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明細書 :特異的遺伝子の多重検出によるSalmonellaGallinarumの迅速同定法

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第5224558号 (P5224558)
公開番号 特開2011-212028 (P2011-212028A)
登録日 平成25年3月22日(2013.3.22)
発行日 平成25年7月3日(2013.7.3)
公開日 平成23年10月27日(2011.10.27)
発明の名称または考案の名称 特異的遺伝子の多重検出によるSalmonellaGallinarumの迅速同定法
国際特許分類 C12N  15/09        (2006.01)
C12Q   1/68        (2006.01)
FI C12N 15/00 ZNAA
C12Q 1/68 A
請求項の数または発明の数 8
全頁数 79
出願番号 特願2011-170239 (P2011-170239)
分割の表示 特願2009-140192 (P2009-140192)の分割、【原出願日】平成21年6月11日(2009.6.11)
出願日 平成23年8月3日(2011.8.3)
優先権出願番号 2008177942
優先日 平成20年7月8日(2008.7.8)
優先権主張国 日本国(JP)
審査請求日 平成23年8月3日(2011.8.3)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】501203344
【氏名又は名称】独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明者または考案者 【氏名】秋庭 正人
個別代理人の代理人 【識別番号】100102978、【弁理士】、【氏名又は名称】清水 初志
【識別番号】100102118、【弁理士】、【氏名又は名称】春名 雅夫
【識別番号】100160923、【弁理士】、【氏名又は名称】山口 裕孝
【識別番号】100119507、【弁理士】、【氏名又は名称】刑部 俊
【識別番号】100142929、【弁理士】、【氏名又は名称】井上 隆一
【識別番号】100148699、【弁理士】、【氏名又は名称】佐藤 利光
【識別番号】100128048、【弁理士】、【氏名又は名称】新見 浩一
【識別番号】100129506、【弁理士】、【氏名又は名称】小林 智彦
【識別番号】100130845、【弁理士】、【氏名又は名称】渡邉 伸一
【識別番号】100114340、【弁理士】、【氏名又は名称】大関 雅人
【識別番号】100121072、【弁理士】、【氏名又は名称】川本 和弥
審査官 【審査官】三原 健治
参考文献・文献 Microbiol.Immunol.,Vol.41,No.10(1997)p.791-794
J.Bacteriol.,Vol.187,No.14(2005)p.4720-4727
動物衛生研究所研究報告,No.114(Jan.2008)p.45-50
J.Vet.Med.Sci.,Vol.57,No.1(1995)p.59-63
調査した分野 C12N 15/00-15/90
C12Q 1/68
CAplus/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN)
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII)
WPI
特許請求の範囲 【請求項1】
下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がGallinarumであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(4)に記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(4)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がGallinarumであると示される工程。
(1)配列番号:21に記載の塩基配列において2067番目~2711番目の塩基からなる配列からなるDNA又は配列番号:109に記載の塩基配列からなるDNA
(2)配列番号:22に記載の塩基配列において1415番目~2152番目の塩基からなる配列からなるDNA又は配列番号:110に記載の塩基配列からなるDNA
(3)配列番号:23に記載の塩基配列において760番目~1722番目の塩基からなる配列からなるDNA
(4)配列番号:24に記載の塩基配列において1番目~453番目の塩基からなる配列からなるDNA又は配列番号:111に記載の塩基配列からなるDNA
【請求項2】
配列番号:21に記載の塩基配列において2067番目~2711番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:22に記載の塩基配列において1415番目~2152番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:23に記載の塩基配列において760番目~1722番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:24に記載の塩基配列において1番目~453番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:109に記載の塩基配列からなるDNAが、配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:110に記載の塩基配列からなるDNAが、配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:111に記載の塩基配列からなるDNAが、配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅される、
請求項1に記載の方法。
【請求項3】
下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項4】
請求項に記載のセットを含有するサルモネラの血清型判別用キット。
【請求項5】
Salmonella GallinarumのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、下記(v)のセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物;
(v)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項6】
以下(11)から(13)を含むセット;
(11)配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(12)配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(13)配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項7】
請求項に記載のセットを含有するサルモネラの血清型判別用キット。
【請求項8】
Salmonella GallinarumのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、下記(11)から(13)を含むセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物;
(11)配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(12)配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(13)配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
本発明は、血清型特異的遺伝子の多重検出によるサルモネラ血清型の迅速同定法に関する。
【背景技術】
【0002】
サルモネラ感染は家畜生産の阻害要因であるのみならず、畜産物を介してヒトに食中毒を起こすことから、公衆衛生上の脅威ともなっている。サルモネラは飼料を介して伝播するため、飼料安全法で有害微生物として規定されている。このため、農林水産消費安全技術センター・肥飼料安全検査部では飼料のサルモネラ汚染のモニタリング調査を継続的に実施している。
分離されたサルモネラが、家畜伝染病予防法で「家畜伝染病」または「届出伝染病」と規定している主要6血清型(Gallinarum、Typhimurium、Dublin、Enteritidis、Choleraesuis、Abortusequi)であるか否かでその後の対応が異なるため、血清型の特定が必須である。また、2004年にと畜場法が改正され、食肉衛生検査所では、肉眼病変の認められた材料について上記の6血清型のサルモネラ検査を行う必要がある。現行のサルモネラ血清型別法では判定までに2週間を必要とする。このため、飼料から上記6血清型のサルモネラが検出されても、その判定結果が出るまでに当該飼料が消費されてしまう可能性が高い。また、食肉衛生検査所では判定まで枝肉を保留する必要があるため、食品衛生上大きな問題となっている。以上のことから、飼料検査および食肉検査現場で、サルモネラの6血清型迅速同定法の開発が強く求められている。6血清型の迅速同定法が実用化されれば、家畜保健衛生所における日常検査、血清型別不能菌の同定、スクリーニング検査等へも応用可能である。畜産物の安全・安心を確保する上で、飼料および畜産物を汚染するサルモネラのリスク管理、および生産現場でのサルモネラ保菌動物の早期摘発・淘汰は、極めて重要である。
【先行技術文献】
【0003】

