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明細書 :β-1,3-グルカン/カルボラン複合体

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第5159125号 (P5159125)
公開番号 特開2008-222585 (P2008-222585A)
登録日 平成24年12月21日(2012.12.21)
発行日 平成25年3月6日(2013.3.6)
公開日 平成20年9月25日(2008.9.25)
発明の名称または考案の名称 β-1,3-グルカン/カルボラン複合体
国際特許分類 A61K  31/69        (2006.01)
A61P  35/00        (2006.01)
A61K  47/36        (2006.01)
FI A61K 31/69
A61P 35/00
A61K 47/36
請求項の数または発明の数 3
全頁数 9
出願番号 特願2007-059771 (P2007-059771)
出願日 平成19年3月9日(2007.3.9)
審査請求日 平成22年3月5日(2010.3.5)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】503360115
【氏名又は名称】独立行政法人科学技術振興機構
【識別番号】501190941
【氏名又は名称】三井製糖株式会社
発明者または考案者 【氏名】新海 征治
【氏名】為末 真吾
【氏名】広瀬 良治
【氏名】櫻井 和朗
【氏名】長崎 健
【氏名】沼田 宗典
個別代理人の代理人 【識別番号】100087675、【弁理士】、【氏名又は名称】筒井 知
審査官 【審査官】遠藤 広介
参考文献・文献 GODFREY,P.D. et al.,Aza-Crown Ether: 1,2-Dicarbadodecaborane(12) Supramolecular Assemblies,J. Am. Chem. Soc.,1997年,Vol.119, No.39 ,p.9283-9284
FRIXA,C. et al,Formation of a remarkably robust 2:1 complex between beta-cyclodextrin and a phenyl-substituted icosahedral carborane,Chem Commun (Camb),2002年,No.23,p.2876-2877
為末真吾他,多糖・シゾフィランが形成する1次元ナノ空間を利用したホウ素クラスター・カルボランの一次元組織化,日本化学会講演予稿集,2007年 3月12日,Vol.87, No.1,p.410,2 L1-46
調査した分野 A61K 31/69
A61K 47/36
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII)
BIOSIS(STN)
CAplus(STN)
EMBASE(STN)
MEDLINE(STN)
特許請求の範囲 【請求項1】
β-1,3-グルカンとm-カルボランから成ることを特徴とする複合体。
【請求項2】
β-1,3-グルカンがシゾフィラン、スクレログルカン、レンチナン、パッキマンまたはカードランから選ばれたものであることを特徴とする請求項1の複合体。
【請求項3】
β-1,3-グルカンおよびm-カルボランを極性溶媒溶液中で混合し、水を加えて熟成する工程を含むことを特徴とする、請求項1の複合体を調製する方法。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
本発明はホウ素中性子捕捉療法に使用されるカルボランを、生体内へ導入しやすくするために水溶性かつ細胞親和性のある複合体に包接する技術に関する。
【背景技術】
【0002】
原子番号10のホウ素のケージ状化合物であるカルボラン(図1参照)は新規ながん治療法であるホウ素中性子捕捉療法neutron capture therapy(BNCT)に用いる化合物として近年注目を集めている。ホウ素は同位体の存在比が大きく、そのため人体に無害な熱中性子線を照射すると核反応が生じ、この核反応によりホウ素はα線を照出する(図2参照)という興味深い性質を持つ。α線は飛程が9~10 nm程度と極めて短く、この範囲の細胞のみを死滅させることができる。この性質を利用したホウ素中性子捕捉療法(BNCT)では、ガン細胞のまわりにホウ素を集積させ、ガン細胞のみを選択的に死滅させることを目的としている。カルボランは10 個ものホウ素を含む生物学的に安定なホウ素クラスターである。前記のごとくこの治療法の成否は、いかにしてガン細胞のみにカルボランを集積させるかにかかっている。しかしながら、カルボランは水に難溶で、細胞選択性もないため細胞に導入することや、ガン細胞の周りに集積させることは困難である。このためこれまでに細胞選択性や水溶性の向上、置換基修飾など様々な研究がなされている(非特許文献1-9)。

【非特許文献1】T. Takenobu, T.Takano, M. Shiraishi, Y. Murakami, M. Ata, H. Kataura, Y. Achiba, Y. Iwasa,Nature Materials, 2, 683 (2003)
【非特許文献2】S. B. Kaul, R.A. Kaser, J. Am. Chem. Soc., 118, 1223 (1996).
【非特許文献3】P. D. Godfrey,W. J. Crigsby, P. J. Nichols, C. L. Raston, J. Am. Chem. Soc., 119, 9283(1997).
【非特許文献4】A. Harada, S. Takahashi, J. Chem. Commun.,12, 1352 (1988).
