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明細書 :アトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤、および外用剤

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第5765744号 (P5765744)
登録日 平成27年6月26日(2015.6.26)
発行日 平成27年8月19日(2015.8.19)
発明の名称または考案の名称 アトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤、および外用剤
国際特許分類 A61K  36/28        (2006.01)
A61P  17/04        (2006.01)
A61P  37/00        (2006.01)
A61K   8/97        (2006.01)
A61Q  19/00        (2006.01)
A61Q  19/10        (2006.01)
A61K 127/00        (2006.01)
FI A61K 36/28
A61P 17/04
A61P 37/00
A61K 8/97
A61Q 19/00
A61Q 19/10
A61K 127:00
請求項の数または発明の数 5
全頁数 15
出願番号 特願2012-536248 (P2012-536248)
出願日 平成23年5月24日(2011.5.24)
新規性喪失の例外の表示 特許法第30条第2項適用 「産業衛生学雑誌 第83回日本産業衛生学会講演集」 発行日:平成22年5月26日 発行所:社団法人 日本産業衛生学会
国際出願番号 PCT/JP2011/061910
国際公開番号 WO2012/042970
国際公開日 平成24年4月5日(2012.4.5)
優先権出願番号 2010217400
優先日 平成22年9月28日(2010.9.28)
優先権主張国 日本国(JP)
審査請求日 平成26年3月26日(2014.3.26)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】504174180
【氏名又は名称】国立大学法人高知大学
発明者または考案者 【氏名】弘田 量二
【氏名】ガッツ ランドゥ ロジャー
個別代理人の代理人 【識別番号】100075409、【弁理士】、【氏名又は名称】植木 久一
【識別番号】100129757、【弁理士】、【氏名又は名称】植木 久彦
【識別番号】100115082、【弁理士】、【氏名又は名称】菅河 忠志
【識別番号】100125243、【弁理士】、【氏名又は名称】伊藤 浩彰
【識別番号】100125173、【弁理士】、【氏名又は名称】竹岡 明美
審査官 【審査官】前田 亜希
参考文献・文献 特開2001-261541(JP,A)
特表2009-532342(JP,A)
国際公開第05/105126(WO,A1)
Food Chemistry,2007年,104,636-642
調査した分野 A61K 36/28
A61K 8/97
CAplus/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN)
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
特許請求の範囲 【請求項1】
Vernonia Amygdalina葉のアルコールおよび/または水の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤。
【請求項2】
Vernonia Amygdalina葉、および/またはそのアルコールおよび/または水の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防用または治療用の外用剤。
【請求項3】
化粧料として用いられるものである請求項2に記載の外用剤。
【請求項4】
入浴剤として用いられるものである請求項3に記載の外用剤。
【請求項5】
Vernonia Amygdalina葉、および/またはそのアルコールおよび/または水の抽出物を含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防用または治療用の化粧料用素材。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
本発明は、Vernonia Amygdalina(VAM)葉のアルコールおよび/または水の抽出物を有効成分として含有するアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤;VAM葉および/またはその上記抽出物を有効成分として含有する化粧料などの外用剤;並びに、VAM葉および/またはその上記抽出物を含有する外用剤素材に関するものである。
【背景技術】
【0002】
アトピー性皮膚炎は強い痒みを伴う皮膚疾患であり、そのためアトピー性皮膚炎の患者は引っ掻き行動を頻繁に行なって炎症部位の慢性化を招いている。アトピー性皮膚炎では血清中のIgE濃度が上昇するほか、炎症の初期には好中球、中期にはマクロファージ、後期には好酸球の増加が見られるなど、炎症細胞の特徴的な推移が見られる。現在、アトピー性皮膚炎の治療剤として、副腎皮質ホルモンを主体とするステロイド剤が汎用されているが、抗かゆみ作用(抗掻痒作用)は不十分であるという問題を抱えている。
【0003】
一方、Vernonia Amygdalina(ベルノニア アミグダリナ)は、熱帯アフリカに広く自生するキク科潅木であり、この水溶性葉抽出物はヒト乳癌に対して抗癌活性を有することが知られている。また、特許文献1および2には、Vernonia Amygdalina乾燥葉をクロロホルム抽出、n-ヘキサン-メタノール抽出、シリカゲルクロマトグラフィー、HPLC等により精製して得られた水不溶性のベルノダリンまたはそのジヒドロ体が、マウス白血病細胞に対する抗腫瘍効果や、マウスT細胞依存性/非依存性の抗体産生能を有することが報告されている。また特許文献3には、極性溶媒またはその混合物により抽出されたVernonia Amygdalinaの抽出物が体毛喪失予防および/または体毛成長促進の作用を有することが報告されている。
【先行技術文献】
【0004】