【非特許文献1】Agron P.G. et al. 2001. Identification by subtractive hybridization of sequences specific for Salmonella enterica Serovar Enteritidis. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4984-4991.
【非特許文献2】Kim H.J. et al. 2006. Identification of Salmonella enterica serovar Typhimurium using specific PCR primers obtained by comparative genomics in Salmonella serovars. J. Food Prot. 69: 1653-1661.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
サルモネラは生化学的性状、DNAの相同性等から1属2菌種6亜種に分類されている。この国際命名規約上の分類とは別にサルモネラでは菌体(O)抗原と鞭毛(H)抗原の組み合わせによる血清型分類が早くから確立しており、現在までに2,500を越す血清型が報告されている。通常、サルモネラの分離、同定に1週間、さらに血清型別分類を行うと1週間、すなわち血清型の特定までに合計2週間を必要とする。農林水産消費安全技術センターや各県の食肉衛生検査所では最初の1週間でサルモネラを分離、同定し、O群血清型まで決定しているが、本発明者は、この時点でPCR法等の手法を併用し、血清型に特異的な遺伝子を検出することで、従来2週間を要していた検査時間を1週間に短縮することが可能と考えた。即ち本発明は、サルモネラの血清型に特異的な遺伝子を多重検出することにより、サルモネラの血清型を迅速に同定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
2,500を超えるサルモネラ血清型のうち、1,500以上の血清型が亜種Iに分類され、この中にヒトや家畜にしばしば感染症を引き起こす血清型のほとんど含まれる。したがって我々が日常遭遇するサルモネラは互いに遺伝的類似度が極めて高く、これが塩基配列の違いを利用した血清型判別法開発の障壁となっていた。一方、細菌の全ゲノム塩基配列の最初の報告から10年以上が経過し、配列の報告された細菌は数百にのぼる。サルモネラでも、すでに20を超える菌株の全ゲノム塩基配列が参照可能である。そこで本発明者はまず、サルモネラ主要血清型に特異的な遺伝子をin silico(コンピューター上)で網羅的に抽出した。そして次に、本発明者が所有している3700株を超えるサルモネラ野外分離株を利用して、抽出された遺伝子の血清型特異性を検討した。その結果本発明者は、サルモネラ主要血清型に特異的な遺伝子を指標に、サルモネラ血清型の判別が可能であることを見出した。すなわち本発明は、血清型特異的遺伝子の多重検出によるサルモネラの血清型の迅速同定法に関し、以下〔1〕~〔23〕を提供するものである。
〔1〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型を判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(A)から(E)からなる群より選択される少なくとも1つに記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)工程(b)において
下記(A)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がTyphimuriumであると示され、
下記(B)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がCholeraesuisであると示され、
下記(C)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がEnteritidisであると示され、
下記(D)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がDublinであると示され、
下記(E)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がGallinarumであると示される工程、
(A)下記(1)~(4)に記載のDNA
(1)配列番号:1に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:2に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:3に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:4に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(B)下記(1)~(5)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:5に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:6に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:7に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:8に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:9に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(C)下記(1)~(5)に記載のDNAのうち少なくとも4つのDNA
(1)配列番号:10に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:11に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:12に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:13に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:14に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(D)下記(1)~(6)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:15に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:16に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:17に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:18に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:19に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(6)配列番号:20に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(E)下記(1)~(4)に記載のDNA
(1)配列番号:21に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:22に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:23に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔2〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(4)に記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(4)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると示される工程、
(1)配列番号:1に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:2に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:3に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:4に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔3〕下記(d)及び(e)の工程をさらに含む、〔2〕に記載の方法;
(d)サルモネラのO群血清型を判定する工程、及び
(e)工程(d)においてO群血清型がO4群と判定された場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると示される工程、
〔4〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がCholeraesuisであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(5)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(5)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がCholeraesuisであると示される工程、
(1)配列番号:5に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:6に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:7に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:8に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:9に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔5〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると示される工程、
(1)配列番号:10に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:11に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:12に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:13に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:14に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔6〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(6)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(6)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がDublinであると示される工程、
(1)配列番号:15に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:16に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:17に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:18に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:19に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(6)配列番号:20に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔7〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がGallinarumであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(4)に記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(4)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がGallinarumであると示される工程、
(1)配列番号:21に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:22に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:23に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔8〕配列番号:1~24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAとストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
〔9〕配列番号:25~72のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
〔10〕下記(i)から(v)からなる群より選択される少なくとも1つのセット;
(i)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(ii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:33に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:34に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:35に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:36に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:37に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:38に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:39に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:40に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:41に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:42に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも4つを含むセット
(1)配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iv)下記(1)から(6)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:53に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:54に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:55に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:56に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:57に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:58に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:59に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:60に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:61に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:62に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:63に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:64に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(v)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
〔11〕〔8〕又は〔9〕に記載のオリゴヌクレオチドを含有するサルモネラの血清型判別用キット、
〔12〕〔10〕に記載のセットを含有するサルモネラの血清型判別用キット、
〔13〕Salmonella Typhimurium、Salmonella Choleraesuis、Salmonella Enteritidis、Salmonella Dublin、及びSalmonella Gallinarumからなる群より選択されるいずれかのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、下記(i)から(v)からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物;
(i)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(ii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:33に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:34に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:35に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:36に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:37に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:38に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:39に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:40に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:41に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:42に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも4つを含むセット
(1)配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iv)下記(1)から(6)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:53に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:54に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:55に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:56に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:57に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:58に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:59に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:60に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:61に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:62に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:63に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:64に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(v)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
〔14〕配列番号:99~111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAとストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
〔15〕配列番号:73~98のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
〔16〕以下(1)から(13)からなる群より選択される少なくとも1組のセット;
(1)配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:75に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:76に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:77に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:78に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:79に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:80に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:81に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:82に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:83に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:84に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(7)配列番号:85に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:86に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(8)配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(9)配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(10)配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(11)配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(12)配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(13)配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
〔17〕〔15〕に記載のオリゴヌクレオチドを含有するサルモネラの血清型判別用キット、
〔18〕〔16〕に記載のセットを含有するサルモネラの血清型判別用キット、
〔19〕Salmonella Typhimurium、Salmonella Choleraesuis、Salmonella Enteritidis、Salmonella Dublin、及びSalmonella Gallinarumからなる群より選択されるいずれかのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、下記(1)から(13)からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物;
(1)配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:75に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:76に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:77に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:78に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:79に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:80に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:81に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:82に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:83に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:84に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(7)配列番号:85に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:86に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(8)配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(9)配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(10)配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(11)配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(12)配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(13)配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
〔20〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がCholeraesuisであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)配列番号:100~102に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅する工程、及び
(c)工程(b)においてDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がCholeraesuisであると示される工程、
〔21〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)配列番号:103~105に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅する工程、及び
(c)工程(b)においてDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると示される工程、
〔22〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)配列番号:106~108に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅する工程、及び
(c)工程(b)においてDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がDublinであると示される工程、
〔23〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)配列番号:109~111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅する工程、及び
(c)工程(b)においてDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がDublinであると示される工程。
【発明の効果】
【0006】
本発明により、血清型特異的遺伝子の多重検出によるサルモネラ血清型の迅速同定法が開発された。従来、サルモネラの血清型特定には2週間程度の時間を要していたため、血清型が特定される前に検査対象である飼料や食肉が消費されてしまう危険性があった。本発明を利用することにより、サルモネラの血清型特定に要する時間を1週間以上短縮することが可能であるため、このような危険性を回避することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明者は、サルモネラ主要血清型に特異的な遺伝子をin silicoで網羅的に抽出したところ、特定のサルモネラの血清型に特異的な遺伝子領域が存在すること、及び、該遺伝子領域を指標とすることにより、サルモネラの血清型の判別を行えることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものであり、下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型を判別する方法を提供する。
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程
(b)下記(A)から(E)からなる群より選択される少なくとも1つに記載のDNAを増幅する工程
(c)工程(b)において
下記(A)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がTyphimuriumであると示され、
下記(B)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がCholeraesuisであると示され、
下記(C)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がEnteritidisであると示され、
下記(D)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がDublinであると示され、
下記(E)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がGallinarumであると示される工程
ここで(A)から(E)は以下の通りである。
(A)下記(1)~(4)に記載のDNA
(1)配列番号:1に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:2に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:3に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:4に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(B)下記(1)~(5)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:5に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:6に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:7に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:8に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:9に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(C)下記(1)~(5)に記載のDNAのうち少なくとも4つのDNA
(1)配列番号:10に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:11に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:12に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:13に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:14に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(D)下記(1)~(6)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:15に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:16に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:17に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:18に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:19に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(6)配列番号:20に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(E)下記(1)~(4)に記載のDNA
(1)配列番号:21に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:22に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:23に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA

【0008】
本発明の方法は、サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程を含む。DNAの抽出は、当業者においては公知の方法によって行なうことができる。例えば、フェノール・クロロホルム法または市販のゲノムDNA抽出キットを用いて行うことができる。

【0009】
本発明の方法においては次いで、上記(A)から(E)からなる群より選択される少なくとも1つに記載のDNAを増幅する。具体的には、まず、上記(A)から(E)からなる群より選択される少なくとも1つに記載のDNAをPCRにより増幅するためのプライマーを設計する。当業者においては、鋳型となるDNAの配列情報に基づいて、適宜プライマーを設計することが可能である。例えば、プライマーの長さが20bp前後、Tm値が50~60℃程度になることが好ましいが、これに制限されるものではない。プライマーの設計は例えば、Primer3 (Rozen and Skaletsky, 2000, In: Krawets and Misener (eds.) Bioinfomatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, USA: Humana Press, 365-386)によって行うことができるが、これに限定されない。

【0010】
本発明のプライマーは、配列番号:1~24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAと特異的にハイブリダイズする。ここで「特異的に」ハイブリダイズするとは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第2版1989に記載の条件)において、配列番号:1~24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA以外のDNAとのクロスハイブリダイゼーションを有意に生じさせずにハイブリダイズすることを意味する。

【0011】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、0.1×SSC、0.1%SDSの条件であり、好ましくは50℃、0.1×SSC、0.1%SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、5×SSC及び0.1%SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に、高い相同性を有するDNAを効率的に得ることができる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

【0012】
本発明のプライマーは、好ましくは、配列番号:1~24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAに相補的な、連続する少なくとも15塩基、より好ましくは連続する少なくとも20塩基を含むオリゴヌクレオチドである。PCRにおいて、上記配列番号:1~24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅する場合には、通常、上記配列番号:1~24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを挟み込むように設定されたオリゴヌクレオチドのペア(プライマーセット)が用いられる。より具体的には、以下のプライマーセットをサルモネラの血清型に特異的な遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットとして用いることができるが、これらに限定されない。

【0013】
配列番号:1に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:2に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:3に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:4に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:5に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:33に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:34に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:6に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:35に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:36に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:7に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:37に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:38に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:8に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:39に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:40に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:9に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:41に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:42に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:10に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:11に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:12に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:13に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:14に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:15に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:53に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:54に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:16に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:55に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:56に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:17に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:57に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:58に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:18に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:59に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:60に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:19に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:61に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:62に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:20に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:63に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:64に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:21に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:22に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:23に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット

【0014】
なお配列番号:1に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:99に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:5に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:100に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:7に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:101に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:9に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:102に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:15に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:103に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:18に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:104に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:19に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:105に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:11に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:106に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:12に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:107に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:14に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:108に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:21に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:109に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:22に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:110に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:24に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:111に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。

【0015】
これらのサルモネラの血清型に特異的な遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットとして以下のセットを用いることができるが、これらに限定されない。
配列番号:99に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:100に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:75に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:76に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:101に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:77に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:78に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:102に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:79に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:80に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:103に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:81に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:82に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:104に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:83に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:84に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:105に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:85に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:86に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:106に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:107に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:108に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:109に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:110に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
また本発明には、配列番号:99~111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAに相補的な、連続する少なくとも15塩基、より好ましくは連続する少なくとも20塩基を含むプライマーも含まれる。

【0016】
本発明のプライマーは、配列番号:1~24、99~111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅しうる限り、該DNA領域に完全に相補的である必要はない。例えば、5'末端側に数ベース程度の他の塩基への置換変異を有する、もしくは5'末端側に任意の塩基が付加されたオリゴヌクレオチドであっても、本発明のプライマーとして利用することが可能である。

【0017】
本発明のプライマーは、さらに修飾することができる。たとえば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーも本発明の方法に使用することができる。

【0018】
設計されたプライマーは、その塩基配列情報に従って化学的に合成することができる。任意の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する方法が公知である。たとえば、オリゴヌクレオチドは、DNA合成装置(DNA synthesizer)によって合成することができる。具体的には、現在、ホスホロアミダイト法やホスホン酸エステル法などの原理に基づく、DNA合成装置が実用化されている。これらのDNA合成装置は、与えられた塩基配列にしたがって、固相上に、ヌクレオチドモノマーをひとつずつ化学的に連結する。全ての反応工程は自動化されていて、目的とする塩基配列情報を入力することで合成が開始される。したがって、このようなDNA合成装置に対して、設計したプライマーの塩基配列を与えることによって、目的とするDNAを合成することができる。