【非特許文献5】M-J. Hardie,C-L. Raston., J. Chem. Commun., 12, 1153 (1999).
【非特許文献6】M-J. Hardie,C-L. Raston., Eur. J. Inorg. Chem., 12, 195 (1999).
【非特許文献7】L. Craciun, R.Custelcean, Inorg. Chem, 38, 4916 (1999).
【非特許文献8】L. Deng, H-S.Chan, Z. Xie, J. Am. Chem. Soc, 128, 5219. (2006).
【非特許文献9】A. H. Soloway,W. T. Beverly, A, Barnum, F-G. Rong, R-F. Barth, I-W. Codogni, J. G. Wilson,Chem. Rev., 98, 1515 (1998).
【0003】
しかしながら、過去報告されている手法はカルボランの炭素部に種々の置換基を導入する手法がほとんどであり、思ったような機能の向上はなされていない。また、シクロデキストリンなどの包接化合物によるカルボランの複合化も報告されており、成功例としてβ-シクロデキストリンによる複合化があるが、β-シクロデキストリンは水溶性がα-およびγ-体に比べて悪いことが知られている。後にγ-シクロデキストリンによる包接も報告されているが、カルボラン自身に置換基を導入する必要があった。また、シクロデキストリンとの複合体を細胞に導入することは複合体の安定性などの問題も考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、カルボランを生体に安全な媒体を用いることにより、水溶化および細胞親和性を向上させる技術を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、天然の多糖であるシゾフィランに代表されるβ-1,3-グルカン内に、カルボン、特にm-カルボランを包接、内部空間に配列させることにより、カルボランを水溶化できることを見出し、本発明を導き出した。
かくして、本発明は、β-1,3-グルカンとカルボランから成る複合体を提供するものである。
さらに、本発明に従えば、上記の複合体を調製する方法であって、β-1,3-グルカンおよびカルボランを極性溶媒溶液中で混合し、水を加えて熟成する工程を含む方法が提供される。
【0006】
スエヒロタケと呼ばれるキノコから抽出されるシゾフィラン(以下SPGと記すことがある)は天然の状態では3重螺旋で存在するが、極性溶媒であるDMSOや、pH>13以上のアルカリ水溶液では1本鎖のランダムコイルとして存在することが知られている(図3参照)。また、このランダムコイル状のSPGは溶媒を中性の水に戻すと再び3重螺旋の状態に巻き戻ることが知られている。この巻き戻りの過程に金ナノ粒子などの疎水性物質を共存させることにより、SPGはその螺旋内部にそれらの物質を取り込み、規則的に配列する。このSPGの特殊な性質を利用し、我々は現在までに様々な物質をその3重螺旋内部に取り込むことを明らかとした(非特許文献140、151)。
<nplcit num="10"> <text>M. Numata, M.Asai, K. Kaneko, T. Hasegawa, N. Fujita, Y. Kitada, K. Sakurai, S. Shinkai,Chem. Lett., 232 (2004).</text></nplcit><nplcit num="11"> <text>15 M. Numata,M. Asai, K. Kaneko, A. -H. Bae, T. Hasegawa, N. Fujita, K. Sakurai, S. Shinkai,J. Am. Chem. Soc., 127, 5875 (2005).</text></nplcit>
【0007】
SPGは天然の多糖であるため細胞親和性が高く、葉酸などの様々な細胞選択性部位を容易に導入することができる。このため、SPGとカルボランの複合化に成功すれば、細胞毒性が少なく、ガン細胞の周りに集積させるということも可能であると考えられる。なお、カルボランを包接する作用は、SPGと主鎖の構造が同じであるスクレログルカン、レンチナン、パッキマンおよびカードランのようなβ-1,3-グルカンに共通に認められる性質であり、これらも本発明において使用できるβ-1,3-グルカンである。
【0008】
他方、カルボランとは、カルバボランとも呼ばれ、ポリボランの網目状の構造をもつボラン類の一部のホウ素原子が炭素原子で置き換えられたものの総称である。本発明において用いられるのに好適なカルボランは、図1に示されるように、正二十面体構造の、2つのホウ素原子が炭素原子に置き換わった構造から成る化学式B10C2H12で表され極めて安定なことで知られるm-カルボラン(m-Carborane)とo-カルボラン(o-Carborane)であり、特にm-カルボランが好ましい。m-カルボランとo-カルボランの構造の違いは、カルボラン中に存在する2つの炭素の位置関係にあり、m-カルボランはひとつの炭素ともうひとつの炭素の間にホウ素をひとつ挟んでいる形を呈し、o-カルボランはひとつの炭素のすぐ横にもうひとつの炭素が存在するような構造を有する。
