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明細書 :ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法および用途

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第5210620号 (P5210620)
公開番号 特開2009-149549 (P2009-149549A)
登録日 平成25年3月1日(2013.3.1)
発行日 平成25年6月12日(2013.6.12)
公開日 平成21年7月9日(2009.7.9)
発明の名称または考案の名称 ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法および用途
国際特許分類 C40B  50/06        (2006.01)
C12N  15/09        (2006.01)
C40B  30/04        (2006.01)
C07K  14/00        (2006.01)
C07K  19/00        (2006.01)
FI C40B 50/06 ZNA
C12N 15/00 ZCCA
C40B 30/04
C07K 14/00
C07K 19/00
請求項の数または発明の数 12
全頁数 35
出願番号 特願2007-328060 (P2007-328060)
出願日 平成19年12月19日(2007.12.19)
審査請求日 平成22年3月8日(2010.3.8)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】503360115
【氏名又は名称】独立行政法人科学技術振興機構
【識別番号】504190548
【氏名又は名称】国立大学法人埼玉大学
発明者または考案者 【氏名】西垣 功一
【氏名】吉田 昼也
【氏名】北村 幸一郎
個別代理人の代理人 【識別番号】110000109、【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス
審査官 【審査官】白井 美香保
参考文献・文献 特表2007-525661(JP,A)
特表2006-522101(JP,A)
国際公開第2002/101036(WO,A1)
国際公開第2007/090630(WO,A1)
蛋白質核酸酵素,2007年11月,vol.52 no.14,pp.1871-1877
JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION,2006年,vol.20,pp.58-68
細胞工学,2007年11月,vol.26 no.11,pp.1284-1289
Protein Engineering,2002年,vol.15 no.10,pp.843-853
J. Mol. Biol.,2009年,vol.387,pp.1186-1198
調査した分野 C12N 15/00-15/90
CA/BIOSIS/MEDLINE(STN)
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII)
PubMed
CiNii
WPI
特許請求の範囲 【請求項1】
標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、但し、前記クラスター解析が、7個、8個または9個のアミノ酸からなるアミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である、
各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、
前記共通アミノ酸配列を4個、5個または6個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの2以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および
前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記クラスター解析が、8個または9個のアミノ酸からなるアミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記第二の群を得る工程において、前記共通アミノ酸配列を4個のアミノ酸からなるブロックに分ける、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
前記ブロックシャッフリング法が、Y連結に基づくブロックシャッフリング(Y-ligation-based block shuffling:YLBS)法である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項5】
前記標的タンパク質の相互作用が、標的タンパク質の活性を促進する作用または標的タンパク質の活性を阻害する作用である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項6】
前記標的タンパク質がアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼである、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
前記アスパラギン酸プロテアーゼがカテプシンDまたはカテプシンEであり;前記システインプロテアーゼがカテプシンBであり;または前記セリンプロテアーゼがトリプシンである、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
請求項1~7のいずれか1項に記載の方法でペプチドアプタマーライブラリーを作製し、作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも2種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および
前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。
【請求項9】
標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
請求項1~7のいずれか1項に記載の方法でペプチドアプタマーライブラリーを作製し、作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも1種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも1種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および
前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。
【請求項10】
前記スペーサーを介した連結が、ペプチドペアライブラリー法により達成される連結である、請求項8または9に記載の方法。
【請求項11】
前記スペーサーが、配列表の配列番号1~3からなる群から選ばれる配列のスペーサーである、請求項8~10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項12】
前記タンパク質が酵素または受容体である、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
本発明は、高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法に関する。より詳しくは、本発明は、第一のペプチドアプタマー群を統計解析およびブロックシャッフリング法で処理することにより、高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを回収することを特徴とする、上記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法に関する。
【0002】
さらに本発明は、上記ペプチドアプタマーライブラリーを利用して、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーを作製する方法に関する。さらに、本発明は、上記いずれかのライブラリーを利用して、最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ペプチドとは、2以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものの総称である。タンパク質間相互作用は、本質的にペプチド間相互作用である生理学的現象を基盤とする。したがって、ペプチドの中でも、特に酵素や受容体などのタンパク質に相互作用するペプチド(ペプチドアプタマー)は、酵素と疾患の関連性を解明する上でも非常に有用な研究対象であり、抗体医薬に続く有望な分子として期待されている。
【0004】
これまでにペプチドアプタマーの研究は、組み合わせ合成、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびmRNAディスプレイなどの手法を用いて実施されてきた(非特許文献1~4)。ファージディスプレイは、ビリオン粒子の表面にファージDNAにコードされたペプチドを表示する手法であり、新規なタンパク質およびペプチドをもたらすことに成功している。
【0005】
しかし、ファージディスプレイは、処理できるペプチドおよび多様性の数が制限されるという問題があった。そこで、現在はリボソームディスプレイやmRNAディスプレイなどのインビトロシステムの開発が進められている。これまでにインビトロシステムを利用して、処理できるペプチドの分子スペクトルを拡張し、さらに1012-15(ファージ・ディスプレイは10)にまで分子の多様性を拡大化することに成功している(非特許文献3および4)。

【非特許文献1】Acharya, A. N., Nefzi, A., Ostresh, J. M. & Houghten, R. A. (2001). J. Comb.Chem. 3, 189-195.
