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明細書 :核酸/多糖/カーボンナノチューブ複合体

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第4878915号 (P4878915)
公開番号 特開2007-314452 (P2007-314452A)
登録日 平成23年12月9日(2011.12.9)
発行日 平成24年2月15日(2012.2.15)
公開日 平成19年12月6日(2007.12.6)
発明の名称または考案の名称 核酸/多糖/カーボンナノチューブ複合体
国際特許分類 A61K  48/00        (2006.01)
A61K  31/7105      (2006.01)
A61K  31/711       (2006.01)
A61K  47/36        (2006.01)
A61K  47/04        (2006.01)
FI A61K 48/00
A61K 31/7105
A61K 31/711
A61K 47/36
A61K 47/04
請求項の数または発明の数 3
全頁数 9
出願番号 特願2006-144929 (P2006-144929)
出願日 平成18年5月25日(2006.5.25)
審査請求日 平成21年4月7日(2009.4.7)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】503360115
【氏名又は名称】独立行政法人科学技術振興機構
【識別番号】501190941
【氏名又は名称】三井製糖株式会社
発明者または考案者 【氏名】新海 征治
【氏名】沼田 宗典
【氏名】広瀬 良治
【氏名】櫻井 和朗
個別代理人の代理人 【識別番号】100087675、【弁理士】、【氏名又は名称】筒井 知
審査官 【審査官】横井 宏理
参考文献・文献 国際公開第01/034207(WO,A1)
特開2005-104762(JP,A)
国際公開第2005/108482(WO,A1)
沼田宗典,多糖・β-1,3-グルカンを1次元ホストとして利用したバイオナノマテリアルの創製,日本化学会生体機能関連化学部会News Letter,2005年12月 8日,Vol.20, No.3,p.10-13
SAKURAI, K., et al.,Molecular Recognition of Adenine, Cytosine, and Uracil in a Single Stranded RNA by a Natural Polysaccharide: Schizophyllan,J. Am. Chem. Soc.,2000年 5月10日,Vol.122, No.18,p.4520-4521
MIZU, M., et al.,A Polysaccharide Carrier for Immunostimulatory CpG DNAs To Enhance Cytokine Secetion,J. Am. Chem. Soc.,2004年 7月14日,Vol.126, No.27,p.8372-8373
NUMATA, M., et al.,Inclusion of Cut and As-Grown Single-Walled Carbon Nanotubes in the Helical Superstructure of Schizophyllan and Curdlan (β-1,3-Glucans),J. Am. Chem. Soc.,2005年 4月27日,Vol.127, No.16,p.5875-5884
SAKURAI, K., et al.,β-1,3-Glucan polysaccharides as novel one-dimensional hosts for DNA/RNA, conjugated polymers and nanoparticles,Chem. Commun.,2005年 9月21日,No.35,p.4383-4398
調査した分野 A61K 48/00
A61K 31/00-711
A61K 47/00-36
CA/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN)
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII)
特許請求の範囲 【請求項1】
核酸/多糖/カーボンナノチューブから成る3元複合体であって、多糖が、シゾフィラン、スクレログルカンまたはレンチナンから選ばれるβ-1,3-グルカンであり、核酸の水溶液に水および極性溶媒を加え、これに多糖の極性溶媒溶液を加えることにより多糖と核酸を複合化し、次に、カーボンナノチューブの水分散液を加えることによって調製されることを特徴とする3元複合体。
【請求項2】
核酸が、アンチセンスDNA、CpG DNA、およびRNAから選らばれたものであることを特徴とする請求項1に記載の複合体。
【請求項3】
核酸がdAテールを有するものであることを特徴とする請求項2に記載の複合体。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
本発明は、カーボンナノチューブを用いる技術分野に属し、特に、核酸を細胞内に効率よく送達して細胞内での核酸の放出制御等に利用できる新規な複合体に関するものである。
【背景技術】
【0002】
