料、「+」はHha Iにより制限消化した検出試料をロードしたレーンであることを表す。
【0081】
図5に示される通り、使用したどの品種においても、対照試料では294 bp、検出試料では265 bpに相当するバンドが観察された。この結果から、これらのオオムギ品種由来の核酸試料について、dCAPSマーカーを用いてブラシノステロイド受容体相同遺伝子(HvBRI1)変異体の2612A→GのSNPを検出することにより、渦遺伝子を直接検出し、それによりその核酸試料中に渦遺伝子が存在するかどうか(渦遺伝子の有無)を判定できることが示された。さらに、上記のように表現型が大きく異なる渦性系統間において、渦遺伝子が共通して検出されたことから、これらのオオムギ品種は、渦性の原因遺伝子として共通して渦遺伝子を保持していることが示された。すなわち、以上のような方法により、オオムギ由来の核酸試料中に渦遺伝子が存在するか否か(渦遺伝子の有無)を判定して、渦遺伝子がホモ接合体で存在すると判定されれば、そのオオムギを渦性品種として識別できることが示された。
【0082】
【発明の効果】
本発明において、多収をもたらす矮性遺伝子としての渦遺伝子が、特定の1アミノ酸変異を有するブラシノステロイド受容体遺伝子変異体であることが明らかになった。本発明の渦遺伝子の有無を判定する方法、例えばdCAPSマーカーを用いる方法を使用すれば、遺伝的にヘテロな植物体(F1植物など)における渦遺伝子の存在を確実に判定することができるため、その判定結果に基づいてヘテロ接合体植物を育種親として選択し、その育種親を自家交配することにより、渦性品種(ホモ接合体)を効率良く確実に作出することが可能となる。また、ホモ接合体植物においては、任意の植物試料について渦遺伝子の存在を確実に判定することができるため、任意の生長段階で渦性品種か否かを識別することが可能となる。このように、本発明の方法は、多収遺伝子としての渦遺伝子の導入を目的とした育種において、渦遺伝子系統の確実かつ簡便な選抜が可能となるため、育種工程の効率化が図れ、非常に有用である。また、本発明において提供する配列番号5で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその部分配列を有するポリヌクレオチドは、上記の渦遺伝子の有無を判定する方法においてプローブ又はプライマーとして用いることにより、渦遺伝子を特異的に検出できる点で、大変有用である。特に、配列番号5で示される塩基配列の2611番目の塩基位置を3'末端とする部分配列について2610番目の位置の塩基をグアニンに変更した配列からなるポリヌクレオチドは、制限酵素Hha Iを使用した簡便な渦遺伝子の有無の判定方法において有効なプライマーとして用いることができる。さらに、本発明における渦遺伝子の有無を判定するためのキットは、渦性品種の識別方法及び渦性品種の育種方法を効率的に実施する上で、特に有用なツールとして使用することができる。
【0083】
【配列表】
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【配列表フリーテキスト】
配列番号7~18の配列は、合成DNAである。
【0085】
配列番号7~9の配列中の「n」は、イノシンである。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、シロイヌナズナ(AtBRI1)、イネ(OsBRI1)、オオムギ(HvBRI1)のブラシノステロイド受容体のアミノ酸配列をアライメントした図である。I~XIまでのローマ数字は、タンパク質リン酸化酵素の各保存ドメインを示している。
【図2】図2は、オオムギのブラシノステロイド受容体のアミノ酸配列を、ミサトゴールデン(並性系統)並びに赤神力及びカシマムギ(渦性系統)の間でアライメントした図である。矢印は、渦性系統における変異(857His→Arg)部位を示す。
【図3】図3は、dCAPSマーカーと2612A→GのSNP部位の配列番号1で示される塩基配列上の位置関係を示す図である。「uzu」は赤神力及びカシマムギ(渦性系統)から得られる渦遺伝子を、「normal」はミサトゴールデン(並性系統)から得られる野生型遺伝子を表す。囲い枠は、857His→Argの変異に対応するコドンを示す。枠の中に太字で示した「A」及び「G」が変異部位の塩基を示している。
【図4】図4は、dCAPSマーカーを利用して並性系統と渦性系統を識別した電気泳動結果を示す図である。
【図5】図5は、dCAPSマーカーを利用して渦性系統5品種を識別した電気泳動結果を示す図である。
図面
【図1】
0
【図2】
1
【図3】
2
【図4】
3
【図5】
4