【非特許文献2】Smith, G. P. (1985). Science. 228, 1315-1317.
【非特許文献3】Hanes, J. & Pluckthun, A. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4937-4942.
【非特許文献4】Roberts, R. W. & Szostak, J. W. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、従来のインビトロシステムは、上記した長所があるにもかかわらず、方法論の不備が多いために、その使用は非常に制限されている。したがって、特定の疾患に関連する標的タンパク質に高度に相互作用(例えば、活性の促進または阻害など)する数多くの有用なペプチドアプタマーを含む、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法については未だ開発されていない。
【0007】
したがって、本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。すなわち、本発明は、標的タンパク質に高度に相互作用する有用なペプチドアプタマーを数多くプールすることを可能とする、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法を提供することを解決すべき課題とした。
【0008】
さらに本発明は、作製したペプチドアプタマーライブラリーを利用して、標的タンパク質により高度に相互作用するコンビネーションペプチドを含む、コンビネーションペプチドライブラリーの作製方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決するために、任意のペプチドアプタマー群から統計学的手法により得たアミノ酸配列情報に基づいてブロックシャッフリングする、ASAC(All-Steps-All-Combinations)法を開発した。上記ASAC法を利用することで、高度に標的タンパク質に相互作用する多数のペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーを作製することに成功した。
【0010】
さらに、本発明者らは、上記ペプチドアプタマーライブラリーから選ばれるペプチドアプタマーを基に、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーを合成し、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーを開発した。さらに、本発明者らは、これらのライブラリーの中から最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングすることができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成した発明である。
【0011】
すなわち、本発明によれば、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、前記共通アミノ酸配列を数個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの2以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。
【0012】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記クラスター解析が、アミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である。
【0013】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記ブロックシャッフリング法が、Y連結に基づくブロックシャッフリング(Y-ligation-based block shuffling:YLBS)法である。
【0014】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記ブロックがいずれも3、4、5または6個のアミノ酸からなる。
【0015】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記標的タンパク質の相互作用が、標的タンパク質の活性を促進する作用または標的タンパク質の活性を阻害する作用である。
【0016】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記標的タンパク質がアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼであり、より好ましくは、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンBまたはトリプシンである。
【0017】
さらに本発明の別の側面によれば、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、前記の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも2種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。
【0018】