【特許文献1】特開平6-16550号公報
【特許文献2】特開平6-192265号公報
【特許文献3】特開2009-532342号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、上記特許文献を含め、これまでにVernonia Amygdalina葉のアルコールおよび/または水の抽出物とアトピー性皮膚炎との関係について具体的に開示されたものはない。
【0006】
また、Vernonia Amygdalina葉やその上記抽出物を化粧料や入浴剤に用いたものものこれまで開示されていない。
【0007】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、ステロイド剤と同等またはそれ以上の抗掻痒作用および抗炎症作用を有しており、アトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤として極めて有用な技術を提供することにある。
【0008】
更に本発明の他の目的は、例えば、抗掻痒作用や抗炎症作用などを発揮し得る新規な外用剤およびその原料となる外用剤素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記課題を解決し得た本発明に係るアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤は、Vernonia Amygdalina葉のアルコールおよび/または水の抽出物を有効成分として含有するところに要旨を有するものである。
【0010】
また、上記課題を解決し得た本発明の外用剤は、Vernonia Amygdalina葉、および/またはそのアルコールおよび/または水の抽出物を有効成分として含有するところに要旨を有するものである。
【0011】
本発明の好ましい実施形態において、上記外溶剤は、化粧料として用いられるものである。
【0012】
本発明の好ましい実施形態において、上記化粧料は、入浴剤として用いられるものである。
【0013】
本発明には、Vernonia Amygdalina葉、および/またはそのアルコールおよび/または水の抽出物を含有する化粧料用または入浴剤用素材も包含される。
【発明の効果】
【0014】
本発明の予防剤または治療剤は、Vernonia Amygdalina葉のアルコールおよび/または水の抽出物を有効成分として含有するため、汎用のステロイド剤と同等またはそれ以上に高い抗掻痒作用および抗炎症作用が発揮される。
【0015】
また、Vernonia Amygdalina葉自体、および/またはその上記抽出物は、外用剤素材として有用であり、これらを含む外用剤は、例えばローション、乳液、石鹸、入浴剤などの化粧料として好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】図1は、実施例1における引っ掻き回数の経時的変化を示すグラフである。
【図2】図2は、実施例1における耳介腫脹の経時的変化を示すグラフである。
【図3】図3は、実施例1における臨床症状の経時的変化を示すグラフである。
【図4】図4は、実施例1におけるマウス耳および炎症細胞の結果を示す写真である。
【図5】図5は、実施例1における血清中IgE抗体の結果を示すグラフである。
【図6】図6は、実施例2における耳介腫脹の経時的変化を示すグラフである。
【図7】図7は、実施例2における耳介腫脹(重量)の結果を示すグラフである。
【図8】図8は、実施例2における臨床症状の結果を示すグラフである。
【図9】図9は、実施例2におけるマウス耳および炎症細胞の結果を示す写真ある。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明者らは、Vernonia Amygdalina(ベルノニア アミグダリナ)葉のアルコールおよび/または水の抽出物について種々検討をしてきた。その結果、上記抽出物はアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤のいずれにおいても適用可能であり、驚くべきことに、汎用のステロイド剤と同等またはそれ以上に優れた抗掻痒作用および抗炎症作用を両方有することを見出し、本発明を完成した。上述したようにステロイド剤は、抗掻痒作用が弱く、激しい痒みのために炎症部位が慢性化するといった問題があるのに対し、本発明の抽出物は抗掻痒作用にも優れているため、このような問題を解消することができる。

【0018】
また、Vernonia Amygdalina葉自体、および/またはその上記抽出物は、外用剤素材として有用であり、これらを含む外用剤は、例えば化粧水、乳液、石鹸、入浴剤などの化粧料として好適に用いられる。例えば入浴剤などは、Vernonia Amygdalinaの抽出物のみならずVernonia Amygdalina葉もそのまま、湯中に浸漬するなどして使用することができる。上記外用剤の使用により、例えば、抗掻痒作用や抗炎症作用などの効能が期待される。

【0019】
以下、本発明について詳細に説明する。本明細書では、Vernonia AmygdalinaをVAMと略記する場合がある。また、Vernonia Amygdalina葉のアルコールおよび/または水の抽出物を、単にVAM葉の抽出物と呼ぶ場合がある。

【0020】
(1)アトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤
まず、本発明に係るアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤について説明する。上記予防剤または治療剤は、VAM葉のアルコールおよび/または水の抽出物を有効成分として含有する。