【0019】
次いで、サルモネラより抽出されたゲノムDNAを鋳型とし、合成したプライマーセットを用いてPCRを行う。PCR法としては、例えば、タッチダウンPCR法(Sato et al., 2005, DNA Res. 12, 301-364)、リアルタイムPCR法等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、当業者においては、その反応条件等について実験または経験によって最適な条件を適宜選択して実施することが可能である。通常、PCRは、反応液および耐熱性ポリメラーゼを含む市販の試薬キット(rTaq, ExTaq, Takara; BIOTAQ, BIOLINEなど)、および市販のPCR装置(GeneAmp(登録商標) PCR System 9700, ABIなど)等を利用して、簡便に実施することができる。

【0020】
本発明において、配列番号:1~24に記載の塩基配列の一部を含むDNAは特に制限されないが、例えば少なくとも50塩基以上、少なくとも100塩基以上、少なくとも500塩基以上、少なくとも1000塩基以上、少なくとも5000塩基以上の塩基を含むDNAが挙げられる。特に判定の容易さから、450から550の塩基を含むDNAが好ましい。450から550の塩基を含むDNAとしては例えば、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、又は550の塩基を含むDNAが挙げられるがこれらに限定されない。また50から350塩基を含むDNAが好ましい。このようなDNAの具体例として配列番号:99~111に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の配列番号:1~24に記載の塩基配列の一部を含むDNAには、ORF領域を含むDNA、非ORF領域を含むDNA、並びに、ORF領域及び非ORF領域を含むDNAが含まれる。
なお本発明の技術分野が属する比較ゲノム解析の分野では、ゲノムDNAを骨格配列と挿入配列に大別することができる。骨格配列とは主に微生物が生存するために必須の遺伝子群を含む領域で、近縁微生物種が共通に保有する配列である。挿入配列とはファージやトランスポゾンといった外来性の遺伝子に由来する配列であり、進化の過程の比較的新しい時期にゲノムに取り込まれたものと考えられる。挿入配列は一群の遺伝子が微生物ゲノム中に同時に取り込まれた可能性が高い。従って、挿入配列中の遺伝子がサルモネラの血清型に特異的な遺伝子である場合、同じ挿入配列中の他の遺伝子も血清型に特異的な遺伝子である可能性が高い。即ち本発明においては、配列番号:1~24に記載の塩基配列のいかなる部分配列もサルモネラの血清型に特異的な遺伝子と考えられる。

【0021】
配列番号:1に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:99に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
ST0280(STM0289): 329873-332062(配列番号:1に記載の塩基配列において、1番目~2190番目の塩基からなる配列)
ST0281(STM0290): 332086-332532(配列番号:1に記載の塩基配列において、2214番目~2660番目の塩基からなる配列)
ST0282(STM0291): 332551-336645(配列番号:1に記載の塩基配列において、2679番目~6773番目の塩基からなる配列)
ST0283(STM0292): 337095-337835(配列番号:1に記載の塩基配列において、7223番目~7963番目の塩基からなる配列)
ST0284(STM0293): 337829-338275(配列番号:1に記載の塩基配列において、7957番目~8403番目の塩基からなる配列)
ST0285(STM0294): 338838-339275(配列番号:1に記載の塩基配列において、8966番目~9403番目の塩基からなる配列)
ST0286(STM0294.1N): 339603-339328(配列番号:1に記載の塩基配列において、9456番目~9731番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSTMで始まる文言はNC_003197(Typhimurium)におけるlocus tagを示す。
*ST0283とST0284にはオーバーラップ有り。

【0022】
配列番号:2に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
ST0551(STM0571): 629330-632059(配列番号:2に記載の塩基配列において、1番目~2730番目の塩基からなる配列)
ST0552(STM0572): 633173-632187(配列番号:2に記載の塩基配列において、2858番目~3844番目の塩基からなる配列)
ST0553(STM0573): 634283-633240(配列番号:2に記載の塩基配列において、3911番目~4954番目の塩基からなる配列)
ST0554(STM0574): 635170-634316(配列番号:2に記載の塩基配列において、4987番目~5841番目の塩基からなる配列)
ST0555(STM0575): 635916-635173(配列番号:2に記載の塩基配列において、5844番目~6587番目の塩基からなる配列)
ST0556(STM0576): 636401-635931(配列番号:2に記載の塩基配列において、6602番目~7072番目の塩基からなる配列)
ST0557(STM0577): 636828-636379(配列番号:2に記載の塩基配列において、7050番目~7499番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSTMで始まる文言はNC_003197(Typhimurium)におけるlocus tagを示す。
*ST0556とST0557にはオーバーラップ有り。

【0023】
配列番号:3に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
ST3627(STM3752): 3949331-3948987(配列番号:3に記載の塩基配列において、1番目~345番目の塩基からなる配列)
ST3628(STM3753): 3950009-3951199(配列番号:3に記載の塩基配列において、1023番目~2213番目の塩基からなる配列)
ST3629(STM3754): 3951196-3951546(配列番号:3に記載の塩基配列において、2210番目~2560番目の塩基からなる配列)
ST3630(STM3755): 3951733-3952770(配列番号:3に記載の塩基配列において、2747番目~3784番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSTMで始まる文言はNC_003197(Typhimurium)におけるlocus tagを示す。
*ST3628とST3629にはオーバーラップ有り。

【0024】
配列番号:4に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
ST4250(STM4416): 4656671-4658050(配列番号:4に記載の塩基配列において、1番目~1380番目の塩基からなる配列)
ST4251(STM4417): 4658541-4659374(配列番号:4に記載の塩基配列において、1871番目~2704番目の塩基からなる配列)
ST4252(STM4418): 4660858-4659425(配列番号:4に記載の塩基配列において、2755番目~4188番目の塩基からなる配列)
ST4253(STM4419): 4661317-4662753(配列番号:4に記載の塩基配列において、4647番目~6083番目の塩基からなる配列)
ST4254(STM4420): 4663915-4663106(配列番号:4に記載の塩基配列において、6436番目~7245番目の塩基からなる配列)
ST4255(STM4421): 4665445-4663940(配列番号:4に記載の塩基配列において、7270番目~8775番目の塩基からなる配列)
ST4256(STM4423): 4665886-4666710(配列番号:4に記載の塩基配列において、9216番目~10040番目の塩基からなる配列)
ST4257(STM4424.S): 4666985-4667890(配列番号:4に記載の塩基配列において、10315番目~11220番目の塩基からなる配列)
ST4258(STM4425): 4667909-4668919(配列番号:4に記載の塩基配列において、11239番目~12249番目の塩基からなる配列)
ST4259(STM4426): 4669016-4670359(配列番号:4に記載の塩基配列において、12346番目~13689番目の塩基からなる配列)
ST4260(STM4427): 4670360-4671193(配列番号:4に記載の塩基配列において、13690番目~14523番目の塩基からなる配列)
ST4261(STM4428): 4672356-4671190(配列番号:4に記載の塩基配列において、14520番目~15686番目の塩基からなる配列)
ST4262(STM4433): 4676890-4677912(配列番号:4に記載の塩基配列において、20220番目~21242番目の塩基からなる配列)
ST4263(STM4434): 4677985-4679211(配列番号:4に記載の塩基配列において、21315番目~22541番目の塩基からなる配列)
ST4264(STM4435): 4679372-4680187(配列番号:4に記載の塩基配列において、22702番目~23517番目の塩基からなる配列)
ST4265(STM4436): 4680240-4681124(配列番号:4に記載の塩基配列において、23570番目~24454番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSTMで始まる文言はNC_003197(Typhimurium)におけるlocus tagを示す。
*ST4260とST4261にはオーバーラップ有り。

【0025】
配列番号:5に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:100に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SC0970: 1090512-1090718(配列番号:5に記載の塩基配列において、1番目~207番目の塩基からなる配列)
SC0971: 1091683-1090751(配列番号:5に記載の塩基配列において、240番目~1172番目の塩基からなる配列)
SC0972: 1092153-1091680(配列番号:5に記載の塩基配列において、1169番目~1642番目の塩基からなる配列)
SC0973: 1092771-1092304(配列番号:5に記載の塩基配列において、1793番目~2260番目の塩基からなる配列)
SC0974: 1092942-1093352(配列番号:5に記載の塩基配列において、2431番目~2841番目の塩基からなる配列)
SC0975: 1093444-1094280(配列番号:5に記載の塩基配列において、2933番目~3769番目の塩基からなる配列)
SC0976: 1094277-1094972(配列番号:5に記載の塩基配列において、3766番目~4461番目の塩基からなる配列)
SC0977: 1094986-1095783(配列番号:5に記載の塩基配列において、4475番目~5272番目の塩基からなる配列)
SC0978: 1096303-1096542(配列番号:5に記載の塩基配列において、5792番目~6031番目の塩基からなる配列)
*SC0971とSC0972にはオーバーラップ有り。
*SC0975とSC0976にはオーバーラップ有り。

【0026】
配列番号:6に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SC1238: 1348838-1348575(配列番号:6に記載の塩基配列において、1番目~264番目の塩基からなる配列)
SC1239: 1348864-1349382(配列番号:6に記載の塩基配列において、290番目~808番目の塩基からなる配列)
SC1240: 1350481-1350789(配列番号:6に記載の塩基配列において、1907番目~2215番目の塩基からなる配列)
SC1241: 1351990-1350920(配列番号:6に記載の塩基配列において、2346番目~3416番目の塩基からなる配列)
SC1242: 1351955-1352248(配列番号:6に記載の塩基配列において、3381番目~3674番目の塩基からなる配列)
SC1243: 1354673-1352985(配列番号:6に記載の塩基配列において、4411番目~6099番目の塩基からなる配列)
SC1244: 1355857-1354892(配列番号:6に記載の塩基配列において、6318番目~7283番目の塩基からなる配列)
SC1245: 1355902-1356051(配列番号:6に記載の塩基配列において、7328番目~7477番目の塩基からなる配列)
SC1246: 1356958-1356605(配列番号:6に記載の塩基配列において、8031番目~8384番目の塩基からなる配列)
SC1247: 1357089-1357265(配列番号:6に記載の塩基配列において、8515番目~8691番目の塩基からなる配列)
*SC1241とSC1242にはオーバーラップ有り。

