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明細書 :がん免疫療法

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第5984113号 (P5984113)
公開番号 特開2013-256454 (P2013-256454A)
登録日 平成28年8月12日(2016.8.12)
発行日 平成28年9月6日(2016.9.6)
公開日 平成25年12月26日(2013.12.26)
発明の名称または考案の名称 がん免疫療法
国際特許分類 C07K   7/06        (2006.01)
C12N   5/0784      (2010.01)
C12N   5/0783      (2010.01)
A61K  38/00        (2006.01)
A61K  35/15        (2015.01)
A61K  35/17        (2015.01)
A61P  35/00        (2006.01)
A61P  35/02        (2006.01)
C12N  15/09        (2006.01)
C07K  14/705       (2006.01)
FI C07K 7/06 ZNA
C12N 5/0784
C12N 5/0783
A61K 37/02
A61K 35/15 Z
A61K 35/17 Z
A61P 35/00
A61P 35/02
C12N 15/00 A
C07K 14/705
請求項の数または発明の数 13
全頁数 14
出願番号 特願2012-132288 (P2012-132288)
出願日 平成24年6月11日(2012.6.11)
審査請求日 平成27年5月22日(2015.5.22)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】899000079
【氏名又は名称】学校法人慶應義塾
発明者または考案者 【氏名】塚本 信夫
【氏名】松下 麻衣子
【氏名】服部 豊
【氏名】河上 裕
個別代理人の代理人 【識別番号】110000176、【氏名又は名称】一色国際特許業務法人
審査官 【審査官】小金井 悟
参考文献・文献 特開2007-246451(JP,A)
特開2009-035534(JP,A)
Biochem. Cell. Biol.,2004年10月,Vol.82, No.5,p.577-582
調査した分野 C07K 1/00-19/00
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
CAplus/REGISTRY/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN)
特許請求の範囲 【請求項1】
DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチド。
【請求項2】
DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチドを提示したHLA-A2402陽性抗原提示細胞。
【請求項3】
樹状細胞であることを特徴とする請求項2に記載HLA-A2402陽性抗原提示細胞。
【請求項4】
請求項2または3に記載のHLA-A2402陽性抗原提示細胞によって誘導され、CXorf48を発現する細胞を認識するT細胞。
【請求項5】
細胞障害性T細胞であることを特徴とする請求項4のT細胞。
【請求項6】
CXorf48を発現する細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項4のT細胞。
【請求項7】
前記腫瘍細胞が、悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫であることを特徴とする請求項6のT細胞。
【請求項8】
DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチド、請求項2または3に記載のHLA-A2402陽性抗原提示細胞、請求項4~7のいずれかに記載のT細胞を含有する組成物。
【請求項9】
DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチド、請求項2または3に記載のHLA-A2402陽性抗原提示細胞、請求項4~7のいずれかに記載のT細胞を含有する医薬組成物。
【請求項10】
DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチド、請求項2または3に記載のHLA-A2402陽性抗原提示細胞、請求項4~7のいずれかに記載のT細胞を含有する抗腫瘍薬。
【請求項11】
悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫に対する抗腫瘍薬であることを特徴とする請求項10に記載の抗腫瘍薬。
【請求項12】
がん免疫療法に使用するためのペプチドの検定方法であって、
DYGMIDESI(配列番号1)において、1~数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるペプチドが、がん免疫療法に使用できるかどうかを検定する工程を含む、検定方法
【請求項13】
がん免疫療法に使用するためのペプチドのスクリーニング方法であって、
DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチドに対し、アミノ酸変異を導入し、変異ペプチドを作製する工程と、
前記変異ペプチドが、がん免疫療法に使用できるかどうか、検定する工程と、
を含むスクリーニング方法。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
本発明は、がん免疫療法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、腫瘍免疫学において、免疫細胞による腫瘍抗原認識機構がかなり解明されてきた。それによると、まず、抗原提示細胞である樹状細胞(dendritic cells;DC)は、細胞内で、腫瘍が発現するタンパク質を分解する際に生じた8~10個のアミノ酸からなる抗原ペプチドを、主要組織適合性抗原複合体(major histocompatibility complex;MHC、ヒトでは、human leukocyte antigen;HLA)と共に細胞表面に提示する。細胞障害性T細胞(cytotoxic T lymphocyte;CTL)は、樹状細胞表面のHLAクラスIに結合した抗原ペプチドを認識し、活性化・増殖し、腫瘍内に侵入し、抗原ペプチドが由来するタンパク質を有する腫瘍細胞に対し細胞障害を生じる(例えば、非特許文献1参照)。
【0003】
この腫瘍抗原認識機構を利用し、正常組織に発現しないか極めて発現が低いががんに発現している分子を標的とした免疫治療や分子標的治療が開発されてきた。このような治療方法は、例えばがん患者体内でがん細胞が原発巣に限局していない場合でもがん細胞を攻撃できるため、外科的治療、化学的治療、放射線治療といった標準治療では腫瘍の治癒が困難な場合に、特に有効な手段として期待されている。
【0004】
具体的には、腫瘍特異的タンパク質由来の抗原ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞をin vitroで作製し、増殖させ、腫瘍患者に投与したり、その樹状細胞によって教育された細胞障害性T細胞を投与したりすることにより、腫瘍患者の体内で腫瘍免疫を誘導する。あるいは、腫瘍特異的タンパク質を腫瘍患者に投与し、患者の体内で、腫瘍免疫機構の全過程を誘導させるのである(例えば、非特許文献2~7参照)。これらの手法は、がん免疫療法として知られている。
【0005】
このがん免疫療法に用いることができるペプチドは、腫瘍特異的抗原由来であることが好ましいが、腫瘍に発現し、正常組織では、精巣以外には発現が観察されない癌精巣抗原(Cancer-Testis antigen;CT抗原)由来でもよい(例えば、非特許文献8参照)。精巣では、HLAが発現していないため、CT抗原に対する細胞傷害性T細胞や抗体による攻撃を受けることが無いからである。
【0006】
一方、最近、腫瘍組織は均一ではなく、抗がん剤や放射線に抵抗性の高いがん細胞集団が存在することが明らかにされ、治療後の再発の原因とされている。特に、腫瘍形成能力が高い一群の細胞集団が存在し、がん幹細胞として知られている。例えば、乳がん細胞株や大腸がん細胞株において、色素Hoechst 33342を排出する能力が高いside populationは、がん幹細胞としての機能を有していることが報告されている(例えば、非特許文献9参照)。このような抗がん剤や放射線に抵抗性の腫瘍細胞に発現が高いCT抗原を標的とした免疫治療や分子標的治療が開発できれば、放射線などによる治療後の腫瘍再発の可能性を低下させ、より奏功率の高い治療法になることが期待される。
【先行技術文献】
【0007】