【0021】
本発明に用いられる抽出物は、VAM葉を用い、アルコールおよび/または水の溶媒で抽出した後の抽出液(ろ過後の溶出部分)である。ただし、これに限定されず、保存安定性などを考慮して、必要に応じて、その後に上記抽出液を濃縮したり上記溶媒に再溶解したり、あるいは乾燥したりするなど通常用いられる精製手段を行っても良く、このような処理を行なったものも、本発明に用いられる抽出物の範囲に包含される。

【0022】
以下、上記抽出物を得るための好ましい抽出方法を説明する。

【0023】
まず、原料としてVernonia Amygdalina(VAM)の葉を用意する。本発明に用いられるVAMの産地や採取時期などは特に限定されないが、アトピー性皮膚炎に対する優れた予防作用または治療作用を得るためには、VAMの新葉などが好ましく用いられる。

【0024】
本発明では、VAMのうち葉を抽出材料として用いる。葉のなかにアトピー性皮膚炎の予防または治療に有用な成分が含まれていると考えられるからである。本発明では、葉のみを用いても良いが、本発明の作用を損なわない範囲で、葉以外の部分(茎や根など)が含まれていても良い。

【0025】
以下の抽出を行なう前に、必要に応じて、VAMの葉を洗浄したり乾燥しても良い。乾燥の条件は特に限定されないが、有効成分の細胞内水分による変性や腐敗を考慮すると、収穫後、風通しを良くするために竿に吊るして天日で乾燥を行なうことが好ましい。

【0026】
また、抽出効率を高めるため、抽出の前にVAMの葉を粉砕することが好ましい。粉砕方法は特に限定されず、例えば、ボールミル、ハンマーミル、ローラーミル、ロッドミル、サンプルミル、スタンプミル、エヒスインテグレーター、冷却装置付きブレンダーなどを用い、おおむね1mm~10mmのサイズに粉砕することが好ましい。

【0027】
次に、粉砕した材料にアルコールおよび/または水の溶媒を加えて浸漬させ、有効成分を抽出する。本発明では、抽出溶媒として、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロピルアルコール等のアルコール:または水を単独で用いても良いし、これらの混合溶媒を用いても良い。上記混合溶媒としては、例えばメタノールと水、エタノールと水などが挙げられ、具体的には、例えばメタノール:水=50:50~80:20のものが例示される。後記する実施例に示すように、水よりもアルコール(特にメタノール)抽出物の方が、高い活性が得られる。

【0028】
上記の浸漬条件は、抽出溶媒の種類や抽出材料の量などに応じ、適宜調節することができる。例えば用いられる抽出溶媒の量は、抽出材料であるVAM葉が、少なくとも万遍なく浸漬する程度とし、有効成分の抽出量や濃縮する際の効率などを考慮して適宜調節すればよいが、おおむね、乾燥状態の抽出材料100質量部に対し、抽出溶媒を約100~1000の割合で用いることが好ましい。

【0029】
抽出温度も特に制限されず、抽出効率を高めるために30~50℃程度に加温してもよいが、有効成分が分解される恐れがあるので、室温で抽出することが好ましい。抽出時間も適宜調節すればよいが、おおむね、室温で5~10日間程度であることが好ましい。

【0030】
抽出効率を更に高めるために、抽出材料に抽出溶媒を加えた後、攪拌することが好ましい。あるいは、抽出材料に抽出溶媒を加えた後、上記の粉砕機などを用いて磨り潰すことも好ましい態様である。

【0031】
本発明では、上記の抽出処理を行なった後、濾過等によって抽出残渣を除去し、得られた抽出液を、そのままアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤として用いることができる。

【0032】
あるいは本発明では、上記のようにして得られた抽出液を濃縮したものや、さらに前述したアルコールおよび/または水の抽出溶媒に再溶解したものを、アトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤として用いることもできる。これにより、保存安全性などが向上する。濃縮処理では、濃縮温度の抑制や作業効率の観点からエバポレーターを用いて蒸留することが好ましい。具体的な蒸留条件は、有効成分の抽出量や濃縮する際の効率などを考慮して適宜調節すればよいが、おおむね、温度:約20~55℃、圧力:約400~600hPaにて蒸留を行なうことが好ましい。

【0033】
本発明では、上記のように濃縮や再溶解を行なったものを、そのままアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤として用いても良いが、一旦乾燥し、使用直前に抽出溶媒に適宜溶かして用いることもできる。