さらに本発明の別の側面によれば、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、前記の方法で作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも1種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも1種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【0019】
好ましくは、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記スペーサーを介した連結が、ペプチドペアライブラリー法により達成される連結である。
【0020】
好ましくは、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記スペーサーが、配列表の配列番号1~3からなる群から選ばれる配列のスペーサーである。
【0021】
好ましくは、本発明のペプチドアプタマーライブラリーまたはコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、前記タンパク質が酵素または受容体である。
【発明の効果】
【0022】
本発明によれば、第一のペプチドアプタマー群よりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーを作製することが可能になる。さらに、本発明により作製されたペプチドアプタマーライブラリーを利用して、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むライブラリーを作製することが可能になる。したがって、疾患に関連のある酵素を標的タンパク質として、これらのライブラリーから最も高度に上記標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングすることで、上記疾患の治療または予防するための組成物を作製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0023】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明のペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、前記共通アミノ酸配列を数個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの2以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および
前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【0024】
本明細書にいう「標的タンパク質」とは、所望の標的となるタンパク質であれば特に制限されないが、上記タンパク質としては酵素や受容体が好ましい。標的タンパク質としての具体的な例としては、カテプシンDやカテプシンEなどのアスパラギン酸プロテアーゼ、カテプシンBなどのシステインプロテアーゼ、またはトリプシンなどのセリンプロテアーゼなどを挙げることができる。
【0025】
これらのプロテアーゼのうち、例えば、カテプシンEは、免疫反応の一部として外来タンパク質を分解消化する作用を有し、リンパ腺や他の細胞において発現することが知られている。これまでに、カテプシンEの異常活性はアトピーや癌などの疾患に関連することが知られているが、カテプシンE活性を特異的に促進または阻害する分子については未だ知られていない。したがって、実施例で示したような、カテプシンEの活性を促進または阻害するなどの相互作用を示すペプチドアプタマーをプールすることは、アトピーや癌の予防または治療剤の創製において非常に有用である。
【0026】
本明細書にいう「相互作用」とは、標的タンパク質の有する機能または作用に影響を与えるものであれば特に制限されないが、例えば、標的タンパク質(酵素)の活性促進や活性阻害、標的タンパク質(受容体)のリガンドの結合促進や結合阻害などを意味し、広義には機能または作用の調節や適正化なども含みうる。
【0027】
本明細書にいう「ペプチドアプタマー」とは、上記した通り、酵素や受容体などのタンパク質に相互作用するペプチドであれば特に制限されず、例えば、タンパク質に相互作用するアミノ酸残基の数が2~100個、好ましくは2~50個、より好ましくは2~30個、さらに好ましくは2~20個、最適に好ましくは2~10個程度のペプチドをいう。したがって、「ペプチドアプタマーライブラリー」とは、上記したペプチドアプタマーが複数集まった集団をいう。より具体的には、本発明のペプチドアプタマーライブラリーの規模は1010以上、好ましくは1011以上、より好ましくは1012以上である。
【0028】
本明細書にいう「標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマー」とは、例えば、標的タンパク質に相互作用して、標的タンパク質の生理活性を阻害または促進等するペプチドアプタマーであって、本発明のペプチドアプタマーライブラリーを作製する際の出発(原料)分子を意味する。したがって、本明細書にいう「標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群」は、本発明のペプチドアプタマーライブラリーを作製する際の出発分子の母集団(ライブラリー)を意味するものである。このような標的タンパク質に相互作用する第一の群としては、例えば、実施例で示した第一ライブラリーを挙げることができる。
【0029】