【0027】
配列番号:7に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:101に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SC2137: 2242043-2242762(配列番号:7に記載の塩基配列において、1番目~720番目の塩基からなる配列)
SC2138: 2243636-2242893(配列番号:7に記載の塩基配列において、851番目~1594番目の塩基からなる配列)
SC2139: 2243874-2243740(配列番号:7に記載の塩基配列において、1698番目~1832番目の塩基からなる配列)
SC2140: 2244460-2244086(配列番号:7に記載の塩基配列において、2044番目~2418番目の塩基からなる配列)
SC2141: 2245155-2244778(配列番号:7に記載の塩基配列において、2736番目~3113番目の塩基からなる配列)
SC2142: 2245956-2245567(配列番号:7に記載の塩基配列において、3525番目~3914番目の塩基からなる配列)
SC2143: 2247252-2247494(配列番号:7に記載の塩基配列において、5210番目~5452番目の塩基からなる配列)
SC2144: 2248246-2247881(配列番号:7に記載の塩基配列において、5839番目~6204番目の塩基からなる配列)
SC2145: 2249085-2248348(配列番号:7に記載の塩基配列において、6306番目~7043番目の塩基からなる配列)
SC2146: 2249646-2249113(配列番号:7に記載の塩基配列において、7071番目~7604番目の塩基からなる配列)
SC2147: 2250691-2250248(配列番号:7に記載の塩基配列において、8206番目~8649番目の塩基からなる配列)
SC2148: 2251657-2251238(配列番号:7に記載の塩基配列において、9196番目~9615番目の塩基からなる配列)
SC2149: 2252255-2252091(配列番号:7に記載の塩基配列において、10049番目~10213番目の塩基からなる配列)
SC2150: 2252930-2252313(配列番号:7に記載の塩基配列において、10271番目~10888番目の塩基からなる配列)

【0028】
配列番号:8に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SC3523(SC3527): 3725291-3724176(配列番号:8に記載の塩基配列において、1番目~1116番目の塩基からなる配列)
SC3524(SC3528): 3725428-3725264(配列番号:8に記載の塩基配列において、1089番目~1253番目の塩基からなる配列)
SC3525(SC3529): 3726424-3725471(配列番号:8に記載の塩基配列において、1296番目~2249番目の塩基からなる配列)
SC3526(SC3530): 3726653-3727534(配列番号:8に記載の塩基配列において、2478番目~3359番目の塩基からなる配列)
SC3527(SC3531): 3727648-3728466(配列番号:8に記載の塩基配列において、3473番目~4291番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSCで始まる文言はNC_006905におけるlocus tagを示す。
*SC3523とSC3524にはオーバーラップ有り。

【0029】
配列番号:9に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:102に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SC4339(SC4343): 4646619-4647488(配列番号:9に記載の塩基配列において、1番目~870番目の塩基からなる配列)
SC4340(SC4344): 4648534-4648704(配列番号:9に記載の塩基配列において、1916番目~2086番目の塩基からなる配列)
SC4341(SC4345): 4649364-4648993(配列番号:9に記載の塩基配列において、2375番目~2746番目の塩基からなる配列)
SC4342(SC4346): 4649947-4650324(配列番号:9に記載の塩基配列において、3329番目~3706番目の塩基からなる配列)
SC4343(SC4347): 4651313-4650642(配列番号:9に記載の塩基配列において、4024番目~4695番目の塩基からなる配列)
SC4344(SC4348): 4651851-4651600(配列番号:9に記載の塩基配列において、4982番目~5233番目の塩基からなる配列)
SC4345(SC4349): 4652868-4652038(配列番号:9に記載の塩基配列において、5420番目~6250番目の塩基からなる配列)
SC4346(SC4350): 4654170-4653805(配列番号:9に記載の塩基配列において、7187番目~7552番目の塩基からなる配列)
SC4347(SC4351): 4654491-4655762(配列番号:9に記載の塩基配列において、7873番目~9144番目の塩基からなる配列)
SC4348(SC4352): 4655773-4657860(配列番号:9に記載の塩基配列において、9155番目~11242番目の塩基からなる配列)
SC4349(SC4353): 4658481-4659503(配列番号:9に記載の塩基配列において、11863番目~12885番目の塩基からなる配列)
SC4350(SC4354): 4660161-4661036(配列番号:9に記載の塩基配列において、13543番目~14418番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSCで始まる文言はNC_006905(Choleraesuis)におけるlocus tagを示す。

【0030】
配列番号:10に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これに限定されない。
SEN0216: 249114-252176(配列番号:10に記載の塩基配列において、1番目~3063番目の塩基からなる配列)

【0031】
配列番号:11に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:106に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SEN0910: 1013812-1014441(配列番号:11に記載の塩基配列において、1番目~630番目の塩基からなる配列)
SEN0911: 1014335-1015051(配列番号:11に記載の塩基配列において、524番目~1240番目の塩基からなる配列)
*SEN0910とSEN0911にはオーバーラップ有り。

【0032】
配列番号:12に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:107に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これに限定されない。
SEN1006: 1110476-1110946(配列番号:12に記載の塩基配列において、1番目~471番目の塩基からなる配列)

【0033】
配列番号:13に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SEN1432: 1520207-1520926(配列番号:13に記載の塩基配列において、1番目~720番目の塩基からなる配列)
SEN1433: 1521017-1522129(配列番号:13に記載の塩基配列において、811番目~1923番目の塩基からなる配列)
SEN1434: 1522077-1523636(配列番号:13に記載の塩基配列において、1871番目~3430番目の塩基からなる配列)
SEN1435: 1523522-1524289(配列番号:13に記載の塩基配列において、3316番目~4083番目の塩基からなる配列)
SEN1436: 1524621-1525880(配列番号:13に記載の塩基配列において、4415番目~5674番目の塩基からなる配列)
*SEN1433とSEN1434にはオーバーラップ有り。
*SEN1434とSEN1435にはオーバーラップ有り。

【0034】
配列番号:14に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:108に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これに限定されない。
SEN2420: 2550140-2550748(配列番号:14に記載の塩基配列において、1番目~609番目の塩基からなる配列)

【0035】
配列番号:15に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:103に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SD1749: 46331-47743(配列番号:15に記載の塩基配列において、1番目~1413番目の塩基からなる配列)
SD1750: 47745-48473(配列番号:15に記載の塩基配列において、1415番目~2143番目の塩基からなる配列)
SD1751: 48479-51214(配列番号:15に記載の塩基配列において、2149番目~4884番目の塩基からなる配列)
SD1752: 51227-51985(配列番号:15に記載の塩基配列において、4897番目~5655番目の塩基からなる配列)
SD1753: 51990-53321(配列番号:15に記載の塩基配列において、5660番目~6991番目の塩基からなる配列)
SD1754: 53324-53857(配列番号:15に記載の塩基配列において、6994番目~7527番目の塩基からなる配列)
SD1755: 53854-55152(配列番号:15に記載の塩基配列において、7524番目~8822番目の塩基からなる配列)
SD1756: 55165-56259(配列番号:15に記載の塩基配列において、8835番目~9929番目の塩基からなる配列)
SD1757: 56217-58070(配列番号:15に記載の塩基配列において、9887番目~11740番目の塩基からなる配列)
SD1758: 58075-58491(配列番号:15に記載の塩基配列において、11745番目~12161番目の塩基からなる配列)
SD1759: 58488-59960(配列番号:15に記載の塩基配列において、12158番目~13630番目の塩基からなる配列)
SD1760: 60030-60161(配列番号:15に記載の塩基配列において、13700番目~13831番目の塩基からなる配列)
SD1761: 60251-60763(配列番号:15に記載の塩基配列において、13921番目~14433番目の塩基からなる配列)
SD1762: 60811-60990(配列番号:15に記載の塩基配列において、14481番目~14660番目の塩基からなる配列)
SD1763: 61384-61902(配列番号:15に記載の塩基配列において、15054番目~15572番目の塩基からなる配列)
SD1764: 62124-64238(配列番号:15に記載の塩基配列において、15794番目~17908番目の塩基からなる配列)
*SD1754とSD1755にはオーバーラップ有り。
*SD1756とSD1757にはオーバーラップ有り。
*SD1758とSD1759にはオーバーラップ有り。

【0036】
配列番号:16に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SD2163: 110203-111366(配列番号:16に記載の塩基配列において、1番目~1164番目の塩基からなる配列)
SD2164: 112411-112692(配列番号:16に記載の塩基配列において、2209番目~2490番目の塩基からなる配列)
SD2165: 112685-113299(配列番号:16に記載の塩基配列において、2483番目~3097番目の塩基からなる配列)
*SD2164とSD2165にはオーバーラップ有り。

【0037】
配列番号:17に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これに限定されない。
SD2881: 26113-27609(配列番号:17に記載の塩基配列において、1番目~1497番目の塩基からなる配列)