【0034】
本発明に係るアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤は、上記のようにして得られた抽出物を有効成分として含むものである。上記の抽出物には、医薬的に通常用いられる公知の製剤成分を添加し、様々な製剤とすることができる。例えば、基材、賦形剤、着色剤、滑沢剤、矯味剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、安定剤、保存剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、抗酸化剤、佐薬、緩衝剤、pH調整剤、甘味料、香料などを添加することができる。また、これら添加剤の配合量は、本発明の作用効果を妨げない様な量である限り、必要に応じて適宜設定することができる。

【0035】
上記予防剤又は治療剤の適用方法は特に限定されず、外用剤(軟膏剤、貼付剤、リニメント剤、ローション剤、パップ剤など)、粘膜適用剤(トローチ剤、坐剤など)、注射剤、経口投与剤(散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エキス剤、流エキス剤、エリキシル剤、懸濁剤・乳剤、チンキ剤、シロップ剤など)などの形態で適用することができる。

【0036】
例えば上記VAM葉抽出物を用いる場合、いったん濃縮して粉末とした抽出物を、水等の溶媒に再溶解または再分散する。このときの抽出物の濃度は特に制限されず、被験者の状態等により適宜調節すればよいが、例えば、乾燥状態の抽出物の濃度に換算して、約50~200g/L程度とすることが好ましい。

【0037】
上記抽出物の溶媒としては、ヒトや動物が飲用するに適した水が好ましい。例えば、蒸留水、精製水、純水、水道水などを用いればよい。また、微量のエタノールなどを添加してもよい。

【0038】
本発明に係るアトピー性皮膚炎の予防剤または治療剤の投与量は、投与すべき被験者の症状や年齢や性別;抽出物の構成などに応じ、所望の作用効果が得られるように適宜適切に調製すれば良い。例えばラットには、おおむね、200mg/kg/日程度投与することが好ましいが、ヒトに対しては、より少ない量であることが好ましい。何れにせよ、被験者の状態等を充分考慮し、投与量は適宜調節すればよい。

【0039】
(2)外用剤
上記VAM葉および/またはその抽出物(アルコールおよび/または水の抽出物)は、外用剤の原料として用いることができる。外用剤は、更に皮膚外用剤と化粧料に大別される。上記皮膚外溶剤としては、例えば軟膏剤、貼付剤、リニメント剤、ローション剤、パップ剤などが挙げられる。

【0040】
上記化粧料の種類は特に限定されず、例えば乳液、化粧水(ローション)、クリーム、洗顔料、ジェル、エッセンス(美容液)、パック・マスク、ひげそり用化粧料などの基礎化粧品;ファンデーション類、口紅類。白粉・打粉類、頬紅類、眉目類、美爪類などのメーキャップ化粧品;洗髪用化粧品(シャンプーやリンスなど)、育毛剤、毛髪仕上げ用化粧品(ヘアスタイリング剤、ヘアトリートメント剤など);パーマネントウェーブ用剤、染毛剤、ヘアブリーチなどの毛髪化粧品;香水やコロンなどの芳香化粧品;石鹸、液体ボディ洗浄料、サンケア製品、ハンドケア製品、防臭化粧品、脱色剤・除毛剤、入浴剤(浴用剤)などのボディ化粧品;歯磨類、口中清涼剤などの口腔用化粧品などが挙げられる。

【0041】
上記化粧料として用いる場合、VAM葉抽出物などの有効成分のほかに、化粧料原料として通常用いられる成分を適宜配合することができる。上記成分としては、例えば、油脂、ロウ類、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル類、シリコーン油などの油性原料;アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤などの界面活性剤;グリセリン、プロピレングリコールなどの保湿剤;増粘剤高分子(キサンタンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど)、皮膜剤高分子(ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなど)などの高分子化合物;紫外線吸収剤;酸化防止剤;金属イオン封鎖剤などが挙げられる。

【0042】
以下、本発明に用いられるが外用剤の代表例として、入浴剤および化粧料を代表的に取り上げて、より詳細に説明する。

【0043】
(入浴剤)
入浴剤として用いる場合、前述したVAM葉の抽出物を用いても良いし、VAM葉そのものを用いても良い。VAM葉そのものを用いる場合、VAM葉の乾燥品を用いても良いし、VAM葉の粉砕物(粉末)を用いても良い。なお、入浴剤以外の化粧料として用いるときは、VAM葉の抽出物を用いることが好ましい。

【0044】
上記VAM葉(粉末などを含む)および/またはその抽出物は、そのまま湯中に入れて使用しても良いし、或いは、これらを不織布などの多孔質袋体に入れて湯中に浸漬して揉み出しながら使用することもできる。あるいは、スプレードライ処理などにより乾燥したVAM葉などを、血行促進効果のある無機塩類(例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなど)、皮膚を清浄にする無機塩類(例えば炭酸水素ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなど)に加えて使用しても良い。