【0009】
β-1,3-グルカンとカルボランから成る本発明の複合体は、β-1,3-グルカンとカルボランを極性溶媒中で混合し(β-1,3-グルカンおよびカルボランの各極性溶媒を混合したり、あるいは、極性溶媒中にβ-1,3-グルカンおよびカルボランのいずれか一方を溶解させた後、他方を添加混合するなど、いずれの手法でもよい)、水を加えて熟成するという簡便な方法で調製することができる。極性溶媒(非プロトン性極性溶媒)として特に好適なものはDMSO(ジメチルスルホキシド)であるが、DMFなど他の極性溶媒も使用可能である。熟成は、一般に、水を加えた溶液を室温下に1日~3日間静置することにより行われる。
以下、本発明に従う複合体化の詳細な条件の例を実施例に沿って記述する。
【0010】
〔実施例1および比較例1〕
カルボランとシゾフィラン複合体溶液の調製 室温下条件下でm-カルボラン/DMSO溶液( 2 mg/mL)100μLとSPG/DMSO溶液(10mg/mL)100μLを混合し、水1800μLを加えることによってSPGを巻き戻した(溶液(丸1))。この溶液を2日間室温条件下で静置した。溶液の最終濃度は[SPG]=7.76×10-4 mmol(モノマー単位)、[m-カルボラン]= 6.85×10-4mol/L、Vw(水/全溶媒容積比)=90%である。またm-カルボランの代わりにo-カルボランを用いて同様に溶液を調製した(溶液(丸2))。SPGの代わりに他の多糖(デキストラン、プルラン)を用いた溶液、多糖を含まないカルボランのみの溶液、SPGの巻き戻り過程が起こらない条件で調製したt-SPG溶液も比較例として調製した。溶液調製後、溶液(丸1)には沈殿が見られなかったが、他の溶液からは白い沈殿が確認された。
【0011】
〔実施例2および比較例〕
ICP-Msスペクトル測定(誘導プラズマ結合-マススペクトル測定)によるシゾフィランと複合化したm-カルボランの量の検討 メタノールによる再沈殿操作を行い、複合化していないm-カルボランを取り除いた。溶液を凍結乾燥させ、白色の固体を得た。これを超純水に溶解させ、ICP-Msスペクトル測定を行った。測定の結果、SPG/m-カルボラン複合体中にホウ素は12.4 wt%含まれているということがわかった。同時に、リファレンスとしてo-カルボランを用いたサンプルのICP-Msスペクトル測定を行ったところ、サンプルからホウ素の存在がほとんど確認されなかった(存在量0.04
wt%)。つまり、m-カルボランはSPGと複合化することによって水溶性が向上し、o-カルボランではSPGと相互作用しにくいことが判明した。
【0012】
〔実施例3および比較例3〕
SPG存在溶液のIRスペクトル測定 SPGと複合化することによってm-カルボランのB-H 振動ピーク( 2596 cm-1)に違いがみられると考え、IRスペクトル測定を行った。測定結果を、m-カルボランから得られるIRスペクトル測定結果と比較することにより違いが見られることを期待した。SPG存在下で調製を行った溶液(丸1)に対し、メタノールによる再沈殿を行い、沈殿物を回収した。この操作により複合化していないm-カルボラン、SPGを除去した。その後、透析を行い、溶媒を完全に水に置換した。この溶液を凍結乾燥し、IRスペクトルを測定した。また、リファレンスとしてm-カルボランのみのIRスペクトルを測定し、IRスペクトルの比較を行った。図4のスペクトル測定の結果、SPGを含まないサンプルから得られたIRスペクトルにはB-Hの振動ピークが確認されなかったのに対し、SPG/m-カルボラン複合体のIRスペクトルはSPGとm-カルボランの足し合わせのIRスペクトルが確認された。またm-カルボランのみに比べ、B-Hの振動ピークが9cm-1程高エネルギーシフトしていることが確認された。複数回同じ操作で溶液調製、測定を行っても同様の結果が得られたことからも、この結果はSPGとm-カルボランが相互作用することにより分子振動に変化が生じたことを示している。また、この結果は過去の研究例とも一致している(非特許文献12、13)。m-カルボランの代わりにo-カルボランを用いたサンプルからはカルボラン由来のB-Hの振動ピークは確認されなかった。この結果は、SPGと相互作用する際にm-カルボランとo-カルボランで何らかの違いが起こっていることを示している。さらに他の多糖をSPGの代わりに用いた溶液も同様の操作を行い、B-Hの振動ピークの確認を行った。しかし、ほぼ全てのサンプルからはB-Hの振動ピークと思われるIRスペクトルは確認されなかった。このことからm-カルボランは他の多糖とは相互作用せずにSPGとのみ特異的に相互作用していることを示唆している。さらに巻き戻り過程を経ずにSPG とカルボランを混合したt-SPG溶液のサンプルからはB-Hの振動ピークは確認されなかった。このことからSPGとカルボランの相互作用はSPGの3重螺旋への巻き戻り過程が必要であることを示している。よって、カルボランはSPG内に取り込まれ相互作用することが判明した。