カーボンナノチューブは、その優れた機能からバイオテクノロジーにおいても中核を担う機能性材料として注目されている。しかしながら、ナノチューブ間での凝集性が極めて強く、水溶液としての取り扱いが困難であること、生体に対する安全性などから、実用化には各種の問題を解決する必要が有る。
【0003】
カーボンナノチューブ、特に単層カーボンナノチューブ(SWNT)を薬物送達システム(DDS:ドラッグデリバリーシステム)に使用する研究が進められている。例えば、ダイらはビオチン化したSWNTと蛍光化したストレプトアビジンとの複合体を人の細胞に導入し、蛋白のDDSにSWNTが有効であることを示した(非特許文献1)。さらに、Cy3-ラベル化したSWNTの外壁に核酸を吸着によってコンジュゲートしたものを癌細胞へ選択的に送達し、近赤外領域のレーザー光を照射することによってSWNTを加熱し、癌細胞を破壊する可能性を示した(非特許文献2)。そのほか、小腸ターゲットタイプの経口DDS製剤の構成成分として単層・多層カーボンナノチューブの使用が提案されている(特許文献1)。

【非特許文献1】Nadine WongShi Kam, Theodore C. Jessop, Paul A. Wender, and Hongje Dai; J. Am. Chem. Soc.,2004, 126, 6850-6851
【非特許文献2】Nadine WongShi Kam, Michael O’Connel, JeffreyA. Wisdom, and Hongje Dai ; PNAS, 2005, vol.102, no. 33, 11600-11605
【特許文献1】特開2005-281231号公報
【0004】
本発明者らは、天然多糖のβ-1,3-グルカンが各種高分子物質に対するのと同様に、SWNTに対しても1次元ホストとして働き、水溶性のナノコンポジットを形成することを見出している(非特許文献3、特許文献2)。得られる複合体は、天然多糖に由来する生体適合性とともに、SWNTのπ電子系に本来備わっている機能をも保持し、新規バイオナノマテリアルとしての応用が期待されている。また、既に本発明者らは、β-1,3-グルカンが核酸と複合体を形成してアンチセンスDNA、CpGDNA等の有効なキャリアーとなることを見出している(非特許文献4、非特許文献5、特許文献3)。

【非特許文献3】MunenoriNumata, Masayoshi Asai, Kenji Kaneko, Teruaki Hasegawa, Kazuo Sakurai, andSeiji Shinkai; J. Am. Chem. Soc.,2005,127, 5875-5884
【特許文献2】特開2005-104762号公報
【非特許文献4】Kazuo Sakuraiand S.Shinkai; J. Am. Chem. Soc., 2000,122, 4520-4521.
【非特許文献5】Masami Mizu,Kazuya Koumoto, Takahisa Anada, Takahiro Matsumoto, Munenori Numata, SeijiShinkai, Takeshi Nagasaki, Kazuo Sakurai; J. Am. Chem. Soc., 2004, 126,8372-8373
【特許文献3】再表01-034207号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
核酸等の細胞内への送達とリリースを制御して医療等の開発に資する新しいシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
核酸/多糖/カーボンナノチューブから成る新規な3元複合体による。
【発明の効果】
【0007】
本発明の複合体は、核酸をスムースに細胞内へ導入するとともに、導入後に近赤外線を照射することにより核酸のリリースを制御することが可能となる(図1に概念図を示す)。
【発明を実施するための最良の形態】
【0008】
本発明は、β-1,3-グルカンに代表される多糖を含む非共有結合性の核酸/多糖/カーボンナノチューブの3元複合体を形成させることにより、夫々の成分の特性を生かした新規な核酸の送達システムを提供するものである。以下、本システムを実施するための最良の形態を記述する。
【0009】
これまでβ-1、3-グルカン等との複合化が確認されている各種の核酸を、本発明の3元複合体の調製に使用可能である。核酸としてはアンチセンス核酸やCpGモチーフを有する核酸、RNAi核酸などが挙げられる。そして、これらの核酸は、一般に、40mer程度のdAテールを末端に修飾し、これにより、3元系複合体に、好適に取り込むことが可能である。
【0010】
本発明の複合体を形成するのに特に好適な多糖はβ-1、3-グルカンである。β-1、3-グルカンの核酸との複合化能は分子量に依存し、核酸と安定な複合体を形成する分子量範囲(1本鎖あたり約2000以上の平均分子量)のβ-1、3-グルカンを用いる必要がある。
【0011】
β-1,3-グルカンのうち、シゾフィラン(SPG)、スクレログルカン、レンチナンなどの水溶性β-1、3-グルカンは特に好ましい。さらに、これらの天然多糖は側鎖のグルコースを利用し、あるいはカードランの6位の水酸基を利用し、様々の官能基を導入することが出来る。そのようなβ-1、3-グルカンの化学修飾体を用いることによって得られる3元系複合体のバイオマテリアルとしての機能が格段に向上する。例えば、葉酸を修飾することにより、がん細胞への特異的な輸送システムを確立することも可能となる。