【0045】
(化粧水)
化粧水の種類は、柔軟化粧水、収れん化粧水、洗浄用化粧水などに大別され、化粧水の種類に応じて通常用いられる方法によって製造することができる。例えば、例えば透明化粧水(弱酸性)を構成する基材の一般的な処方例は、以下のとおりであり、有効成分としてVAM葉の抽出物を適宜添加すれば良い。ただし、本発明は下記処方例に限定する趣旨ではない。

【0046】
保湿剤(1,3-ブチレングリコールグリセリン)6.0質量部
(グリセリン)4.0質量部
エモリエント剤(オレイルアルコール)0.1質量部
界面活性剤(POE(20)ソルビタンモノラウリン酸エステル)
0.5質量部
(POE(15)ラウリルアルコールエーテル)0.5質量部
アルコール(エタノール)10.0質量部
香料、色剤、防腐剤、褪色防止剤、緩衝剤 夫々、適量
精製水 78.9質量部

【0047】
精製水に保湿剤、緩衝剤、褪色防止剤を室温にて溶解して水相を得る。エタノールに防腐剤、香料、エモリエント剤、可溶化剤(界面活性剤)を入れて溶解した後、上記の水相に加えて混合し、可溶化する。その後、色剤を加えて調色後、濾過し、充填を行なう。

【0048】
(乳液)
乳液の種類としては、例えば、O/W型、W/O型、多層エマルションが挙げられ、乳液の種類に応じて通常用いられる方法によって製造することができる。例えば保湿・柔軟乳液を構成する基材の一般的な処方例は、以下のとおりであり、有効成分としてVAM葉の抽出物を適宜添加すれば良い。ただし、本発明は下記処方例に限定する趣旨ではない。