<nplcit num="12"> <text>Frixa, M.Scobie, S. J. Black, A. S. Thompson, M. D. Threadgill, Chem. Commun., 2876(2002).</text></nplcit><nplcit num="13"> <text>P. D. Godfrey,W. J. Grigsby, P. J. Nichols. C. L. Raston, J. Am. Chem. Soc., 119, 9283(1997).</text></nplcit>
【0013】
〔実施例4および比較例4〕
TEM観察 m-カルボランとSPGの複合化によるモルフォロジー変化を見るため溶液を透析により溶媒を完全に水に置換した後、TEMグリッド(カーボン支持膜あり)にキャストし、TEM観察を行った。また、同時にそれぞれリファレンス溶液のTEM観察も行った。その結果、図5に示したようにSPGとの複合化操作を行った溶液からはファイバー状のモルフォロジーが確認されたが、SPGの存在しない溶液や、他の多糖を用いた溶液からはそのようなファイバー状の像が確認されなかった。また、m-カルボランの代わりにo-カルボランを用いた溶液からもファイバー状のモルフォロジーは確認されなかった。これらの結果からも、SPGはm -カルボランと特異的に相互作用していることが示された。
【0014】
〔実施例5および比較例5〕
AFM観察 m-カルボランとSPGが複合化することによるモルフォロジーの変化を確認するため、AFM観察を行った。SPG存在溶液とSPG非存在溶液から得られる結果を比較することで、SPGの存在によるモルフォロジーの変化が見られることを期待した。SPG存在溶液、およびSPG非存在溶液に対し透析を行った。この操作により溶媒を完全に水に置換した後、マイカ基盤にキャストし、減圧乾燥させた。各測定サンプルに対し、AFM観察を行った。AFM観察の結果、図6のようにSPG以外の多糖(プルランや、デキストラン、アミロース)溶液からは高さが不均一で4.5nm以上の凝集したような像が見られた。また、SPGを含むサンプルからは、高さの均一な像が確認された。AFMやTEM観察に像に見られるモルフォロジーから、SPGによってカルボランは均一な高さのファイバー状に配列制御されていることが示唆された。また、SPGを含むサンプルから得られたファイバー状モルフォロジーの高さは、2nm程度であることが確認された。SPG3重螺旋状態での高さはおよそ1nmであり、m-カルボラン1つの直径がおよそ1nmであることからすると、もし複合化しているならばSPG内でm-カルボランは1 次元的に配列されていることになる。ICP-Msスペクトル測定の結果から計算を行うと、m-カルボランは複合体中で糖と0.7(mol/mol)の比で複合化していることが認められ、複合体のICP-Msペクトル測定の結果とAFMから得られた平均的な高さはほぼ一致する。また、IRスペクトル測定によりSPGとm-カルボランの相互作用を示唆する結果が得られたことからもSPG内でm-カルボランは1次元的に配列していると考えられる(図7および図8)。
【産業上の利用可能性】
【0015】
カルボランを天然の多糖であるSPG等のβ-1,3-グルカンで被覆することによってカルボランの水溶性を向上させることを見出した。β-1,3-グルカンが選択的にカルボランを取り込むことによってβ-1,3-グルカンとカルボランから成る複合体が形成され、この複合体を利用することにより、生体適応性の増加などガン細胞へのカルボランのデリバリーシステムの構築が期待される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】カルボランの構造(左:o-体、右:m-体)を示す。
【図2】カルボランの熱中性子線吸収とα線放射を模式的に示す。
【図3】SPGの3重螺旋とランダムコイルを模式的に示す。
【図4】SPG/カルボラン系のIR スペクトルを示す: (A) SPG/m-カルボラン、(B) SPG/o-カルボラン、 (C) 3重鎖SPG/m-カルボラン(実施例3および比較例3)。
【図5】TEM観察結果を示す:(A) SPG存在溶液、(B) SPG非存在溶液(実施例4および比較例4)
【図6】AFM観察結果を示す:(A) SPG存在溶液、(B) SPG非存在溶液(実施例5および比較例5)
【図7】SPGとカルボランの相互作用模式図(実施例5および比較例5)を示す。
【図8】SPG/カルボラン複合体形成模式図(実施例5および比較例5)を示す。
図面
【図1】
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【図4】
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【図2】
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【図3】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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