【0012】
本発明の複合体を形成するカーボンナノチューブとしては単層カーボンナノチューブ(SWNT)が好適であるが、本発明の原理は、多層カーボンナノチューブにも適用され得るものである。
【0013】
複合体の調製手順、つまり3つのコンポーネントをどの順番で混合するかは3元複合体を形成させる際に極めて重要な要素となる。例えば、多糖としてSPG、核酸、カーボンナノチューブとしてSWNTの3成分の場合、次の組み合わせが考えられうる。
1) (SPG+核酸)調製後にSWNTを混合、
2) (SPG+SWNT)調製後に核酸を混合、
3) (SWNT+核酸)調製後にSPGを混合、
これらの三つの方法の中で1)の調製法でのみ3元複合体を調製することができる。つまり、3元複合体の形成には多糖と核酸をまず相互作用(複合化)させ、直後にカーボンナノチューブを加える必要がある。より具体的には、核酸の水溶液に水および極性溶媒(例えばDMSO:ジメチルスルホキシド)を加え、これに多糖の極性溶媒(例えばDMSO)溶液を加えることにより多糖と核酸を複合化し、次に、カーボンナノチューブの水分散液を加える。
【0014】
例えば、核酸にpoly(dA) 60μgおよび 多糖にSPG 300μgを用い、SWNTを40μg以上用いた場合のCDスペクトルによる複合体の確認(後述の実施例参照)から、全ての核酸/SPGコンジュゲート体がSWNT上に複合化・固定されていることが示されている。核酸、SPGおよびSWNTのこの比率は、好適な例である。
【0015】
本発明の複合体を用いれば、特定のがん組織に複合体を集積させ、適切な光量の近赤外線を適切なタイミングで照射することにより、核酸医薬の発現や持続時間を自在にコントロールすることが可能となる。特に、近赤外線は人体に無害であるだけでなく高い組織透過性を有している。このため、近赤外線の照射は皮膚表面から行うことが可能であり、従来の光学治療法と異なって患部を切開する必要が無いという特徴を併せ持つことになる。
【実施例1】
【0016】
3元複合体の調製 表1の比率に従い、サンプルaおよびbを調製した。SWNTは、Carbon nanotechnotolies, USAより入手した単層カーボンナノチューブをあらかじめ酸処理することによって1μmL程度に切断し、水に安定化分散させたもの(c-SWNTと記述)を用いた。核酸は、Amersham
Biosciencesより入手した、poly(C)〔Polycytidylic acid, Lot No 3014220021〕(分子量約10万)およびpoly(dA)〔Polydeoxyadenylic
acid, Lot No GD0056〕(分子量約10万)を用いた。複合体の形成は、これまでSPGがSWNTあるいは核酸と複合化することが知られている条件(非特許文献4および非特許文献6)に従って行った。まず、核酸の水溶液に水およびDMSOを加え、さらにSPG(1本鎖当たりの平均分子量15万)のDMSO溶液を添加した。その後にSWNTの水分散液を加え、得られた溶液を4℃にて2日間静置した。SWNTの割合を変えた2種類サンプルを調製したが、SWNTを含まないサンプル(poly(dA)/SPG)およびSPGを含まないサンプル(poly(dA)/SWNT)も同様に調製した。
<nplcit num="6"> <text>MunenoriNumata, Masayoshi Asai, Kenji Kaneko, Teruaki Hasegawa, Norifumi Fujita, YumikoKitada, Kazuo Sakurai, Seiji Shinkai;Chem. Lett., 2004, 33, 232.</text></nplcit>
【0017】
【表1】
JP0004878915B2_000002t.gif

【実施例2】
【0018】
CDスペクトルによる複合体の熱的安定性の評価 実施例1で調製した複合体の形成とその熱的な安定性をCDスペクトルにより評価した。各サンプルのCDスペクトルの温度依存性を図2に、255nmのCD強度を温度に対してプロットした結果を図3に夫々まとめて示した。図2a,bより、c-SWNT存在下で調製した複合体においてもpoly(dA)に由来するCD強度の増加が確認され、SPGはpoly(dA)と複合体を形成していることが示された。また図3より、Tm値はpoly(dA)/SPG複合体(サンプルd)と比較して5℃程上昇していることが分かる。このことはc-SWNTがpoly(dA)/SPG複合体と何らかの相互作用をしていることを示し、目的とする3元複合体の形成が確認された。SWNTの存在比を変化させたサンプル間に特に違いは認められていない。さらに、SPGを含まない場合のc-SWNTとpoly(dA)との混合溶液(サンプルc)のCD波形はpoly(dA)のみの場合と同じであり、c-SWNTとpoly(dA)だけでは両者間に相互作用は存在しないことが認められる。また、図3のTm曲線から、約65℃以上で複合体が解離していることが認められた。
【実施例3】
【0019】