【0049】
油分(ステアリン酸)2.0質量部
(セチルアルコール)1.5質量部
(ワセリン)4.0質量部
(スクワラン)5.0質量部
(グリセロールトリ-2-エチルヘキサン酸エステル)
2.0質量部
界面活性剤(ソルビタンモノオレイン酸エステル) 2.0質量部
保湿剤(ジプロピレングリコール) 5.0質量部
(PEG1500) 3.0質量部
アルカリ(トリエタノールアミン) 1.0質量部
防腐剤、香料 夫々、適量
精製水 74.5質量部
【実施例】
【0050】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例】
【0051】
実施例1
本実施例では、以下のようにして調製したVAM葉の抽出物を用い、マウスを用いたアトピー性皮膚炎に対する予防効果を調べた。
【実施例】
【0052】
(抽出物の調製)
コンゴ産のVAMの葉を日干しにより十分に乾燥し、乾燥した葉0.1kgを乳鉢・乳棒を用いて約2mmのサイズに粉砕した。得られた粉砕物1gを抽出溶媒(水5mLまたはメタノール5mL)に浸漬し、液体窒素を用いて充分すり潰した。ろ過後、得られた抽出液4mLに水15mLまたはメタノール15mLを加え、エバポレーターにより、温度:45℃、圧力:500hPaの条件で蒸留した後、37℃で2時間乾燥させることにより、VAMの水抽出物またはVAMのメタノール抽出物を得た。以下の実験では、各抽出物0.5gを5mLの蒸留水に溶解したものを実験に供した(濃度は200g/L)。
【実施例】
【0053】
(供試動物)
7週齢の雄性NC/Ngaマウス16匹を日本エスエルシーより購入し、飼料および飲料水を自由に摂取させて7日間馴化させたものを実験に用いた。マウス16匹を、4匹ずつ以下の4群に分けた。試験の前日には、小動物用バリカンを用いてマウスの腹部を剃毛した(Day0)。
・第1群(本発明例投与群):
VAMの水抽出物(以下、「WAT-VAM」と略記する)投与群
・第2群(本発明例投与群):
VAMのメタノール抽出物(以下、「MET-VAM」と略記する)投与群
・第3群(溶媒対照群):メタノール(以下、「VEH」と略記する)投与群
・第4群(溶媒対照群):水(以下、「NORM」と略記する)投与群
【実施例】
【0054】
(試験方法)
第1群および第2群(いずれも本発明例投与群)について、以下の処置を行なった。
【実施例】
【0055】
まず、剃毛した各群のマウスの腹部に、感作源として5%塩化ピクリルのアセトン溶液を500μL塗布して感作を行なった(Day1)。感作後7日目(Day8)に、上記の各抽出物(「WAT-VAM」または「MET-VAM」)7mg/mLをマウスの右耳に50μL塗布(予防処置)し、その30分後に、0.5%塩化ピクリルのアセトン・オリーブオイル溶液を50μL、マウスの両耳に塗布して追加感作を行なった(Day8)。上記Day8と同様の操作を、Day14、Day16、Day18、およびDay20に行い、アトピー性皮膚炎を惹起(チャレンジ)させた。
【実施例】
【0056】
比較のため、第3群(「VEH」投与群)については、上記の抽出物を塗布する代わりにメタノールを塗布したこと以外は、前述した第1群と同様にして感作および惹起を行なった。
【実施例】
【0057】
一方、第4群(「NORM」投与群)については、5%塩化ピクリルの感作を行なわないこと、および上記の抽出物を塗布する代わりに水を塗布したこと以外は、前述した第1群と同様にして処置した。
【実施例】
【0058】
(評価)
(1)引っ掻き行動の経時的変化
Day8、Day14、Day20のそれぞれにおいて、各群のマウスについて、30秒以内に観察される引っ掻き行動の回数を測定し、各群(4匹)の平均値および標準偏差を算出した。この回数が少ない程、抗掻痒効果に優れることを示している。これらの結果を図1に示す。図1には、各実験群について、左から順にDay8、Day14、Day20の結果を示している。
【実施例】
【0059】
(2)耳介厚さ(腫脹)の経時的変化
Day8、Day14、Day20のそれぞれにおいて、各群のマウスの右耳の厚さ(μm)をデジタルノギスを用いて測定し、Day0のマウスの右耳の厚さとの差(μm)を算出し、各群(4匹)の平均値を算出した。厚さの差が少ない程、耳腫脹抑制効果に優れることを示している。これらの結果を図2に示す。図2には、各実験群について、左から順にDay8、Day14、Day20の結果を示している。
【実施例】
【0060】
(3)臨床症状の経時的変化
Day8、Day14、Day20のそれぞれにおいて、各群のマウスの背部に生じた炎症の程度を肉眼で観察し、スコアリングした。詳細には、(a)表皮剥脱/腐食の程度、(b)紅班/出血の程度、(c)purpuras(血管より漏れ出た血液により紫色の斑点状の内出血)および毛細血管拡張症の程度を肉眼で観察し、下記基準でスコアリングして各群(4匹)の平均値を算出した。スコアリング値が低い程、炎症抑制効果に優れることを示している。
【実施例】
【0061】
(a)表皮剥脱/腐食の評価
0以上、1以下:ほとんど変化なし
1超、2以下 :軽度の症状
2超、3以下 :高度の症状
【実施例】
【0062】
(b)紅班/出血の評価
0以上、10以下:ほとんど変化なし
10超、20以下:軽度の症状
20超、30以下:高度の症状
【実施例】
【0063】