【非特許文献1】Arch.Surg.(1990)126:200-205
【非特許文献2】Science(1991)254:1643-1647
【非特許文献3】J.Exp.Med.(1996)183:1185-1192
【非特許文献4】J.Immunol.(1999)163:4994-5004
【非特許文献5】Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:432-436
【非特許文献6】Science(1995)269:1281-1284
【非特許文献7】J.Exp.Med.(1997)186:785-793
【非特許文献8】Mol.Oncol.(2011)5:164-182
【非特許文献9】Cancer Res.(2008)68:2419-2426
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、がん免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを含有する組成物、そのペプチドを提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって刺激されたT細胞、これらのペプチドや細胞を利用した組成物、医薬組成物、医薬、及び抗腫瘍薬、これらのペプチドや抗原提示細胞を利用したがんワクチン、及びがん免疫療法に使用するためのペプチドの同定方法やスクリーニング方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【0009】
悪性黒色腫や白血病で高頻度に高い発現が認められるCXorf48は、染色体Xq26.3に存在し、肝細胞がん、大腸がん、胃がん、非小細胞肺がんに発現するCT抗原BJ-HCC-20として同定された(Biochem.Cell.Biol.(2004) 82:577-582 )。本発明者は、これまでに同定されている多数のCT抗原のうち、CXorf48のアミノ酸配列の一部であるDYGMIDESI(配列番号1)を用いることにより、HLA-A2402陽性でCXorf48を発現している悪性黒色腫細胞株や白血病細胞株を傷害する細胞傷害性T細胞が誘導できることを見出し、本発明の完成に至った。
【0010】
本発明の一実施態様は、DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチドである。
本発明の他の一実施態様は、DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチドを提示した抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、樹状細胞であってもよい。
【0011】
本発明のさらなる他の一実施態様は、前記抗原提示細胞によって誘導され、CXorf48を発現する細胞を認識するT細胞である。T細胞は、細胞障害性T細胞であってもよい。また、CXorf48を発現する細胞が腫瘍細胞であってもよい。前記腫瘍細胞が、悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫であってもよい。
【0012】
本発明のさらなる他の一実施態様は、DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチド、または前記いずれかの抗原提示細胞、または前記いずれかのT細胞を含有する組成物、医薬組成物、医薬、抗腫瘍薬である。なお、当該ペプチドまたは当該抗原提示細胞を含有するがんワクチンとしてもよい。これらの医薬組成物、医薬または抗腫瘍薬は、悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫に対するものであってもよい。
【0013】
本発明のさらなる他の一実施態様は、がん免疫療法に使用するためのペプチドの同定方法であって、DYGMIDESI(配列番号1)において、1~数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるペプチドが、がん免疫療法に使用できるかどうかを検定する工程を含む。
【0014】
本発明のさらなる他の一実施態様は、がん免疫療法に使用するためのペプチドのスクリーニング方法であって、DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチドに対し、アミノ酸変異を導入し、変異ペプチドを作製する工程と、前記変異ペプチドが、がん免疫療法に使用できるかどうか、検定する工程と、を含む。
【発明の効果】
【0015】
本発明によって、がん免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを含有する組成物、そのペプチドを提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって刺激されたT細胞、これらのペプチドや細胞を利用した組成物、医薬組成物、医薬、及び抗腫瘍薬、これらのペプチドや抗原提示細胞を利用したがんワクチン、及びがん免疫療法に使用するためのペプチドの同定方法やスクリーニング方法が提供できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】本発明の一実施例において、正常組織及びメラノーマ細胞株におけるCXorf48遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
【図2A】本発明の一実施例において、固形腫瘍細胞株におけるCXorf48遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
【図2B】本発明の一実施例において、造血器腫瘍細胞株におけるCXorf48遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
【図3】本発明の一実施例において、慢性骨髄性白血病患者(CML1~20)及び健常人のリンパ球におけるCXorf48遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
【図4】本発明の一実施例において、多発性骨髄腫細胞株(KU812及びKMS34)のがん幹細胞分画(KU812(CML)CD34+CD38-、KMS34(Multiple myeloma)CD138-)におけるCXorf48遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
【図5】本発明の一実施例において、配列番号1からなるペプチドによって誘導されたCTLをeffector細胞とし、配列番号1からなるペプチドを添加したC1R-A24細胞をtarget細胞とした、51Cr細胞傷害試験の結果を示す図である。
【図6】本発明の一実施例において、配列番号1からなるペプチドによって誘導されたCTLをeffector細胞とし、メラノーマ患者由来のメラノーマ細胞(HLA-A2402陽性、CXorf48陽性)をtarget細胞とした、51Cr細胞傷害試験の結果を示す図である。
【図7】本発明の一実施例において、配列番号1からなるペプチドによって誘導されたCTLによって誘起されたIFN-γ分泌を、Enzyme-Linked Immunospot法によって測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