AFMによる複合体の構造評価 CDスペクトルによる評価の結果、poly(dA)/SPG/SWNT3元複合体は温度の上昇に伴い核酸のみを協同的に解離、放出していることが示されている。そこで、温度変化に伴う複合体のモルフォロジー変化をAFMにより評価した。実施例1で調製したサンプル1aについて5℃および65℃(核酸を解離、放出した状態)のモルフォロジーをAFMにより観察した結果を図4に示す。いずれの温度においてもSWNT表面にシゾフィランが存在している様子がわかる。さらにSPG/SWNT複合体のみと異なり表面にpoly(dA)/SPG複合体と考えられるファイバーが枝分かれ状に存在している様子も確認できる。通常のSPG/SWNT複合体とは表面の形態が明らかに異なっており、このことから核酸/SPG/SWNTの3元複合体の形成が確かめられた。また、65℃でのサンプルにおいてもSWNT表面に依然シゾフィランが存在しており、CDスペクトルの結果と合わせて考えると、加熱によって複合体から核酸のみが解離していることが認められる。
【実施例4】
【0020】
複合体の電子スペクトル 実施例1で調製したSample No. aの複合体溶液のスペクトルを、セル長1.0cm、室温で測定した。結果は図5に示したように、約800nm超の近赤外領域にSWNTによる吸収が確かめられた。
【実施例5】
【0021】
複合体の細胞導入 シゾフィランをFITC(Fluorescein isothiocianate)で、c-SWNTをローダミンでラベル化し、各生成物(FITC-SPGと Rh-SWNT)を用いて実施例1と同様の方法により調製した複合体のマクロファージへの取り込みを共焦点レーザー顕微鏡を用いて評価した。さらに、FITC-SPGとローダミンラベルしたオリゴ(dA)(Rh-dA)を組み合わせた複合体サンプルも調製し、核酸が細胞内にとりこまれているか否かの評価も同時に行った。複合体の形成は表2の比率に従い行った。
【0022】
【表2】
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【0023】
表2に従い調製した溶液の限外濾過(マイクロコンMWCO=3000、8000rpm, 60min, 5℃)を行い、溶液を約200μlにまで濃縮した。また、この過程を繰り返すことで溶媒を水へと置き換えた。得られた水溶液を20μl分取、ここに培地180μlを加え約10倍に希釈した。次に、予め37℃にてインキュベートした細胞(マクロファージ J774)から慎重に培地を抜き取り、調製した溶液200μlと置き換えた。ディッシュを37℃で2時間インキュベートした。蛍光顕微鏡にて細胞の状態を確認した後、溶液をディッシュから慎重に抜き取り、培地でよく洗浄した。その後、5%ホルムアルデヒド水溶液を加え4℃で20分インキュベートすることで細胞の固定化を行った。
共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を図6に示す。図6AよりFITC励起(488nm)によって得られた蛍光像、ローダミン励起(543nm)によって得られた蛍光像は共に細胞の透過光像とよく一致することが分かる。さらに、両方の蛍光像の発光もよく一致していることが見て取れる。これらの結果は、SPGとSWNTが複合体を形成したまま細胞に取り込まれていることを示している。
また、図6BよりdAをローダミンでラベルしたサンプルbについてもFITCとローダミンの蛍光像が完全に一致していることがわかる。これはSPGと核酸も複合体を形成した状態で細胞内に取り込まれていることを示している。一方、データは省略したが、SPGを含まないSWNTとRh-dAの混合物(サンプルc)では細胞からの蛍光イメージを得ることは出来なかった。これは、oligo(dA)の細胞内への取り込みが起こっていないことを示している。
以上の結果よりPoly(dA)/SPG/SWNTからなる3元複合体は複合体を維持したままマクロファージに取り込まれていることが示された。これらの結果は3元複合体がCpG DNAやアンチセンスDNAのデリバリーに応用できる能力を有していることを意味する。
【産業上の利用可能性】
【0024】
本発明の複合体は、生体に安全な天然多糖であるβ-1,3-グルカンを中核とする核酸/多糖/カーボンナノチューブの3元複合体であり、例えば、細胞へのスムースな導入と細胞内での近赤外線照射等による核酸のリリースが可能となるため、新タイプの核酸薬物デリバリーのキャリアーとして利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】核酸/β-1,3-グルカン/SWNTからなる3元複合体を利用した核酸デリバリーシステムの概念図。
【図2】CDスペクトルの温度依存性:5°C-75°C, 1.0cm cell(a, b:poly(dA)/SPG/SWNT複合体、c:poly(dA)/SWNT, d:poly(dA)/SPG複合体)。
【図3】各サンプルの255nmにおけるTm曲線。
【図4】poly(C)/SPG/SWNT3元複合体のAFM像、a, b:5℃、c :65℃におけるAFM像。
【図5】サンプルaの電子スペクトル図。
【図6A】Sマクロファージを用いた複合体(dA/FITC-SPG/Rh-SWNT)の細胞導入実験、共焦点レーザー顕微鏡観察の結果:蛍光像(左)と透過像との重ね合わせ(右)、上段488nm励起、下段543nm励起。
【図6B】マクロファージを用いた複合体(Rh-dA/FITC-SPG/c-SWNT)の細胞導入実験、共焦点レーザー顕微鏡観察の結果:蛍光像(左)と透過像との重ね合わせ(右)、上段488nm励起、下段543nm励起。
図面
【図2】
0
【図3】
1
【図5】
2
【図1】
3
【図4】
4
【図6A】
5
【図6B】
6