本明細書にいう「アミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する」とは、統計学的手法を用いてアミノ酸配列を分類(クラスタリング)することができれば特に制限されないが、例えば、アミノ酸配列間のハミング距離を計算し、その結果に基づいてアミノ酸配列を分類する方法を挙げることができる。ここで、「ハミング距離」とは、特定の文字数を持つ二種の文字列の中で、対応する位置にある異なった文字の個数をいう。例えば、一文字表記で表したアミノ酸配列EDNTSとADNKSの間のハミング距離は、AとKの位置の相違から2として計算される。このようにして計算されたハミング距離に基づき、統計アルゴリズムにより計算することにより系統樹を作製することができる。これらは手動でも可能であるが、例えば、「ClustalW」(サービスの主体:http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)などの計算ソフトを用いれば簡便に作製できる。
【0030】
本明細書にいう「各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する」とは、例えば、上記クラスター解析により一つの枝にまとめられたペプチドアプタマー群のアミノ酸配列について、共通するアミノ酸配列を手動または情報処理ソフトを使うなどして自動で抽出することを意味する。
【0031】
本明細書にいう「数個のアミノ酸」とは、2、3、4、5、6、7、8または9個のアミノ酸を意味し、好ましくは3、4、5または6個のアミノ酸、より好ましくは4個のアミノ酸である。本明細書でいう「数個のアミノ酸からなるブロックに分ける」としては、例えば、8アミノ酸残基からなるペプチドを4個のアミノ酸を一つの単位として2つのブロックに分けるなどが該当する。したがって、共通アミノ酸配列を集めて、得られた配列情報から可変領域と定常領域に分け、可変領域を対象として数個のアミノ酸からなる1~4程度のブロックに分ければよい。
【0032】
本明細書にいう「ブロックシャッフリング法」とは、例えば、可変領域が8アミノ酸残基からなる異なる2種のペプチドを4個のアミノ酸(前半・中央・後半)ごとにブロック化し、得られた計6ブロックをシャッフリングすることにより確率論的な組み合わせで種々のペプチドを合成することができる方法をいう。そのような方法として、例えば、本発明者らによって開発されたY連結に基づくブロックシャッフリング(Y-ligation-based block shuffling:YLBS)法がある(例えば、K.Kitamra et al., Protein Engineering, (2002)、Vol.15、No.10、pp.843-853を参照)。
【0033】
上記YLBS法の概略は図1に示した通りであり、この図を用いて以下に説明する。
2種の一本鎖DNA(5’ハーフ鎖と3’ハーフ鎖)をシャッフリング用配列として作製する。これらの5’ハーフ鎖と3’ハーフ鎖において、単一のブロック配列を3’末端または5’末端のいずれかに配置する。さらに、各鎖のステム領域は相補的であり、PCRのプライマー結合領域として作用するDブランチ領域(図中のBD5とBD3)が含まれる。3’ハーフ鎖の5’末端はライゲーション反応のために予めリン酸化されている必要がある。5’ハーフ鎖および3’ハーフ鎖の同量(通常10pmol/10μl)の組み合わせが用いられ、ステム領域でハイブリダイゼーションされる。5’ハーフ鎖の3’末端および3’ハーフ鎖の5’末端は、0.1mM ATPの存在下で50UのT4 RNAリガーゼ(タカラ、京都、日本)でライゲートされる。ライゲーション生成物のプレ増幅後(このステップを省くことも可能)、プレ5’ハーフ鎖およびプレ3’ハーフ鎖のPCR産物が2種のPCR(図中の2種のプライマーセット:pS/pBD3とpBD3/pS)により得られる。ステム領域を含むプライマー(プライマー、pSおよびpS)をあらかじめ5’末端でビオチン化しておき、次のYライゲーションサイクル用一本鎖DNAを作製するために使用する。PCR産物は対応する制限酵素(3’ハーフ鎖はMboII、5’ハーフ鎖はAlwI)で分離消化され、その後アルカリ変性により分離された一本鎖DNAはアビジン-ビオチン結合(ストレプトアビジン被覆磁性ビーズを使用)によって回収される。プレ5’ハーフのビオチン化鎖とプレ3’ハーフの非ビオチン化鎖は、引き続き5’ハーフ鎖および3’ハーフ鎖として、次のYライゲーションサイクルで使用される。サイクル数nに依存して、ライゲートされるブロックのサイズおよび多様性が指数的に増加しうる:サイズは2(=s)であり生産物多様性はd(dは開始時のブロックの多様性の値)。例えば、d=8であれば、PCR生産物の多様性は、64、4096、1.7×10、2.8×1014と増加する。なお、図中の○で囲まれたBおよびPは、それぞれビオチン化とリン酸化を示す。したがって、上記したようなブロックシャッフリング法によれば、多様性のある数多くのペプチドアプタマーからなる第二の群を作製することができる。
【0034】
本明細書にいう「第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマー」とは、第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと比較した場合に、同等またはそれより高度に標的タンパク質に相互作用を示すペプチドアプタマーを意味する。ここで、「高度に標的タンパク質に相互作用する」とは、例えば、相互作用が活性阻害作用である場合は標的タンパク質の活性をより大きい度合いで阻害することを意味し、または相互作用が活性促進作用である場合は標的タンパク質の活性をより大きい度合いで促進することを意味する。または、「同等またはそれより高度に標的タンパク質に相互作用を示すペプチドアプタマー」とは、基準となる相互作用と比べて同じかそれよりも大きい度合いで標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを意味する。