【0018】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

【0019】
==がん免疫を効率的に誘導できるペプチド==
現在、抗腫瘍薬として、腫瘍特異的がん抗原、がん抗原提示細胞、またはがん抗原反応性細胞障害性T細胞を腫瘍患者に投与する方法が開発されている。そのうち、腫瘍特異的がん抗原、またはがん抗原提示細胞を含有する抗腫瘍薬は、がんワクチンとして知られている。

【0020】
DYGMIDESI(配列番号1)からなるペプチドを合成し、抗原提示細胞である樹状細胞表面に投与すると、HLAクラスI分子であるHLA-A2402に結合し、細胞表面に提示され、細胞障害性T細胞に認識されることで特異的な細胞障害性T細胞を効率よく誘導できる。また、このペプチドの刺激により樹立された細胞障害性T細胞は、CXorf48を発現している腫瘍細胞を効率よく認識する。従って、配列番号1のペプチド、そのペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、及びその抗原提示細胞の刺激によって樹立された細胞障害性T細胞は、HLA-A2402陽性でCXorf48を発現している腫瘍細胞に対する抗腫瘍薬として有用である。

【0021】
なお、日本人のHLAクラスIのタイプは、HLA-A02とHLA-A24が多く、これらで日本人全体の約80%をカバーする。なお、日本人に多い遺伝子型として、HLA-A24に対してはA2402が挙げられ、本明細書では、細胞の遺伝子型としてA2402と記載した場合、そのアレルを少なくとも一つ有することを意味するものとする。

【0022】
==抗腫瘍薬の投与方法==
本発明の組成物、医薬組成物、医薬、及び抗腫瘍薬は、配列番号1からなるペプチド、配列番号1からなるペプチドを提示した抗原提示細胞、または配列番号1からなるペプチドを提示した抗原提示細胞の刺激によって樹立されたT細胞を含有してもよい。

【0023】
本発明においては、腫瘍特異的がん抗原としてCXorf48の部分ペプチドを用いているので、治療及び予防の対象となる腫瘍は、CXorf48が発現している腫瘍であれば何でもよく、例えば、肝細胞がん、大腸がん、胃がん、非小細胞肺がん、乳がん、悪性黒色腫、神経膠芽腫、肺がん、膵臓がん、膀胱がん、前立腺がん、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫が挙げられるが、特に発現している患者の頻度が非常に高い悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫が好ましい。主な治療及び予防の対象は、こうした腫瘍を有するヒト患者であるが、腫瘍を有するヒト以外の脊椎動物でもかまわない。

【0024】
[ペプチド]
本発明の抗腫瘍薬は、配列番号1からなるペプチドを含有してもよい。この場合、あらかじめ患者のHLAクラスIのタイプを調べるのが好ましい。ここでは、患者のHLAクラスIタイプがA2402である場合に、配列番号1からなるペプチドを投与することが好ましい。この抗腫瘍薬は、配列番号1からなるペプチド以外に、治療対象である腫瘍細胞の発現している他種の腫瘍抗原ペプチドを含有していてもよい。また、投与する際には、免疫誘導能を高めるアジュバンドなどと共にペプチドを投与してもよい。また、投与されるペプチドは、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。さらには、ペプチドそのものではなく、これらのペプチドをコードするDNAを組み込んだ発現ベクターなどを用い、DNAワクチンとして投与してもよい。

【0025】
投与部位に関しては、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節投与、腹腔内投与などが考えられ、特に限定されることはない。

【0026】
ここで、配列番号1からなるペプチドの取得方法は特に制限されず、遺伝子組み換え技術を用いて製造された組換えペプチドであっても、周知の方法で化学合成したペプチドであってもよい。

【0027】
[抗原提示細胞]
配列番号1からなるペプチドを提示した抗原提示細胞も、抗腫瘍薬として使用することができる。ここで、細胞表面に提示されているペプチドは、無修飾であっても、糖やリン酸などで修飾されてもよく、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、B7や4-1BBLなどのT細胞刺激因子などを遺伝子導入等で強制的に発現させた腫瘍細胞(偽抗原提示細胞)等が例示できるが、抗原提示能の高さなどを考慮すると、樹状細胞が好ましい。以下、樹状細胞の単離方法の一例を記載するが、他の細胞も公知の方法で容易に取得できる。