【0038】
配列番号:18に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:104に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SD3914: 9282-9398(配列番号:18に記載の塩基配列において、1番目~117番目の塩基からなる配列)
SD3915: 9460-10434(配列番号:18に記載の塩基配列において、179番目~1153番目の塩基からなる配列)
SD3916: 10424-11695(配列番号:18に記載の塩基配列において、1143番目~2414番目の塩基からなる配列)
SD3917: 11695-13125(配列番号:18に記載の塩基配列において、2414番目~3844番目の塩基からなる配列)
SD3918: 13097-13972(配列番号:18に記載の塩基配列において、3816番目~4691番目の塩基からなる配列)
SD3919: 13973-15547(配列番号:18に記載の塩基配列において、4692番目~6266番目の塩基からなる配列)
SD3920: 15595-16440(配列番号:18に記載の塩基配列において、6314番目~7159番目の塩基からなる配列)
SD3921: 16506-17489(配列番号:18に記載の塩基配列において、7225番目~8208番目の塩基からなる配列)
SD3922: 17554-18039(配列番号:18に記載の塩基配列において、8273番目~8758番目の塩基からなる配列)
SD3923: 18052-18477(配列番号:18に記載の塩基配列において、8771番目~9196番目の塩基からなる配列)
SD3924: 18474-18905(配列番号:18に記載の塩基配列において、9193番目~9624番目の塩基からなる配列)
SD3925: 18889-19827(配列番号:18に記載の塩基配列において、9608番目~10546番目の塩基からなる配列)
SD3926: 19832-21226(配列番号:18に記載の塩基配列において、10551番目~11945番目の塩基からなる配列)
SD3927: 21230-21667(配列番号:18に記載の塩基配列において、11949番目~12386番目の塩基からなる配列)
SD3928: 21667-22254(配列番号:18に記載の塩基配列において、12386番目~12973番目の塩基からなる配列)
SD3929: 22263-22394(配列番号:18に記載の塩基配列において、12982番目~13113番目の塩基からなる配列)
SD3930: 22378-24432(配列番号:18に記載の塩基配列において、13097番目~15151番目の塩基からなる配列)
SD3931: 24432-24929(配列番号:18に記載の塩基配列において、15151番目~15648番目の塩基からなる配列)
SD3932: 25145-25420(配列番号:18に記載の塩基配列において、15864番目~16139番目の塩基からなる配列)
SD3933: 25513-26472(配列番号:18に記載の塩基配列において、16232番目~17191番目の塩基からなる配列)
SD3934: 26469-27185(配列番号:18に記載の塩基配列において、17188番目~17904番目の塩基からなる配列)
SD3935: 27257-27514(配列番号:18に記載の塩基配列において、17976番目~18233番目の塩基からなる配列)
*SD3915とSD3916にはオーバーラップ有り。
*SD3916とSD3917にはオーバーラップ有り。
*SD3917とSD3918にはオーバーラップ有り。
*SD3923とSD3924にはオーバーラップ有り。
*SD3924とSD3925にはオーバーラップ有り。
*SD3927とSD3928にはオーバーラップ有り。
*SD3929とSD3930にはオーバーラップ有り。
*SD3930とSD3931にはオーバーラップ有り。
*SD3933とSD3934にはオーバーラップ有り。

【0039】
配列番号:19に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:105に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SD4771: 3202-3501(配列番号:19に記載の塩基配列において、1番目~300番目の塩基からなる配列)
SD4772: 4162-4554(配列番号:19に記載の塩基配列において、961番目~1353番目の塩基からなる配列)
SD4773: 4538-5014(配列番号:19に記載の塩基配列において、1337番目~1813番目の塩基からなる配列)
SD4774: 5018-5374(配列番号:19に記載の塩基配列において、1817番目~2173番目の塩基からなる配列)
*SD4772とSD4773にはオーバーラップ有り。

【0040】
配列番号:20に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SD4777: 364-615(配列番号:20に記載の塩基配列において、1番目~252番目の塩基からなる配列)
SD4778: 1045-1608(配列番号:20に記載の塩基配列において、682番目~1245番目の塩基からなる配列)
SD4779: 1607-1963(配列番号:20に記載の塩基配列において、1244番目~1600番目の塩基からなる配列)
SD4780: 2021-2848(配列番号:20に記載の塩基配列において、1658番目~2485番目の塩基からなる配列)
SD4781: 2985-3524(配列番号:20に記載の塩基配列において、2622番目~3161番目の塩基からなる配列)
SD4782: 3595-4332(配列番号:20に記載の塩基配列において、3232番目~3969番目の塩基からなる配列)
SD4783: 4374-4805(配列番号:20に記載の塩基配列において、4011番目~4442番目の塩基からなる配列)
SD4784: 4809-5558(配列番号:20に記載の塩基配列において、4446番目~5195番目の塩基からなる配列)
*SD4778とSD4779にはオーバーラップ有り。

【0041】
配列番号:21に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:109に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SG0263: 306318-307190(配列番号:21に記載の塩基配列において、1番目~873番目の塩基からなる配列)
SG0264: 307461-308006(配列番号:21に記載の塩基配列において、1144番目~1689番目の塩基からなる配列)
SG0265: 307747-308286(配列番号:21に記載の塩基配列において、1430番目~1969番目の塩基からなる配列)
SG0266: 308384-309028(配列番号:21に記載の塩基配列において、2067番目~2711番目の塩基からなる配列)
SG0267: 309025-309396(配列番号:21に記載の塩基配列において、2708番目~3079番目の塩基からなる配列)
SG0268: 309368-309772(配列番号:21に記載の塩基配列において、3051番目~3455番目の塩基からなる配列)
SG0269: 309754-309975(配列番号:21に記載の塩基配列において、3437番目~3658番目の塩基からなる配列)
SG0270: 309972-310262(配列番号:21に記載の塩基配列において、3655番目~3945番目の塩基からなる配列)
SG0271: 310278-310757(配列番号:21に記載の塩基配列において、3961番目~4440番目の塩基からなる配列)
SG0272: 310768-311226(配列番号:21に記載の塩基配列において、4451番目~4909番目の塩基からなる配列)
SG0273: 311308-311832(配列番号:21に記載の塩基配列において、4991番目~5515番目の塩基からなる配列)
SG0274: 311843-312097(配列番号:21に記載の塩基配列において、5526番目~5780番目の塩基からなる配列)
SG0275: 312097-312915(配列番号:21に記載の塩基配列において、5780番目~6598番目の塩基からなる配列)
SG0276: 313021-313296(配列番号:21に記載の塩基配列において、6704番目~6979番目の塩基からなる配列)
SG0277: 313366-313779(配列番号:21に記載の塩基配列において、7049番目~7462番目の塩基からなる配列)
SG0278: 314053-314592(配列番号:21に記載の塩基配列において、7736番目~8275番目の塩基からなる配列)
SG0279: 314655-315107(配列番号:21に記載の塩基配列において、8338番目~8790番目の塩基からなる配列)
SG0280: 315104-315556(配列番号:21に記載の塩基配列において、8787番目~9239番目の塩基からなる配列)
SG0281: 315593-316159(配列番号:21に記載の塩基配列において、9276番目~9842番目の塩基からなる配列)
SG0282: 316156-316869(配列番号:21に記載の塩基配列において、9839番目~10552番目の塩基からなる配列)
SG0283: 317130-317591(配列番号:21に記載の塩基配列において、10813番目~11274番目の塩基からなる配列)
SG0284: 317604-318005(配列番号:21に記載の塩基配列において、11287番目~11688番目の塩基からなる配列)
SG0285: 318319-318417(配列番号:21に記載の塩基配列において、12002番目~12100番目の塩基からなる配列)
SG0286: 318423-318779(配列番号:21に記載の塩基配列において、12106番目~12462番目の塩基からなる配列)
SG0287: 319143-321761(配列番号:21に記載の塩基配列において、12826番目~15444番目の塩基からなる配列)
SG0288: 321869-322303(配列番号:21に記載の塩基配列において、15552番目~15986番目の塩基からなる配列)
SG0289: 322340-324028(配列番号:21に記載の塩基配列において、16023番目~17711番目の塩基からなる配列)
SG0290: 324025-325548(配列番号:21に記載の塩基配列において、17708番目~19231番目の塩基からなる配列)
SG0291: 325866-327722(配列番号:21に記載の塩基配列において、19549番目~21405番目の塩基からなる配列)
SG0292: 328069-329589(配列番号:21に記載の塩基配列において、21752番目~23272番目の塩基からなる配列)
SG0293: 329893-330726(配列番号:21に記載の塩基配列において、23576番目~24409番目の塩基からなる配列)
SG0294: 330474-331238(配列番号:21に記載の塩基配列において、24157番目~24921番目の塩基からなる配列)
SG0295: 331606-332244(配列番号:21に記載の塩基配列において、25289番目~25927番目の塩基からなる配列)
SG0296: 332241-334406(配列番号:21に記載の塩基配列において、25924番目~28089番目の塩基からなる配列)
SG0297: 334372-334737(配列番号:21に記載の塩基配列において、28055番目~28420番目の塩基からなる配列)
SG0298: 335047-335123(配列番号:21に記載の塩基配列において、28730番目~28805番目の塩基からなる配列)
SG0299: 335505-335837(配列番号:21に記載の塩基配列において、29188番目~29520番目の塩基からなる配列)
*SG0264とSG0265にはオーバーラップ有り。
*SG0266とSG0267にはオーバーラップ有り。
*SG0267とSG0268にはオーバーラップ有り。
*SG0268とSG0269にはオーバーラップ有り。
*SG0269とSG0270にはオーバーラップ有り。
*SG0274とSG0275にはオーバーラップ有り。
*SG0279とSG0280にはオーバーラップ有り。
*SG0281とSG0282にはオーバーラップ有り。
*SG0289とSG0290にはオーバーラップ有り。
*SG0293とSG0294にはオーバーラップ有り。
*SG0295とSG0296にはオーバーラップ有り。
*SG0296とSG0297にはオーバーラップ有り。