【0035】
本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも2種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【0036】
別の側面によれば、本発明のコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法は、標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも1種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも1種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程を含む、コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法である。
【0037】
本明細書にいう「コンビネーションペプチドアプタマー」は、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも2種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させるか、または、上記のペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも1種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも1種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させることにより作製が可能である。スペーサーとしては、一定数のアミノ酸残基からなるスペーサーであれば特に制限されないが、例えば、3~30アミノ酸残基、好ましくは5~15アミノ酸残基、より好ましくは8~12アミノ酸残基からなるスペーサーが用いられる。スペーサーの例として、グリシンからなる配列(G10およびG15;アルファベットはアミノ酸の一文字表記を表し、数字はアミノ酸の数を表す。以下同じ。)、グリシンおよびセリンからなる配列(G3SG3G2およびG3SG3SG3SG3)ならびにグリシンおよびプロリンからなる配列(G3PG3PG2およびG3PG3PG3PG3)などがあり、具体例としては配列表の配列番号1~3からなる群から選ばれる配列を利用できる。
【0038】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【0039】
1 材料および方法
(1)ライブラリーの構築
組み合わせDNAおよびIVV(in vitro virus)ペプチドライブラリーは、YLBS法およびcDNAディスプレイによって構築された。これらの実験に使用されたDNAブロックおよびプライマーの配列を表1および表2にまとめた。
【0040】
【表1】
JP0005210620B2_000002t.gif

【0041】
【表2】
JP0005210620B2_000003t.gif

【0042】
(2)選択に使用されたCE固定化ビーズ
カテプシンE(CE)は通常知られる方法に従ってネズミ脾臓から調製された。精製CEは、メーカーの指示に従って、化学的に安定したアミド結合を形成する化合物をカップリングし得るアミンを使用することにより、NHS活性化セファロース・ビーズ(GEヘルスケア)上で固定された。酵素をカップリングしたビーズは、使用時まで4℃で100mM リン酸緩衝液(pH 7.4)中に保管された。カップリング効率は、カップリングしていない酵素の吸光度を遊離酵素の吸光度と比較することにより計算された。
【0043】
(3)親和性選択
選択緩衝液(50mM トリス-HCl、100mM NaCl、5mM MgCl、pH 7.2)の100μl中のIVVペプチドライブラリーは、CE固定化ビーズの5μlと30分間混合され、25℃で30分間インキュベートされた。ビーズは、選択ラウンドごと、つまり、ラウンド1は2:2:1、ラウンド2は2:2:2、ラウンド3は3:3:3に変えて洗浄プロトコールに従って、200μlの選択緩衝液、洗浄緩衝液-1(50mM トリス-HCl、0.5M NaCl、pH 7.2)および洗浄緩衝液-2(50mMトリス-HCl、1M NaCl、pH 7.2)で洗浄された。最後に、ビーズは、溶出緩衝液-1(50mM トリス-HCl、1M NaCl、10mM MgCl、pH 7.2)の200μl中で懸濁され、5分間37℃でインキュベートされた。遠心分離(15,000rpm、1min)の後、ビーズは溶出緩衝液-1で再び洗浄された。結合した上清は保管された(Sup1)。ビーズは、溶出緩衝液-2(50mM トリス-HCl、2M NaCl、10mM MgCl、pH 7.2)で懸濁され、5分間95℃でインキュベートされた。インキュベーション後、ビーズは取り除かれ、および上清は保管された(Sup2)。Sup1とSup2の中のIVVはBio-Spinカラム(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)で精製された。
【0044】
(4)機能選択