(c)purpurasおよび毛細血管拡張症の評価
0以上、1以下:ほとんど変化なし
1超、2以下 :軽度の症状
2超、3以下 :高度の症状
【実施例】
【0064】
これらの結果をそれぞれ、図3A~図3Cに示す。
【実施例】
【0065】
(4)炎症細胞の浸潤
Day14に、第1群~第3群のそれぞれにつき1例ずつ無作為に抽出したマウス左耳の一部を生検し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色による炎症細胞の同定(好中球、好酸球)を行なって病理組織標本を作製した。参考のため、上記第1群において、本発明抽出物を投与する前(Day21)のマウス(アトピー性皮膚炎マウス)左耳の一部を生検し、上記と同様にして病理組織標本を作製した。図4A~図4Cに、アトピー性皮膚炎マウス(図4A)、第1群の「VAM-WAT」投与群(図4B)、第2群の「VAM-MET」投与群(図4C)におけるマウスの写真(上段)、病理組織標本の10倍拡大写真(中段)、40倍拡大写真(下段)の結果をそれぞれ示す。
【実施例】
【0066】
(5)血清中IgEの測定
Day14に、第1群~第4群のそれぞれにおいて、各群のマウスの血清中IgEを測定した。詳細には、キットに添付されている、段階希釈したIgE標準物質のシグナルから作製した検量線とサンプルのシグナルを比較して血清中IgE濃度を決定し、各群(4匹)の平均値および標準偏差を算出した。これらの結果を図5に示す。
【実施例】
【0067】
図1~図5より以下のように考察することができる。
【実施例】
【0068】
まず、抗掻痒作用について考察する。図1より、本発明抽出物を含まずメタノールのみを投与した「VEH」(溶媒対照群)では引っ掻き回数が多く、感作回数が進むにつれ(Day8→Day14→Day20)、その回数が顕著に増加したのに対し、本発明に係るVAMの水抽出物を投与した「WAT-VAM」(本発明例)およびVAMのメタノール抽出物を投与した「MET-VAM」(本発明例)は、引っ掻き回数の顕著な抑制効果が認められ、水投与群(「NORM」)とほぼ同程度にまで抑えることができた。本発明例のなかでも特に、VAMのメタノール抽出物を投与した「MET-VAM」では非常に著しい抑制効果が認められ、感作回数が増えても引っ掻き回数の上昇は殆ど見られなかった。よって、本発明抽出物は、極めて優れた抗掻痒作用を有していることが確認された。
【実施例】
【0069】
なお、図1には示していないが、本発明抽出物ではなく市販のステロイド剤(和光純薬製ハイドロコルチゾン)を用いて同様の実験を行なった場合は、メタノールのみを投与した「VEH」(溶媒対照群)の結果と殆ど変わらなかったことを確認している。
【実施例】
【0070】
次に図2~図5に基づき、抗炎症作用について考察する。抗炎症作用についても前述した抗掻痒作用と同様の傾向が見られ、本発明抽出物を投与した「WAT-VAM」および「MET-VAM」は、溶媒投与群の「VEH」に比べ、耳介腫脹抑制効果(図2)、臨床症状の緩和(図3)、炎症細胞(好酸球および好中球)の減少(図4)、血清中IgEの減少(図5)が見られ、特にVAMのメタノール抽出物を投与した「MET-VAM」では非常に著しい抗炎症効果が確認された。
【実施例】
【0071】
このうち図4を参照すると、アトピー性皮膚炎マウスでは症状が進行して皮膚のバリア層が破壊し(図4Aの中段の写真をご参照)、好酸球および好中球の浸潤が多く見られた(図4Aの下段の写真をご参照)のに対し、本発明抽出物を投与したものは図4Bおよび図4Cに示すように、バリア層の破壊も殆ど見られず(図4Bおよび図4Cの中段の写真をご参照)、好酸球および好中球の数も減少した(図4Bおよび図4Cの下段の写真をご参照)。よって、本発明抽出物は、極めて優れた抗炎症作用を有していることが確認された。
【実施例】
【0072】
なお、図2~図5には示していないが、本発明抽出物ではなく市販のステロイド剤(和光純薬製ハイドロコルチゾン)を用いて同様の実験を行なった場合は、メタノールのみを投与した「VEH」(溶媒対照群)の結果と殆ど変わらなかったことを確認している。
【実施例】
【0073】
以上の実験結果より、本発明抽出物は、アトピー性皮膚炎の予防剤として極めて有用であることが確認された。
【実施例】
【0074】
実施例2
本実施例では、実施例1と同様にして調製したVAM葉の抽出物を用い、マウスを用いたアトピー性皮膚炎に対する治療効果を調べた。
【実施例】
【0075】
(供試動物)
7週齢の雄性NC/Ngaマウス30匹を日本エスエルシーより購入し、飼料および飲料水を自由に摂取させて7日間馴化させたものを実験に用いた。マウス30匹を、6匹ずつ以下の5群に分けた。試験の前日には、小動物用バリカンを用いてマウスの腹部を剃毛した(Day0)。
・第1群(本発明例投与群):VAMの水抽出物(「WAT-VAM」)投与群
・第2群(本発明例投与群):VAMのメタノール抽出物(「MET-VAM」)投与群
・第3群(溶媒対照群):メタノール(「VEH」)投与群
・第4群(溶媒対照群):水(「NORM」)投与群
・第5群(比較群):ステロイド(「HCT」)投与群
【実施例】
【0076】
(試験方法)
第1群および第2群(いずれも本発明例投与群)について、以下の処置を行なった。
【実施例】
【0077】