【0042】
配列番号:22に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:110に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SG1032: 1119872-1121167(配列番号:22に記載の塩基配列において、1番目~1296番目の塩基からなる配列)
SG1033: 1121286-1122023(配列番号:22に記載の塩基配列において、1415番目~2152番目の塩基からなる配列)
SG1034: 1122020-1124683(配列番号:22に記載の塩基配列において、2149番目~4812番目の塩基からなる配列)
SG1035: 1124696-1125454(配列番号:22に記載の塩基配列において、4825番目~5583番目の塩基からなる配列)
SG1036: 1125459-1126790(配列番号:22に記載の塩基配列において、5588番目~6919番目の塩基からなる配列)
SG1037: 1126793-1127326(配列番号:22に記載の塩基配列において、6922番目~7455番目の塩基からなる配列)
SG1038: 1127323-1128621(配列番号:22に記載の塩基配列において、7452番目~8750番目の塩基からなる配列)
SG1039: 1128634-1129728(配列番号:22に記載の塩基配列において、8763番目~9857番目の塩基からなる配列)
SG1040: 1129686-1131599(配列番号:22に記載の塩基配列において、9815番目~11728番目の塩基からなる配列)
SG1041: 1131957-1133429(配列番号:22に記載の塩基配列において、12086番目~13558番目の塩基からなる配列)
SG1042: 1133720-1134232(配列番号:22に記載の塩基配列において、13849番目~14361番目の塩基からなる配列)
SG1043: 1134853-1135371(配列番号:22に記載の塩基配列において、14982番目~15500番目の塩基からなる配列)
SG1044: 1135581-1137704(配列番号:22に記載の塩基配列において、15710番目~17833番目の塩基からなる配列)
SG1045: 1137713-1141114(配列番号:22に記載の塩基配列において、17842番目~21243番目の塩基からなる配列)
SG1046: 1141142-1142204(配列番号:22に記載の塩基配列において、21271番目~22333番目の塩基からなる配列)
SG1047: 1142122-1142601(配列番号:22に記載の塩基配列において、22251番目~22730番目の塩基からなる配列)
*SG1033とSG1034にはオーバーラップ有り。
*SG1037とSG1038にはオーバーラップ有り。
*SG1039とSG1040にはオーバーラップ有り。
*SG1046とSG1047にはオーバーラップ有り。

【0043】
配列番号:23に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これらに限定されない。
SG1182: 1264348-1264776(配列番号:23に記載の塩基配列において、1番目~429番目の塩基からなる配列)
SG1183: 1265107-1266069(配列番号:23に記載の塩基配列において、760番目~1722番目の塩基からなる配列)

【0044】
配列番号:24に記載の塩基配列の一部を含むDNAとしては、配列番号:111に記載の塩基配列を含むDNAの他、例えば下記のORFの全部又は一部を含むDNAを挙げることができるが、これに限定されない。
SG3181: 3319694-3320146(配列番号:24に記載の塩基配列において、1番目~453番目の塩基からなる配列)

【0045】
本発明においては、
上記(A)のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると判別される。
上記(B)のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がCholeraesuisであると判別される。
上記(C)のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると判別される。
上記(D)のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がDublinであると判別される。
上記(E)のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がGallinarumであると判別される。

【0046】
DNAが増幅されたか否かは、当業者においては種々の方法によって判定することができる。例えば、PCRによって増幅されたPCR産物(増幅産物)の分子サイズを測定することにより、DNAが増幅されたか否かを判定することができる。PCRによって増幅されたPCR産物の分子サイズを測定する方法としては、当業者に周知の方法が挙げられる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる方法、アガロースゲル電気泳動を用いる方法、フラグメントアナライザーを用いる方法、マイクロチップ電気泳動装置を用いる方法(Multina, 島津)が例示できるが、これらに限定されるものではない。またリアルタイムPCR法を使用した場合、蛍光強度を指標としてPCR産物(増幅産物)の増加量を即時に検出することが可能である。

【0047】
具体的には、PCR産物を蛍光ラベルした後にキャピラリー電気泳動で分離し、分離された各々のPCR産物の分子サイズを測定する。あるいは、PCR産物を(ポリアクリルアミドゲル/アガロースゲルで)電気泳動で分離し、分離された各々のPCR産物の分子サイズを測定する。通常、予めサイズが既知のDNA断片(例えば、サイズマーカー)を対照として、分離された各々のPCR産物の分子サイズ(例えば、分子量や長さ)を測定する。次いで、分子サイズによってPCR産物を分類し、PCR産物の種類を特定する。

【0048】
またDNAが増幅されたか否かは、増幅されたDNAの塩基配列を決定することにより判定することも可能である。増幅したDNA断片の塩基配列の決定は、当業者においては、DNAシークエンサー等を用いて容易に実施することができる。

【0049】
なお本発明においては、
配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAをSTR1、
配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNAをSTR2、
配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAをSTR3、
配列番号:4に記載の塩基配列からなるDNAをSTR4、
配列番号:5に記載の塩基配列からなるDNAをSCR1、
配列番号:6に記載の塩基配列からなるDNAをSCR2、
配列番号:7に記載の塩基配列からなるDNAをSCR3、
配列番号:8に記載の塩基配列からなるDNAをSCR4、
配列番号:9に記載の塩基配列からなるDNAをSCR5、
配列番号:10に記載の塩基配列からなるDNAをSER1、
配列番号:11に記載の塩基配列からなるDNAをSER2、
配列番号:12に記載の塩基配列からなるDNAをSER3、
配列番号:13に記載の塩基配列からなるDNAをSER4、
配列番号:14に記載の塩基配列からなるDNAをSER5、
配列番号:15に記載の塩基配列からなるDNAをSDR1、
配列番号:16に記載の塩基配列からなるDNAをSDR2、
配列番号:17に記載の塩基配列からなるDNAをSDR3、
配列番号:18に記載の塩基配列からなるDNAをSDR4、
配列番号:19に記載の塩基配列からなるDNAをSDR5、
配列番号:20に記載の塩基配列からなるDNAをSDR6、
配列番号:21に記載の塩基配列からなるDNAをSGR1、
配列番号:22に記載の塩基配列からなるDNAをSGR2、
配列番号:23に記載の塩基配列からなるDNAをSGR3、
配列番号:24に記載の塩基配列からなるDNAをSGR4、
と称することも出来る。Typhimurium、Choleraesuis、Enteritidis、Dublin、及びGallinarumの各血清型のサルモネラゲノム上におけるSTR1~SGR4の位置、ORFの数等は実施例に記載の表1に示されている。

【0050】
また本発明の「サルモネラの血清型を判定する方法」は、「サルモネラの血清型がTyphimurium、Choleraesuis、Enteritidis、Dublin、Gallinarumからなる群より選択されるいずれかであるか否かを判別する方法」と表現することも出来る。

【0051】
本発明のサルモネラの血清型を判定する方法は、サルモネラ血清型別法と併用して実施することが可能である。サルモネラの血清型別(中村明子、1988、臨床と微生物、15、62-68)は当業者であれば市販の免疫血清(例えばデンカ生研株式会社製サルモネラ免疫血清「生研」シリーズ)を用い、添付の指示書に従って適宜行うことができる。

【0052】
また本発明は、下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別する方法を提供する。
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(4)に記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(4)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると示される工程。
ここで(1)~(4)は以下の通りである。
(1)配列番号:1に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:2に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:3に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:4に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA

【0053】
本発明のサルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別する方法において、DNAの抽出、DNAの増幅は上述の方法によって行うことが可能である。
なお本発明のサルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別する方法においては、血清型がMbandakaであるサルモネラにおいて、上記(1)~(4)に記載のDNAの増幅産物が得られる場合がある。TyphimuriumとMbandakaについてはO群血清型別で識別可能であることから、これら4遺伝子の多重検出とO群血清型別の組み合わせにより、サルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別することが可能である。即ち本発明のサルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別する方法は、さらに下記(d)及び(e)に記載の工程を含んでもよい。
(d)サルモネラのO群血清型を判定する工程、及び
(e)工程(d)においてO群血清型がO4群と判定された場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると示される工程

【0054】
サルモネラのO群血清型の判定は、市販の免疫血清(例えばデンカ生研株式会社製サルモネラ免疫血清「生研」シリーズ)を用い、添付の指示書に従って行うことが可能である。本発明においては、O群血清型がO4群である場合にサルモネラの血清型がTyphimuriumであると判別され、O群血清型がO7群である場合にサルモネラの血清型がMbandakaであると判別される。

【0055】
また本発明は、下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がCholeraesuisであるか否かを判別する方法を提供する。
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(5)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(5)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がCholeraesuisであると示される工程。
ここで(1)~(5)は以下の通りである。
(1)配列番号:5に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:6に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:7に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:8に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:9に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA

【0056】
本発明のサルモネラの血清型がCholeraesuisであるか否かを判別する方法において、DNAの抽出、DNAの増幅は上述の方法によって行うことが可能である。

【0057】
また本発明は、下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法を提供する。
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると示される工程。
ここで(1)~(5)は以下の通りである。
(1)配列番号:10に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:11に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:12に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:13に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:14に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA

【0058】
本発明のサルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法において、DNAの抽出、DNAの増幅は上述の方法によって行うことが可能である。
なお本発明のサルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法においては、血清型がBlegdamであるサルモネラにおいて、上記(1)~(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAの増幅産物が得られる場合がある。これは、血清型EnteritidisとBlegdamは遺伝的類似度が極めて高いと考えられるためである。しかしながら、血清型がBlegdamであるサルモネラは極めて分離頻度の低いサルモネラであることから、実際にサルモネラの血清型を判別する場面においては、(1)~(5)からなる群より選択される少なくとも4遺伝子領域が増幅された場合、Enteritidisである可能性が極めて高いと考えることが可能である。