【0028】
まず、脊椎動物個体の末梢血から単核球(以下、PBMCとも称する)を単離し、HLAクラスIタイプを調べてA2402であることを確認する。このPBMCは、治療対象となる個体自身から分離することが好ましいが、他の個体から単離してもよい。また、このPBMCはCD14陽性またはCD11c陽性であることが好ましい。PBMCの単離方法は特に制限されず、単離したいPBMCの種類によって当業者が適宜決定できる。例えば、フィコール遠心分離法等によりPBMC全体(PBMC分画)を単離でき、抗体結合磁気ビーズ分離法等によりCD14陽性PBMCやCD11c陽性PBMCを単離できる。単離したPBMCを、GM-CSFとIL-4を添加した培地で5~7日間培養することにより、樹状細胞前駆細胞に分化誘導することができる。このようにして分化誘導した樹状細胞前駆細胞のHLAクラスIタイプがA2402である場合には、配列番号1からなるペプチドを添加する。こうして得られた樹状細胞は、配列番号1からなるペプチドを提示した抗原提示細胞であり、これを、がんに罹患した個体に投与してもよい。

【0029】
投与部位は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節投与、腹腔内投与などが考えられ、特に限定されない。ただし、生理的な樹状細胞の抗原提示を含む生理的な抗がん免疫反応が、がん組織内並びに樹状細胞投与部位の所属リンパ節近傍で行われることを考慮すると、がん組織内またはリンパ節内への直接投与が好ましい。

【0030】
[がん抗原反応性細胞障害性T細胞]
本発明のがん抗原反応性細胞障害性T細胞は、CXorf48を発現する細胞を認識するT細胞であって、例えば、配列番号1からなるペプチドを提示した抗原提示細胞と共に、血清の存在下でナイーブT細胞を共培養し、CD8陽性細胞障害性T細胞(CTL)またはCD4陽性のヘルパーT細胞などへと分化させることによって得られる。

【0031】
なお、ナイーブT細胞の由来は特に限定されず、例えば、脊椎動物の末梢血由来であってもよい。用いるナイーブT細胞は、PBMC分画から単離されたCD8陽性細胞やCD4陽性細胞であってもよいが、CTLの誘導効率を考慮すると、PBMC分画から単離されておらず、他種の細胞や成分と混在した状態のCD8陽性細胞やCD4陽性細胞であることが好ましい。例えば、PBMC分画の細胞を配列1からなるペプチドと血清が添加された培地で培養すると、PBMCが樹状細胞前駆細胞に分化し、樹状細胞前駆細胞はさらにペプチドと結合することで樹状細胞へと分化し、このペプチドを提示する抗原提示細胞になる。この抗原提示細胞がPBMCに含まれるCD8陽性T細胞を刺激し、CTLに分化誘導する。こうして、添加したペプチドを認識するCTLを得ることができる。この際、培養時間はCTLが得られる範囲で当業者が適宜設定できるが、例えば、37℃において4~10日間であることが好ましく、6日間であることがより好ましい。

【0032】
このようにして得られたT細胞は、単離した後、そのまま使用してもよいが、IL-2等のインターロイキン、抗原提示細胞、および配列1からなるペプチドの存在下でさらに培養した後に使用してもよい。この操作によって、T細胞の細胞傷害性を高めることができる。

【0033】
投与部位は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、腫瘍内投与などが例示でき、特に限定されないが、細胞傷害性T細胞の場合、抗原を発現する細胞を直接攻撃できるため、腫瘍内投与が好ましい。

【0034】
==がん免疫療法に使用するためのペプチドのスクリーニング方法==
配列番号1からなるペプチドを基礎として、がん免疫療法に使用するための新たなペプチドを同定することができる。

【0035】
まず、配列番号1からなるペプチドに対し、1~数個のアミノ酸変異を導入した配列を設計する。アミノ酸変異の種類は特に限定されず、欠失、置換、挿入、及びそれらの組み合わせのいずれであっても構わない。アミノ酸変異の数は、特に限定されず、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、のいずれであっても良いが、設計した変異ペプチドは8~10個のアミノ酸からなることが好ましく、9個のアミノ酸からなることが最も好ましい。すなわち、最終的にそのような数のアミノ酸からなる配列になるように、導入する変異を決め、変異ペプチドを設計する。