親和性選択のラウンド3の結果として作製されたDNAライブラリーは、可変領域としてIVV-SF-連結DNA構築物(図2)に挿入された。反応緩衝液(50mM 酢酸ナトリウム、100mM NaCl、pH 4.5)の100μl中のIVV-SF-連結ペプチドライブラリーは、CE固定ビーズの5μlと混合され、10分間40℃でインキュベートされた。インキュベーション後に、ビーズは親和性選択に記載した通りに、洗浄および溶出された。
【0045】
選択緩衝液、洗浄緩衝液-1および洗浄緩衝液-2を使用した洗浄繰り返し回数のプロトコールは、選択ラウンド(F1-F9)によって以下のように実行された:F1は3:3:3;F2は4:5:3;F3は5:5:5;F4は5:7:5;F5は5:7:7;F6は5:10:7;F7は 5:10:10;F8は5:15:10;F9は5:15:15。
【0046】
(5)IVVからのペプチドの回収
PCR溶液(7.5μl、5pmolのDNA)は、インビトロ翻訳システムキット(和光純薬システム、和光)の12.5μlのA溶液および5μlのB溶液で混合され、および1時間37℃でインキュベートされた。事前に200μlの1×結合緩衝液(TaKaRa)で2度洗浄され、および25μlの2×結合緩衝液で懸濁された磁気ビーズ懸濁液(10μl、Magnotex SA、TaKaRa)は、翻訳混合物に加えられ、1時間37℃でインキュベートされた。インキュベーション後、磁気ビーズは磁石で取り除かれ、200μlの0.01% BSA溶液で洗浄された。
【0047】
ビーズは、2UのファクターXaを含む、ファクターXa反応混合物(20mM トリス-HCl、50mM NaCl、1mM CaCl2、pH6.8)の中で懸濁され、混合の後に1時間37℃でインキュベートされた。上清は磁石で回収され、0.25μlの1M トリス-HCl(pH8.0)でpHを調節された。次に、事前に1×Xa緩衝液(pH 8.0)で洗浄されたXa除去樹脂(QIAGEN)の10μlが、回収された溶液に加えられ、混合の後に10分間室温でインキュベートされた。上清は遠心分離によって回収された。回収されたペプチドは合計10pmolであると見積もられ、溶液の2μlが阻害活性を測定するために使用された。
【0048】
(6)活性分析
阻害活性分析のために、(IVVまたは有機合成の何れかから得られた)ペプチドアプタマーは、90μlの選択緩衝液において1:1のモル比で(0.1%のBSA中の)CEとプレインキュベートされた。次に、0.1mM 蛍光性CE基質(ペプチド研究所)の10μlが溶液に加えられ、10分間40℃でインキュベートされた。反応生成物の蛍光強度(λem:430nm、λex:360nm)は、蛍光マイクロプレートリーダー(FluPOLO、TaKaRa)によって測定された。
【0049】
パーセント阻害は下記式(1)によって計算された:
コントロールの%阻害=100×(1-Sf/CEf) (1)
上記式(1)中、Sfは酵素(CE)、蛍光性基質および潜在的な阻害剤を含む試料溶液の蛍光強度であり、CEfはブランク溶液の蛍光強度であり、阻害剤のない試料溶液と同様である。
【0050】
(7)マルチ・ミクロ・ヴェッセル(MMV)およびその中での反応
MMVに基づいたクローン淘汰用のDNA構築物、およびMMVを使用した実験操作を、図3の中で簡潔に示した。MMVは、光照射による重合反応を開始するためにDMD(ディジタル多重反射鏡装置)プロジェクターを使用して、アクリルアミド(18%)ゲルで作られた。MMVは、通常2.5×2.5cmの面積の上に1024個の小さなウェルを保持する。ここでPCR、インビトロ転写、インビトロ翻訳およびカテプシンE-反応のすべてが行なわれた。
【0051】
(8)IC50阻害の特性
CEは上記された通りに、ペプチド・クローンの濃度を変えてインキュベートされた。パーセント阻害は上記式(1)によって計算された。IC50(50%の阻害が観察された濃度)は、投与-反応曲線から決定された。
【0052】
(9)解離定数の測定
解離定数の測定はFriguetらの方法を改良して実施された。上記の方法の中で言及されているように、それぞれのペプチドのIVVが用意された。大型のmRNAおよびリボソームは、ペプチド結合物を遊離するために30分間25℃でリボヌクレアーゼAおよびリボヌクレアーゼH(Ambion)を用いて消化によって放出された。一定量のペプチド結合物(~2nM)はCEの量を変えて(1nM~1μM)1時間インキュベートされた。混合物は、一定量の固定化CE(~200nM)に適用され、さらに30分間インキュベートされた。PBS-T(リン酸緩衝化塩溶液;0.1% Tween20)を用いた数回の洗浄後、Penta.His HRP(QIAGEN)が1/2000希釈で加えられ、1時間インキュベートされた。ビーズはPBS-Tで徹底的に洗浄され、その後基質である3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB、シグマ)を添加した。発色をさせた後、反応は0.5M HSOの添加によって止められた。吸光度はマイクロプレート・リーダ(Tecan)を用いて450nmで測定された。データはGraphPadプリズム(GraphPadソフトウェア社)を使用してプロットされた。
【0053】
(10)ペプチドペアライブラリー法(図12)
ペプチドペアライブラリー法は下記の通りに実施した。
[a]材料
JP0005210620B2_000004t.gif
【0054】
[b]ペプチドアプタマーの連結候補
配列表の配列番号4および5の配列が、ペプチドアプタマーをコードするDNA配列と連結させる配列として用いられた。ペプチドアプタマーをコードするDNAは、配列番号4の5’末端または配列番号5の3’末端に連結する。