まず、剃毛した各群のマウスの腹部に、感作源として5%塩化ピクリルのアセトン溶液を500μL塗布して感作を行なった(Day1)。感作後7日目(Day8)、9日目(Day10)、11日目(Day12)、13日目(Day14)に、0.5%塩化ピクリルのアセトン・オリーブオイル溶液を50μL、マウスの両耳に塗布してアトピー性皮膚炎を惹起(チャレンジ)させた。その後、Day21、Day23、Day25、Day27、Day29にそれぞれ、上記の各抽出物(「WAT-VAM」または「MET-VAM」)7mg/mLをマウスの右耳に50μL塗布(治療処置)した。
【実施例】
【0078】
比較のため、第3群(「VEH」投与群)については、上記の抽出物を塗布する代わりにメタノールを塗布したこと以外は、前述した第1群と同様にして感作および惹起を行なった。
【実施例】
【0079】
一方、第4群(「NORM」投与群)については、5%塩化ピクリルの感作を行なわないこと、および上記の抽出物を塗布する代わりに水を塗布したこと以外は、前述した第1群と同様にして処置した。
【実施例】
【0080】
更にステロイド剤との対比を行なうため、第5群(「HCT」投与群)については、上記の抽出物を塗布する代わりに10mg/mLのハイドロコルチゾンを塗布したこと以外は、前述した第1群と同様にして処置した。
【実施例】
【0081】
(評価)
(1)耳介厚さ(腫脹)の経時的変化
Day21、Day23、Day25、Day27、Day29における各群の耳介厚さ(Day0との差)の平均値を、前述した実施例1の(2)と同様にして算出した。これらの結果を図6に示す。図6には、各実験群について、左から順にDay21、Day23、Day25、Day27、Day29の結果を示している。
【実施例】
【0082】
(2)耳介重量の変化
Day30の解剖時にマウスから摘出した耳の重量を、デジタル天秤にて秤量した(0.1μgまで)。実験群ごとに重量の平均値±標準誤差を算出し、群間の重量有意差を計算した。これらの結果を図7に示す。
【実施例】
【0083】
(3)臨床症状の経時的変化
Day21、Day23、Day25、Day27、Day29のそれぞれにおいて、各群のマウスの背部に生じた扁平皮膚領域の分布を肉眼で観察し、下記基準でスコアリングして各群(6匹)の平均値を算出した。これらの結果を図8に示す。
0以上、1以下:ほとんど変化なし
1超、2以下 :軽度の症状
2超、3以下 :高度の症状
【実施例】
【0084】
(4)炎症細胞の浸潤
Day30に、第1群、第2群(以上、本発明例)、第5群(ステロイド投与群)のそれぞれにつき1例ずつ無作為に抽出したマウス左耳の一部(7mm)を生検し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色による炎症細胞の同定(好中球、好酸球)を行なって病理組織標本を作製した。参考のため、上記第1群において、本発明抽出物を投与する前(Day30)のマウス(アトピー性皮膚炎マウス)左耳の一部を生検し、上記と同様にして病理組織標本を作製した。図9A~図9Dに、アトピー性皮膚炎マウス(図9A)、第1群の「VAM-WAT」投与群(図9B)、第2群の「VAM-MET」投与群(図9C)、第5群の「HCT」投与群(図9D)におけるマウスの写真(上段)と病理組織標本の20倍拡大写真(下段)の結果をそれぞれ示す。
【実施例】
【0085】
図6~図9より以下のように考察することができる。
【実施例】
【0086】
図6より、本発明抽出物を投与した「WAT-VAM」および「MET-VAM」は、溶媒投与群の「VEH」およびステロイド投与群の「HCT」に比べ、耳介腫脹抑制効果が有意差をもって顕著に見られ(p<0.05またはp<0.01)、特にVAMのメタノール抽出物を投与した「MET-VAM」では非常に著しい抑制効果が確認された。図6とほぼ同様の傾向は図7でも見られ、本発明抽出物を投与した群はいずれも、溶媒投与群およびステロイド投与群に比べ、有意差はないが耳重量の減少が大きく見られた。このことは、本発明抽出物を投与したマウスには、浮腫や炎症の症状が減少していることを意味する。
【実施例】
【0087】
また図8より、本発明抽出物を用いれば、溶媒投与群に比べて炎症症状を有意に改善でき、ステロイド投与群とほぼ同程度の改善効果が確認された。
【実施例】
【0088】
更に図9より、アトピー性皮膚炎マウスでは症状が進行して皮膚のバリア層が破壊し、好酸球および好中球の著しい浸潤が見られた(図9の下段の写真をご参照)のに対し、本発明抽出物を投与すると図9Bおよび図9Cに示すように、バリア層の破壊も殆ど見られず、好酸球および好中球の数も減少した。本発明抽出物による改善作用は、ステロイド投与群(図9D)とほぼ同程度であった。
【実施例】
【0089】
以上の実験結果より、本発明抽出物は、極めて優れた抗炎症作用を有していることが確認された。
【実施例】
【0090】
なお、上記図には示していないが、本発明抽出物を投与すると、顕著な抗掻痒効果が見られたことを実験により確認している。
【実施例】
【0091】
以上の実験結果より、本発明抽出物は、アトピー性皮膚炎の治療剤としても極めて有用であることが確認された。
図面
【図1】
0
【図2】
1
【図3】
2
【図4】
3
【図5】
4
【図6】
5
【図7】
6
【図8】
7
【図9】
8