【0036】
そして、その様に設計した変異ペプチドを、実際に合成する。合成方法は、配列番号1からなるペプチドについて上述したものと、同様の方法を用いることができる。

【0037】
次に、合成した変異ペプチドが、がん免疫療法に使用できるかどうかを検定する。検定方法は特に限定されないが、当業者がその結果を見て、がんワクチンなどの抗腫瘍薬の製造に利用できるかどうか判断できるものであれば良い。例えば、変異ペプチドまたは変異ペプチドを提示させた樹状細胞が誘導したCTLが、変異ペプチドあるいはCXorf48またはその一部を発現したり提示している細胞に対し、IFN-γを分泌する活性があるかどうか調べたり、細胞障害活性があるかどうかを調べたりすればよい。そして、抗腫瘍薬の製造に利用できると判断できた変異ペプチドは、次の段階、例えば臨床試験などに移すことができる。

【0038】
この方法を応用して、がん免疫療法に使用するためのペプチドのスクリーニングを行うこともできる。即ち、複数の変異ペプチドを含むペプチドライブラリーにおいて、各変異ペプチドに対し、ここで述べたように、抗腫瘍薬の製造に利用できるかどうか検定することにより、ペプチドライブラリーの中から、がん免疫療法に使用するための変異ペプチドを同定することができる。
【実施例】
【0039】
[1]CXorf48遺伝子の発現
本実施例では、CXorf48遺伝子が、正常組織では、精巣以外で発現していないが、様々ながん細胞株およびがん組織では発現が高いことを示す。
【実施例】
【0040】
[1-1]まず、試料として、メラノサイトを含む正常組織、及びメラノーマ細胞株8検体を用い、Isogen(ニッポンジーン社)を用いてmRNAを抽出し、GoScriptTMReverse Transcription System(Promega社)を用いてcDNAを合成し、TakaraTaq polymerase(Takara Bio社)を用いてPCRを行った。図1に、得られた増幅産物のシグナルを示す。なお、PCRのプライマーは、全てのアイソフォームが検出できる、以下のものを用いた。
【実施例】
【0041】
Forward:5’-GTTGTGCCTCGCCATCTTTATG-3’(配列番号2)
Reverse:5’-TGCACTGGGGTGATAGAAATCG-3’(配列番号3)
図1に示されるように、正常組織においては、CXorf48遺伝子は精巣においてのみ発現が観察され、メラノーマ細胞では、高頻度で、高レベルの発現が観察された。
【実施例】
【0042】
[1-2]次に、試料として、固形腫瘍細胞株13検体、造血器腫瘍細胞株(多発性骨髄腫細胞株を含む)15検体を用い、同様にして、RT-PCRを行った。今回は、増幅産物を電気泳動して得られたシグナルを、imageJを用いて定量し、ヒトメラノーマ細胞株である501Aを基準としてCXorf48遺伝子の発現量を比較した。図2に、各試料において得られたシグナルと、発現量の相対値を示す。
【実施例】
【0043】
図2Aに示されるように、CXorf48遺伝子は、様々な種類の腫瘍(アストログリオーマ、グリオブラストーマ、肺がん、膵がん、膀胱がん、前立腺がん、乳がん、腎がん)において、発現していた。また、図2Bに示されるように、様々な種類の造血器腫瘍(慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫、組織球性リンパ腫、多発性骨髄腫)において、発現していた。
【実施例】
【0044】
このように、CXorf48遺伝子は、正常組織では、精巣以外で発現していないが、様々ながん細胞株および腫瘍組織で、高レベルで発現している。従って、CXorf48遺伝子をターゲットとすることで、広範な種類の腫瘍を治療することができる。
【実施例】
【0045】
[1-3]次に、試料として、慢性骨髄性白血病(Chronic Myelogenous Leukemia;CML)患者検体20検体、 健常人リンパ球5検体を用い、同様にして、RT-PCRを行った。図3に、得られた増幅産物のシグナルを示す。
【実施例】
【0046】
図3に示されるように、CML患者においても、高頻度(20例中17例)でCXorf48遺伝子の発現が検出された。