【0055】
CEに相互作用するペプチドおよびYタグを配列表の配列番号6~18とした(表3)。
【0056】
【表3】
JP0005210620B2_000005t.gif

【0057】
[c]プライマー
ペプチドペアライブラリー法に用いたプライマーを配列表の配列番号19~28とした(表4)。
【0058】
【表4】
JP0005210620B2_000006t.gif

【0059】
[d]バッファー
JP0005210620B2_000007t.gif
【0060】
[e]方法
(1)ペプチドとスペーサーの結合
JP0005210620B2_000008t.gifJP0005210620B2_000009t.gifJP0005210620B2_000010t.gif4)電気泳動
5)5’ハーフDNAの抽出
JP0005210620B2_000011t.gifJP0005210620B2_000012t.gifJP0005210620B2_000013t.gif(2)ペプチドとyタグの連結
JP0005210620B2_000014t.gifJP0005210620B2_000015t.gifJP0005210620B2_000016t.gif4)電気泳動
5)3’ハーフDNAの抽出
JP0005210620B2_000017t.gifJP0005210620B2_000018t.gifJP0005210620B2_000019t.gif(3)ペプチド+スペーサー+ペプチド+yタグの連結
JP0005210620B2_000020t.gifJP0005210620B2_000021t.gif3)電気泳動
4)DNAの抽出
JP0005210620B2_000022t.gifJP0005210620B2_000023t.gifJP0005210620B2_000024t.gifJP0005210620B2_000025t.gifJP0005210620B2_000026t.gifJP0005210620B2_000027t.gif
【0061】
2 結果
(1)ペプチドアプタマーの選択(淘汰)のための戦略
mRNAディスプレイに基づいたインビトロ選択を使用して、ペプチドアプタマーの選択および淘汰の戦略を開発した(図4)。第一ライブラリーは、新規な機能を備えた生物活性分子の同定において不可欠である。第二ライブラリーの選択は、分子淘汰のさらなる選抜を可能にする。第一および第二ライブラリーの選択段階は、両方とも二種の淘汰、すなわち集団淘汰とクローン淘汰を含んでいる。
【0062】
集団淘汰は、プールされた分子のライブラリーを選別する。しかし、クローン淘汰は、クローンごとに分子を個々に選別する。これに加えて、従来方式の困難な段階を回避するために、用途の広い有用性のあるマイクロアレイ、換言すればマルチ・ミクロ・ヴェッセル(MMV)を用いるクローニングである新たな方法を用いた。この種のマイクロアレイの導入は、選択の後期段階における迅速なスクリーニングに非常に有用であった。淘汰の進行とともに、より低活性の分子が削除されていくと同時に、各ライブラリー内の多様性は減少していく。第二ライブラリーの構築は、第一ライブラリーの淘汰で生成した配列情報に基づいて達成される。すなわち、第一ライブラリーから選ばれたペプチドブロックを使用して行う、ブロックシャッフリング法(All-steps-all-combinations(ASAC)法)を開発して組み込んだeRAPANSY(evolutionary rapid panning and analysis system)と呼ばれるシステムを用いて、カテプシンE阻害ペプチドの選択に成功し、この方法の有効性を実証した。
【0063】
(2)第一ライブラリーの選択
YLBS法を使用して、図2の中で示されるように、第一ライブラリーが構築された。eRAPANSY(図4に示されるシステム)においてライブラリーをIVV型(図5)にすることが重要である。すなわち機能的な分子(ペプチド)とその情報分子(mRNAであり、引き続きcDNAに変換される)が連結される。このように作られたライブラリーは、スクリーニングに使用できる:親和性選択および機能選択(図2)。後者が特定の分子構築物、すなわち、プロテアーゼ阻害剤のためのSF連結を必要としている一方、前者はターゲット分子への結合を評価することにより通常実行される。
【0064】
図6に示される通りに、スクリーニングが進行するとともに、いずれの選択でもより大きな活性をもつペプチド集団に移行していった。個々にスクリーニングして得られたライブラリーのメンバーをクローニングすることによって、ペプスタチンA(これまでに同定された最も有力なCE阻害剤)のCE阻害活性のおよそ30%を有するCE阻害ペプチドを生成した(図6および表5)。
【0065】
【表5】
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【0066】
IVV由来のペプチド(つまり、エンドヌクレアーゼ分解(図4のクローン淘汰段階)によってIVVからDNAとリンカー部分を分離することにより得られたペプチド)を使用して、選択されたペプチドを化学的に合成する前に、これらのクローンの阻害活性は迅速に測定した。選択された分子のコーディングDNA配列に基づいてペプチドを合成し、それらの真の活性(Asyと名付けられた)を確認した。しかし、IVV由来ペプチド(Adpと名付けられた)によっておおよその活性をモニターすることができた(表5)。
【0067】