【0059】
なお血清型EnteritidisとBlegdamは、1相H抗原の型別を行うことにより識別することが可能である。1相H抗原の型別がg,mである場合に血清型がEnteritidisであると判定され、g,m,qである場合にBlegdamであると判定される。すなわち本発明は、上記(a)から(c)の工程に加え下記(d)及び(e)に記載の工程を含んでもよい。
(d)サルモネラの1相H抗原の型別を判定する工程、及び
(e)工程(d)において1相H抗原の型別がg,mと判定された場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると示される工程
サルモネラの1相H抗原の型別の判定は、市販の免疫血清(例えばデンカ生研株式会社製サルモネラ免疫血清「生研」シリーズ)を用い、添付の指示書に従って行うことが可能である。

【0060】
また本発明は、下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別する方法を提供する。
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(6)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(6)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がDublinであると示される工程。
ここで(1)~(6)は以下の通りである。
(1)配列番号:15に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:16に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:17に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:18に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:19に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(6)配列番号:20に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA

【0061】
本発明のサルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別する方法において、DNAの抽出、DNAの増幅は上述の方法によって行うことが可能である。
なお本発明のサルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別する方法においては、血清型がRostock又はNaestvedであるサルモネラにおいて、上記(1)~(6)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAの増幅産物が得られる場合がある。しかしながら、血清型がRostock又はNaestvedであるサルモネラは極めて分離頻度の低いサルモネラであることから、実際にサルモネラの血清型を判別する場面においては、(1)~(6)からなる群より選択される少なくとも3遺伝子領域が増幅された場合、Dublinである可能性が極めて高いと考えることが可能である。

【0062】
なお血清型Dublin、Rostock、Naestvedは、1相H抗原の型別を行うことにより識別することが可能である。1相H抗原の型別がg,pである場合に血清型がDublinであると判定され、g,p,uである場合にRostockであると判定され、g,p,sである場合にNaestvedであると判定される。本発明においては、上記(a)から(c)の工程に加え下記(d)及び(e)に記載の工程を含んでもよい。
(d)サルモネラの1相H抗原の型別を判定する工程、及び
(e)工程(d)において1相H抗原の型別がg,pと判定された場合に、サルモネラの血清型がDublinsであると示される工程
サルモネラの1相H抗原の型別の判定は、上述の通り、市販の免疫血清(例えばデンカ生研株式会社製サルモネラ免疫血清「生研」シリーズ)を用い、添付の指示書に従って行うことが可能である。

【0063】
また本発明は、下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がGallinarumであるか否かを判別する方法を提供する。
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(5)に記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(5)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がGallinarumであると示される工程。
ここで(1)~(5)は以下の通りである。
(1)配列番号:21に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:22に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:23に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:25に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
本発明のサルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法において、DNAの抽出、DNAの増幅は上述の方法によって行うことが可能である。

【0064】
また本発明は、配列番号:1~24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAとストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。
また本発明は、配列番号:25から72のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、下記(i)から(v)からなる群より選択される少なくとも1組のセットを提供する。これらのオリゴヌクレオチド及びセットは、例えば、配列番号:1~24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅するためのプライマーとして有用である。

【0065】
(i)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(ii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:33に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:34に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:35に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:36に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:37に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:38に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:39に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:40に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:41に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:42に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも4つを含むセット
(1)配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iv)下記(1)から(6)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:53に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:54に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:55に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:56に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:57に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:58に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:59に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:60に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:61に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:62に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:63に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:64に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(v)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。

【0066】
例えば、サルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記(i)に記載のセットが例示できるがこれに限定されない。
例えば、サルモネラの血清型がCholeraesuisであるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記(ii)に記載のセットが例示できるがこれに限定されない。
例えば、サルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記(iii)に記載のセットが例示できるがこれに限定されない。
例えば、サルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記(iv)に記載のセットが例示できるがこれに限定されない。
例えば、サルモネラの血清型がGallinarumであるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記(v)に記載のセットが例示できるがこれに限定されない。

【0067】
また本発明は、配列番号:99から111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAとストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。より具体的には、配列番号:73から98のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、下記(a)から(m)からなる群より選択される少なくとも1組のセットを提供する。このようなオリゴヌクレオチド及びセットは、例えば、配列番号:99から111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅するためのプライマーとして有用である。
(a)配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(b)配列番号:75に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:76に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(c)配列番号:77に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:78に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(d)配列番号:79に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:80に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(e)配列番号:81に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:82に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(f)配列番号:83に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:84に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(g)配列番号:85に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:86に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(h)配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(i)配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(j)配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(k)配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(l)配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(m)配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット。

【0068】
上記(a)を含むセットは、サルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かの判別に有用である。
上記(b)~(d)を含むセットは、サルモネラの血清型がCholeraesuisであるか否かの判別に有用である。
上記(e)~(g)を含むセットは、サルモネラの血清型がDublinであるか否かの判別に有用である。
上記(h)~(j)を含むセットは、サルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かの判別に有用である。
上記(k)~(m)を含むセットは、サルモネラの血清型がGallinarumであるか否かの判別に有用である。

【0069】
また本発明は、サルモネラの血清型判別用試薬及びサルモネラの血清型判別用キットを提供する。このような試薬やキットには、少なくとも次の構成要素(I)又は(I´)のいずれか又は両方が含まれる。
(I)上記(A)から(E)からなる群より選択される少なくとも1つのDNAをPCRにより増幅するためのオリゴヌクレオチドのセット
このようなセットとしては、上記(i)から(v)に記載のセットが挙げられるが、これらに限定されない。
(I´)上記(a)から(m)からなる群より選択される少なくとも1つのDNAをPCRにより増幅するためのオリゴヌクレオチドのセット

【0070】
上記キットには、前記構成要素(I)又は(I´)のいずれか又は両方に加え、次のような付加的な要素を含むことができる。
(II)DNAポリメラーゼ:
本発明の試薬又はキットは、鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼを含むことができる。PCRなどの公知の核酸合成反応に利用されている種々のDNAポリメラーゼは、本発明に利用することができる。
(III)ヌクレオチド基質:
本発明の試薬又はキットは、核酸の相補鎖合成反応の基質として利用されるヌクレオチド類を含むことができる。具体的には、dCTP、dGTP、dTPT、およびdATPの少なくとも一つ、通常はこれらの全て(dNTP)をキットに含むことができる。これらのヌクレオチド類は、天然の構造のみならず、誘導体を利用することもできる。蛍光物資や結合性リガンドで修飾したヌクレオチド類が公知である。上記キットには、PCRにより増幅されたPCR産物のサイズが記載された書類を添付することができる。また、PCRにより増幅されたPCR産物のサイズ情報を機械読み取り可能なデータとし、それを格納した記録媒体としてキットに加えることもできる。

【0071】
さらに本発明は、Salmonella Typhimurium、Salmonella Choleraesuis、Salmonella Enteritidis、Salmonella Dublin、及びSalmonella Gallinarumからなる群より選択されるいずれかのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、上記(i)から(v)からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物を提供する。また本発明は、これらのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、上記(a)から(m)からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物を提供する。本発明のPCR産物は、サルモネラの血清型の判別に使用することが出来る。

【0072】
また本発明は、下記(a)に記載のPCR産物の種類、及び、下記(b)に記載のPCR産物の種類を比較する工程を含む被検サルモネラの血清型判別法であって、前記工程において比較したPCR産物の種類が一致したときに、被検サルモネラの血清型が、対照サルモネラの血清型と同一であると判別される方法を提供する。
(a)対照サルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、上記(i)から(v)からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物の種類であって、対照サルモネラに特異的なPCR産物の種類、
(b)被検サルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、(a)と同じセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物の種類。

【0073】
本発明において、「PCR産物の種類」とは、分子サイズによって分類されたPCR産物の種類(パターン)を意味し、「PCR産物の種類」は「PCRパターン」と表現することができる。

【0074】
なお本発明においては、上記(A)から(E)に記載のDNAを以下のように別の形式で表現することができる。
(A)下記(1)~(4)に記載のDNA
(1)配列番号:25に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:26に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:27に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:28に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
DNA
(3)配列番号:29に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:30に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
DNA
(4)配列番号:31に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:32に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(B)下記(1)~(5)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:33に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:34に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:35に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:36に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
DNA
(3)配列番号:37に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:38に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
DNA
(4)配列番号:39に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:40に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(5)配列番号:41に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:42に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(C)下記(1)~(5)に記載のDNAのうち少なくとも4つのDNA
(1)配列番号:43に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:44に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:45に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:46に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(3)配列番号:47に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:48に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(4)配列番号:49に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:50に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(5)配列番号:51に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:52に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(D)下記(1)~(6)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:53に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:54に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:55に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:56に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(3)配列番号:57に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:58に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(4)配列番号:59に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:60に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(5)配列番号:61に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:62に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(6)配列番号:63に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:64に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(E)下記(1)~(4)に記載のDNA
(1)配列番号:65に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:66に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:67に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:68に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(3)配列番号:69に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:70に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(4)配列番号:71に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:72に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA

【0075】
また配列番号:99から111に記載のDNAはそれぞれ、以下のように表現することができる。
(1)配列番号:73に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:74に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:75に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:76に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(3)配列番号:77に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:78に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(4)配列番号:79に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:80に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(5)配列番号:81に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:82に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(6)配列番号:83に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:84に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(7)配列番号:85に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:86に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(8)配列番号:87に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:88に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(9)配列番号:89に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:90に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(10)配列番号:91に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:92に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(11)配列番号:93に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:94に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(12)配列番号:95に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:96に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(13)配列番号:97に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:98に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA

【0076】
なお本発明においては、「含む」という文言の代わりに「からなる」という文言を使用することが出来る。
【実施例】
【0077】
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0078】
1.材料と方法
1.1 血清型Typhimurium(ST)及びCholeraesuis(SC)特異的塩基配列の特定
遺伝子データベース上に公開されているST LT2株及びSC SC-B67株の全ゲノム塩基配列を用いて2つの異なる手法で比較ゲノム解析を実施し、非共通領域に含まれる遺伝子を血清型特異的遺伝子の候補とした。この中から連続した遺伝子群を挿入配列とし、異なる挿入配列の中から1遺伝子を選び、遺伝子データベースを用いて相同性検索を実施することで血清型特異的遺伝子候補の絞り込みを行った。次に過去30年間にわたって収集した約3,700株の野外分離サルモネラの中から異なる事例に由来するST125株(表2-1~2-2)、SC29株(表3)、それ以外の118血清型(表7-1~7-5)から各1株を選び、これらのゲノムDNAを鋳型として上記遺伝子を検出するPCRを実施し、野外分離サルモネラにおける血清型特異的遺伝子候補保有率を調べた。
【実施例】
【0079】
1.2 血清型Dublin(SD)、Enteritidis(SE)、Gallinarum(SG)特異的塩基配列の特定
遺伝子データベース上に公開されているSD str.CT_02021853、SE NCTC13349、SG_NCTC13346の全ゲノム塩基配列データを用いてSDとSE及びSEとSGの間でオーソログ解析に基づく比較ゲノム解析を実施し、非オーソログ対応ORFを血清型特異的遺伝子の候補として抽出した。さらに、遺伝子データベースを用いて相同性検索を行い、血清型特異的遺伝子候補の絞り込みを行った。次に過去30年間にわたって収集した約3,700株の野外分離サルモネラの中から異なる事例に由来するSD、SE、SG、それぞれ162株(表4-1~4-3)、69株(表5)、13株(表6)を、それ以外の118血清型(表7-1~7-5)から各1株を選び、これらのゲノムDNAを鋳型として上記遺伝子を検出するPCRを実施し、野外分離サルモネラにおける血清型特異的遺伝子候補保有率を調べた。
【実施例】
【0080】
2.結果
2.1 ST及びSC特異的塩基配列の特定
MUMmerソフトウェアによる比較ゲノム解析で抽出した非共通領域には、ST LT2株で372の、SC-B67株で305のCDS配列を認めた。オーソログ解析に基づく比較ゲノム解析ではST LT2株で533の、SC-B67株で549の非一致ORFが抽出できた。これら遺伝子のうち挿入配列から1遺伝子を選び、相同性検索を実施し、他のサルモネラで登録のない遺伝子をST及びSCで、それぞれ4及び5個選び出した(表1)。
【実施例】
【0081】
ST遺伝子検出用プライマーペア(配列番号:25~32)を用いて4遺伝子の検出を試みたところ、各遺伝子の保有率はST 125株で全て100%、その他血清型118株で12.7~42.4%であった(表1、表8-1~8-3)。
SC遺伝子検出用プライマーペア5種(配列番号:33~42)を用いて同様の実験を行ったところ、各遺伝子の保有率はSC 29株で全て100%、その他血清型118株で0.8~5.9%であった(表1、表9-1~9-4)。
【実施例】
【0082】
ST遺伝子検出用プライマーペアでST以外の血清型118株を解析したとき、血清型Mbandaka(O6,7: z10: e,n,z15)及びO4:i:1,2で4遺伝子とも増幅陽性であった(表8-3)。O4: i: 1,2についてはSTが保有する血清型特異的病原性プラスミドを保有していたことから、STの単相変異株である可能性が考えられた。MbandakaについてはO群血清型別で識別可能であることから、これら4遺伝子の多重検出とO群血清型別の組み合わせにより、STの迅速同定が可能であることが示唆された。
一方、SC遺伝子検出用プライマーペア5種を用いてSC以外の血清型118株を解析したとき、3遺伝子以上で増幅陽性の株は認められなかった(表9)。これら5遺伝子の多重検出により、SCの迅速同定が可能であることが示唆された。
【実施例】
【0083】
またST遺伝子検出用プライマーペア(配列番号:73及び74)を用いてSTR1(ST0283)の検出を試みたところ、検出率は125株で全て100%、その他血清型118株で12.7%であった(表13)。
SC遺伝子検出用プライマーペア(配列番号:75~80)を用いて同様の実験を行ったところ、SCR1(SC0971)、SCR3(SC2145)、SCR5(SC4345)の検出率はSC 29株で全て100%、その他血清型118株でそれぞれ0.8、1.7、0.8%であった(表14)。
【実施例】
【0084】
2.2 血清型SD、SE、SG特異的塩基配列の特定
SDとSEの比較ゲノム解析ではSDで356の、SEで152の非一致ORFが、SEとSGの比較ゲノム解析ではSEで139の、SGで123の非一致ORFが抽出できた。これら遺伝子のうち挿入配列から1遺伝子を選び、相同性検索を実施し、他のサルモネラで登録のない遺伝子をSD、SE、SGで、それぞれ6、5、4個選び出した(表1)。
【実施例】
【0085】
SD遺伝子検出用プライマーペア(配列番号:53~64)を用いて、これら6遺伝子の検出を試みたところ、各遺伝子の保有率はSD162株で全て100%、その他の118血清型で5.9~15.3%であった(表1、表10-1~10-6)。
同様にSE検出用プライマー(配列番号:43~52)ではSE69株で全て100%、その他の118血清型で7.6~33.9%(表1、表11-1~11-5)、SG検出用プライマー(配列番号:65~72)ではSG13株で全て100%、その他の118血清型で9.3~13.6%の陽性率であった(表1、表12-1~12-2)。
【実施例】
【0086】
SD遺伝子検出用プライマーペアでSD以外の血清型118株を解析したとき、Rostock(O9:g,p,u:-)とNaestved(O9:g,p,s:-)で6遺伝子陽性であった(表10-4)。これらの血清型はSD(O9:g,p:-)と近縁であると考えられた。他に3遺伝子以上で増幅陽性の株は認められなかった(表10-1~10-6)。フォールスポジティブの可能性を残しているが、これら6遺伝子の多重検出によりSDの迅速同定が可能であると考えられた。
SE検出用プライマーペアでSE以外の血清型118株を解析したとき、Blegdam(O9:g,m,q:-)で5遺伝子陽性であった(表11-3)。この血清型はSE(O9:g,m:-)と近縁であると考えられた。他に4遺伝子以上で増幅陽性の株は認められなかった(表11-1~11-5)。フォールスポジティブの可能性を残しているが、これら5遺伝子の多重検出によりSEの迅速同定が可能と考えられた。
SG検出用プライマーペアでSG以外の血清型118株を解析したとき、4遺伝子で増幅陽性の株は認められなかった(表12-1~12-2)。これら4遺伝子の多重検出により、SGの迅速同定が可能と考えられた。
【実施例】
【0087】
またSD遺伝子検出用プライマーペア(配列番号:81~86)を用いてSDR1(SD1756)、SDR4(SD3920)、SDR5(SD4773)の検出を試みたところ、検出率はSD162株で全て100%、その他の118血清型でそれぞれ9.3、5.9、7.6%であった(表15)。
SE遺伝子検出用プライマーペア(配列番号:87~92)を用いて同様の実験を行ったところ、SER2(SE0910)、SER3(SE1006)、SER5(SE2420)の検出率はSE69株で全て100%、その他の118血清型でそれぞれ16.9、11.9、7.6%であった(表16)。
またSG遺伝子検出用プライマーペア(配列番号:93~98)を用いて同様の実験を行ったところ、SGR1、SGR2、SGR4の検出率はSG13株で全て100%、その他の118血清型でそれぞれ10.2、11.9、9.3%であった(表17)。
【表1】
JP0005224558B2_000002t.gif
【表2-1】
JP0005224558B2_000003t.gif
【表2-2】
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【表3】
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【表4-1】
JP0005224558B2_000006t.gif
【表4-2】
JP0005224558B2_000007t.gif
【表4-3】
JP0005224558B2_000008t.gif
【表5】
JP0005224558B2_000009t.gif
【表6】
JP0005224558B2_000010t.gif
【表7-1】
JP0005224558B2_000011t.gif
【表7-2】
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【表7-3】
JP0005224558B2_000013t.gif
【表7-4】
JP0005224558B2_000014t.gif
【表7-5】
JP0005224558B2_000015t.gif
【表8-1】
JP0005224558B2_000016t.gif
【表8-2】
JP0005224558B2_000017t.gif
【表8-3】
JP0005224558B2_000018t.gif
【表9-1】
JP0005224558B2_000019t.gif
【表9-2】
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【表9-3】
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【表9-4】
JP0005224558B2_000022t.gif
【表10-1】
JP0005224558B2_000023t.gif
【表10-2】
JP0005224558B2_000024t.gif
【表10-3】
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【表10-4】
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【表10-5】
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【表10-6】
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【表11-1】
JP0005224558B2_000029t.gif
【表11-2】
JP0005224558B2_000030t.gif
【表11-3】
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【表11-4】
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【表11-5】
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【表12-1】
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【表12-2】
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【表13】
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【表14】
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【表15】
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【表16】
JP0005224558B2_000039t.gif
【表17】
JP0005224558B2_000040t.gif