【実施例】
【0047】
このように、CXorf48遺伝子は、CML患者においても、高頻度で、高レベルで発現している。従って、CXorf48遺伝子は、CML患者に対するがん免疫療法のためのターゲット遺伝子として有効である。
【実施例】
【0048】
[1-4]さらに、試料として、慢性骨髄性白血病(CML)細胞株(KU812)、または多発性骨髄腫(Multiple myeloma)細胞株(KMS34)において、それぞれ、抗CD34抗体(Miltenyi Biotec社130-081-002)と抗CD38抗体(Miltenyi Biotec社130-092-219)、または抗CD138抗体(Miltenyi Biotec社130-081-301)を用い、FACSを用いたソーティングにより、がん幹細胞分画、すなわちCD34陽性CD38陰性KU812細胞分画及びCD138陰性KMS34細胞分画を採取した(CMLのがん幹細胞分画については、Blood (1996) 88(5):1796-1804を参照のこと。また、多発性骨髄腫のがん幹細胞分画については、Cancer Letters(2009) 277:1-7を参照のこと。なお、これらの文献を本明細書に援用する。)。そして、同様にして、RT-PCRを行い、CXorf48遺伝子の発現量を比較した。図4に、各試料において得られたシグナルと、発現量の相対値を示す。
【実施例】
【0049】
図4に示されるように、CD34陽性CD38陰性KU812細胞分画、及びCD138陰性KMS34細胞分画で得られたがん幹細胞においても、CXorf48遺伝子の発現が検出できた。従って、CXorf48遺伝子は、CML患者に対するがん免疫療法のターゲット遺伝子として、非常に有効である。
【実施例】
【0050】
[2]HLA-A2402陽性健常人PBMCを用いたCTLの誘導
まず、HLA-A2402陽性健常人から末梢血をヘパリン採血し、その末梢血に等量のPBS(Phospate Buffered Salines;Sigma-Aldrich社)を加え、Lymphoprep(Nycomed 社)に重層して遠心し(2000rpm、30分、室温)、PBMCが含まれる中間層をPBMC分画として分離した。得られたPBMCに対し、MACS法を用い、CD14陽性細胞を単離した。この細胞を、IL-4(最終濃度100ng/ml)及びGM-CSF(最終濃度100ng/ml)を添加した10%AB型ヒト血清添加AIM-V培地(GIBCO社)で、37℃、5%CO環境下で(以下、全ての培養は同環境条件で行った)5日間培養した後、TNF-α(最終濃度20ng/ml)を培地に添加し、さらに2日間培養した。
【実施例】
【0051】
得られた樹状細胞に対し配列番号1からなるペプチド50μg/mlを加えて室温で3時間反応させ、X線照射(50Gy)したものとPBMCに対してMACS(Magnetic Cell Sorting)法を用いて単離されたCD8陽性細胞を1:20の割合で混合し、IL-7(最終濃度10ng/ml)を添加した培地で7日間刺激培養した。なお、培養途中(1日目及び4日目)で、培地にIL-2(最終濃度20u/ml)を添加した。
【実施例】
【0052】
得られた細胞に対し、PBMCにphytohaemagglutinin(SIGMA社)を96時間加えて作成したPHAblastに配列番号1からなるペプチド50μg/mlを加えてX線照射(100Gy)した細胞を2:1で混合し、さらに、7日間刺激培養した。なお、培養途中(1日目及び4日目)で、培地にIL-2(最終濃度20u/ml)を添加した。
【実施例】
【0053】
得られた細胞に対し、再度、前回と同じ方法で配列番号1からなるペプチド50μg/mlをパルスしたPHAblastを2:1の割合で混合し、さらに、7日間刺激培養して、目的のCTLを得た。
【実施例】
【0054】
[3]51Cr細胞傷害試験
[2]で得られたCTL(effector細胞)を、10%ABヒト血清添加AIM-Vを用いて、アイソトープ(51Cr)で標識した標的細胞(target細胞)1X10細胞/ウェルと様々な比率(E/T比;effector/target ratio 0.3:1~30:1)で混合し、4時間培養後、上清を回収し、上清中の放射線量を測定した。