興味深いことには、IVV由来ペプチド(Adp)とIVVs自体(Aiv)との活性の間に優れた相関性があった。一般に、IVVの阻害活性は同系統のIVV由来ペプチド(約2倍以上;表1)より大きく、恐らくIVVのかさばったDNA部分がカテプシンEの活性部位中への基質のアクセスを妨害することにより、ペプチドの阻害作用を増強する場合があることを示唆している。
【0068】
(3)第二ライブラリーに対して使用されたブロック
第一ライブラリーの選択の生産物が8つのアミノ酸を含む可変領域を含んでいたために、4個のアミノ酸を一つのブロック単位とした。それらの阻害性ペプチド(表5中のPi1~Pi6)は、ClustalWを使用してクラスター分析された(図7)。そして、四量体配列は、比較的高い阻害活性(表5中のPi1、Pi5およびPi6)を示したコンセンサスペプチド配列から同定された。これらの4ペプチド配列に加えて、カテプシンE基質配列としてのSF連結の構築に必要な、保存された領域(GGRP/PTIFFRLK/DYKDDDDK)の配列も四量体に分割され、および出発ブロック(図8)として使用された。
【0069】
これは、共通のペプチド配列のある部分がキメラ・ペプチドのフォールディングに影響を与え、その結果その機能に影響がある場合がありうるからである。
さらに、多様性を増強するために二つの任意のブロック(X1とX2)を加えた。出発ブロックとしてこれらの16個の四量体配列を使用して、徹底的にシャッフルされたDNAライブラリーは、連結化(つまり、1、2、3、4、5および6個までのブロックの連結化;したがって、このライブラリーはall steps and all combinations(ASAC)ライブラリーとして指定された)のすべての段階の生産物を含めて生成された。このように生成されたライブラリーは、第二ライブラリーの選択に使用された。
【0070】
(4)第二ライブラリーの選択
この段階のほとんどのペプチドが前の選択によってカテプシンEへの親和性を有するものになっているので、親和性に基づいた選択過程は省略された。したがって、機能(SF-連結)選択が直接行なわれた。また、予想通りに、このプールからスクリーニングされた分子群からの平均活性は第一ラウンドの選択後に観察された平均活性より高かった(第二ライブラリー(2nd A)の平均活性と第一ライブラリー(1st F)との平均活性の比較)(図9)。
2回目のSF-連結選択 (図10および表5)の後にクローン・ペプチドの阻害活性を測定することによりシャッフルされたペプチドの阻害活性の向上が確認された。さらに大きな阻害活性のペプチドを同定するために、MMVを用いたクローン淘汰実験が行なわれた。
【0071】
MMVをライブラリーDNAの転写および翻訳に用いて得られたMMV中のペプチドが酵素反応を阻害すると、蛍光シグナルが生成しない。この原理に基づき、阻害活性の高いペプチド分子が提案されたわずかな体積の溶液のウェルからウェルへの転送などの必要な手順のすべては、遠心操作によって行なわれた。表1にまとめたように、(2Am-21および2Am-301など、この研究で生成されたペプチドの中で最も大きな阻害活性を有した)Asyの活性の40%以上の阻害活性もつペプチドはMMVを使用した第二ライブラリーの選択後に得られた。したがって、ブロック・シャッフルされた第二ライブラリー方法は、約50%(45.2%、31.5%(2Am-301)(F9-65))近くに活性を増強することができた。
【0072】
次に、アスパラギン酸プロテアーゼ(カテプシンD(CD))、システインプロテアーゼ(カテプシンB(CB))およびセリンプロテアーゼ(トリプシン)(図11)の活性阻害を調べるために、スクリーニングで選択されたペプチドのいくつかについて実験した。ペプチド2Am-301がCD、CBまたはトリプシンに対して阻害または亢進活性を示した。興味深いことに、ペプチド2A-28およびF9-65がカテプシンD亢進活性を有した。これはアスパラギン酸プロテアーゼに対する特異性を示唆する。これらのプロテアーゼは同じアスパラギン酸プロテアーゼカテゴリーに属する。また、それらの三次元構造は解明されており、これらの三次元構造は類似しているので、CEおよびCD活性において全く逆の効果を示したことは興味深い。
【0073】
(5)ペプチドペアライブラリー法の結果
図12および表3に示した通り、カテプシンEの活性を促進または阻害する種々のコンビネーションペプチドアプタマーを取得することができた。
【図面の簡単な説明】
【0074】
【図1】図1は、YLBS法のサイクルを示す。
【図2】図2は、選択のために使われたDNA分子の遺伝子領域を示す。
【図3】図3は、MMVに基づく選択のための操作手順フローを示す。
【図4】図4は、機能性ペプチド迅速淘汰系(eRAPANSY)の概念図を示す。
【図5】図5は、磁性ビーズを使用したSF連結ペプチド選択方法概念図を示す。
【図6】図6は、第一ライブラリー選択結果を示す。
【図7】図7は、第二ライブラリーの作製におけるクラスター解析結果を示す。
【図8】図8は、第二ライブラリーを構築するために使用されたペプチドブロックの模式図を示す。
【図9】図9は、第一ライブラリーの機能選択生産物(1st F)、第二ライブラリーの活性化ペプチド選択生産物(2nd A)、およびMMVを用いた活性選択により得られた第二ライブラリー選択生産物の平均阻害活性を示す。
【図10】図10は、第二ライブラリー選択後に得られた高度に阻害活性を示した12クローンの結果を示す。
【図11】図11は、各クローンの特異性試験結果を示す。
【図12】図12は、ペプチドペアライブラリー法の概念図および結果を示す。
図面
【図1】
0
【図2】
1
【図3】
2
【図4】
3
【図5】
4
【図6】
5
【図7】
6
【図8】
7
【図9】
8
【図10】
9
【図11】
10
【図12】
11