【実施例】
【0055】
まず、標的細胞として、配列番号1からなるペプチド5μg/mlを室温で1時間添加したC1R-A24細胞を用い、コントロールとして、等量のDMSOを添加したC1R-A24細胞、HIVペプチド(RYLRDQQLL:配列番号4)、K562細胞(HLA-A2402陰性、CXorf48陽性)を用いた。
【実施例】
【0056】
得られた放射線量から、下式に従って、細胞傷害割合(Cytotoxicity)を算出し、グラフにプロットした。
【実施例】
【0057】
Cytotoxicity (%) =(Experimental 51Cr release (cpm) - Spontaneous 51Cr release (cpm))X100/(Maximum 51Cr release (cpm) - Spontaneous 51Cr release (cpm))
Maximum 51Cr release ; 標的細胞にTritonXを加えて100%傷害した場合の51Cr放出
Spontaneous 51Cr release ;標的細胞にmediumのみを加えた場合の51Cr放出
図5に示されるように、配列番号1からなるペプチドを添加したC1R-A24細胞を標的細胞として用いた場合にのみ、特異的に細胞障害活性が検出された。このように、配列番号1からなるペプチドによって誘導されたCTLは、HLA-A2402拘束性に抗原特異的な細胞障害活性を有する。
【実施例】
【0058】
次に、標的細胞として、メラノーマ患者由来のメラノーマ細胞(HLA-A2402陽性、CXorf48陽性)を用いた。コントロールとしては、526mel細胞(HLA-A2402陰性、CXorf48陽性)を用いた。同様に、細胞傷害割合を算出し、グラフにプロットした。
【実施例】
【0059】
図6に示されるように、生体由来であるHLA-A2402陽性メラノーマ細胞に対しても、細胞障害活性が検出された。このように、配列番号1からなるペプチドによって誘導されたCTLは、腫瘍細胞に対する抗腫瘍薬として有効である。
【実施例】
【0060】
[4]ELISpot法(Enzyme-Linked Immunospot法)
抗ヒトIFN-γ抗体(Mabtech社)をPBSで15倍希釈した溶液を1ウエルあたり100μl加え、4℃で一晩コーティングした96穴プラスティックプレートを用い、1ウエル当たり、各細胞5.0x10個でCTLと標的細胞をAIM-V培地中で1:1で混合した。37℃、5%CO環境下で24時間培養後、細胞を洗浄し、アルカリフォスファターゼで標識した抗ヒトIFN-γ抗体(Mabtech社)を反応させた。これに発色基質としてBCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatase)(BIORAD社)およびNBT(nitroblue tetrazolium)(BIORAD社)を加えて発色させ、T細胞が産生したIFN-γをスポットとして検出した。そして、ELISpotアナライザーにて各ウエルのスポット数を測定し、グラフ化した。
【実施例】
【0061】
標的細胞としては、配列番号1からなるペプチドを添加したC1R-A24細胞及びKMS21(HLA-A2402陽性、CXorf48陽性)を用い、コントロールとして、培地のみ、DMSO添加C1R-A24細胞、HIVペプチドを添加したC1R-A24細胞、K562細胞(HLA-A2402陰性、CXorf48陽性)を用いた。
【実施例】
【0062】
図7に示されるように、配列番号1からなるペプチドを添加したC1R-A24細胞及びKMS21からは、それぞれDMSO添加C1R-A24細胞及びDMSO添加C1R-A24細胞に比べ、有意に多量のIFN-γが分泌された。
【実施例】
【0063】
このように、配列番号1からなるペプチドによって誘導されたCTLは、HLA-A2402拘束性に抗原特異的なIFN-γ分泌を生じる活性を有する。
図面
【図1】
0
【図2A】
1
【図2B】
2
【図3】
3
【図4】
4
【図5】
5
【図6】
6
【図7】
7