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明細書 :キメラ2重鎖核酸

発行国 日本国特許庁(JP)
公表番号 特表2015-502134 (P2015-502134A)
公報種別 特許公報(B2)
公表日 平成27年1月22日(2015.1.22)
特許番号 特許第6112569号 (P6112569)
登録日 平成29年3月24日(2017.3.24)
発行日 平成29年4月12日(2017.4.12)
発明の名称または考案の名称 キメラ2重鎖核酸
国際特許分類 A61K  31/713       (2006.01)
A61P  43/00        (2006.01)
A61K  47/50        (2017.01)
A61K  48/00        (2006.01)
C12N  15/09        (2006.01)
FI A61K 31/713 ZNA
A61P 43/00 105
A61K 47/48
A61K 48/00
C12N 15/00 A
請求項の数または発明の数 48
全頁数 58
出願番号 特願2014-528740 (P2014-528740)
出願日 平成24年12月17日(2012.12.17)
国際出願番号 PCT/JP2012/083180
国際公開番号 WO2013/089283
国際公開日 平成25年6月20日(2013.6.20)
優先権出願番号 2011275488
優先日 平成23年12月16日(2011.12.16)
優先権主張国 日本国(JP)
審査請求日 平成27年12月15日(2015.12.15)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】504179255
【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
発明者または考案者 【氏名】横田 隆徳
【氏名】仁科 一隆
【氏名】小比賀 聡
【氏名】水澤 英洋
個別代理人の代理人 【識別番号】100091096、【弁理士】、【氏名又は名称】平木 祐輔
【識別番号】100118773、【弁理士】、【氏名又は名称】藤田 節
【識別番号】100111741、【弁理士】、【氏名又は名称】田中 夏夫
審査官 【審査官】伊藤 清子
参考文献・文献 特開平09-110894(JP,A)
特表2006-522586(JP,A)
Bioorg. Med. Chem., 1998, Vol.6, pp.1025-1032
FEBS Lett., 1998, Vol.425, pp.91-96
Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 2004, Vol.7, pp.188-194
調査した分野 A61K 31/713
A61K 47/50
A61K 48/00
A61P 43/00
C12N 15/09
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
CAplus/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN)
特許請求の範囲 【請求項1】
細胞内の転写産物レベルを低減するための医薬組成物であって、
該医薬組成物は、第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体を含み、
(i)第1の核酸鎖は、
前記転写産物にハイブリダイズし、そして
(a)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドもしくは修飾DNAヌクレオチドを含み、さらに(b)前記RNaseHにより認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドもしくは修飾DNAヌクレオチドの5’末側に配置された1又は複数のヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドアナログを含む5’ウイング領域、ならびに/または
(c)前記RNaseHにより認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドもしくは修飾DNAヌクレオチドの3’末側に配置された1又は複数のヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドアナログを含む3’ウイング領域を含む核酸鎖であり、そして
(d)第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、12~25ヌクレオチドであり、かつ、
(ii)第2の核酸鎖は、
(a)少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドと、さらに
(b)前記少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドの5’末側に配置された1又は複数の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび/もしくは修飾ヌクレオチドアナログ、ならびに/または
(c)前記少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドの3’末側に配置された1又は複数の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび/もしくは修飾ヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖であり、そして
(d)第2の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項2】
第2の核酸鎖は、
(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
(iii)PNAヌクレオチドを含む
核酸鎖である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記転写産物は、タンパク質をコードするmRNA転写産物である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記転写産物は、タンパク質をコードしない転写産物である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
【請求項5】
請求項1~4のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの前記総数と、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの総数とが同じである医薬組成物。
【請求項6】
請求項1~4のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの前記総数と、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの総数とが異なる、医薬組成物。
【請求項7】
請求項6に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの前記総数が、第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの前記総数よりも大きい、医薬組成物。
【請求項8】
請求項1~のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、RNaseHによって認識される前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’及び/又は3’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログを含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項9】
請求項1~のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、
RNaseHによって認識される前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、及び/又は、RNaseHによって認識される前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの3’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域を含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項10】
請求項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、該5’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含み、かつ、該3’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項11】
請求項10に記載の医薬組成物であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~10個のヌクレオチドアナログを含む、医薬組成物。
【請求項12】
請求項11に記載の医薬組成物であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~3個のヌクレオチドアナログを含む、医薬組成物。
【請求項13】
請求項1~12のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、2’-O-CH基又は2’-O-CHCHOCH(MOE)基を含むヌクレオチドを少なくとも1つ含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項14】
請求項1~13のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログが架橋化ヌクレオチドである、医薬組成物。
【請求項15】
請求項14に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、LNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)及びcMOE-BNAから独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項16】
請求項14に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、4’-(CH)p-O-2’、4’-(CH)p-S-2’、4’-(CH)p-OCO-2’、4’-(CH)n-N(R)-O-(CH)m-2’によって、2’位の炭素と4’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから、独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物(p、m及びnは、各々1~4、0~2及び1~3の整数である。Rは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す)。
【請求項17】
請求項1~16のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖における少なくとも1つのヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、医薬組成物。
【請求項18】
請求項1~17のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖における少なくとも1つのヌクレオチドアナログがホスホロチオエート化されている、医薬組成物。
【請求項19】
請求項1~18のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される4~20個の連続したヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項20】
請求項19のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
第1の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、
(i)該5’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、(ii)該3’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、かつ、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される前記連続したヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである、医薬組成物。
【請求項21】
請求項1~20のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が第1の核酸鎖にアニーリングした際に、RNaseHによって切断される、少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項22】
請求項21に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’及び/又は3’側に、1又は複数のホスホロチオエート化されているヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項23】
請求項22に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、
前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、及び/又は、
前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの3’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域を含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項24】
請求項23に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域を含み、該5’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含み、かつ、第1の核酸鎖における前記3’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項25】
請求項24に記載の医薬組成物であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~10個のヌクレオチドアナログを含む、医薬組成物。
【請求項26】
請求項25に記載の医薬組成物であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~3個のヌクレオチドアナログを含む、医薬組成物。
【請求項27】
請求項2126のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、2’-O-CH基又は2’-O-CHCHOCH(MOE)基を含むRNAヌクレオチドを少なくとも1つ含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項28】
請求項2127のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログが架橋化ヌクレオチドである、医薬組成物。
【請求項29】
請求項28に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、LNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)及びcMOE-BNAから独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項30】
請求項28に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、4’-(CH)p-O-2’、4’-(CH)p-S-2’、4’-(CH)p-OCO-2’、4’-(CH)n-N(R)-O-(CH)m-2’によって、2’位の炭素と4’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから、独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物(p、m及びnは、各々1~4、0~2及び1~3の整数である。Rは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す)。
【請求項31】
請求項2330のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
第2の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、
(i)該5’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、(ii)該3’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、かつ、
(iii)第2の核酸鎖が第1の核酸鎖にアニーリングした際に、RNaseHによって切断される前記連続したヌクレオチドは、RNAヌクレオチドである、医薬組成物。
【請求項32】
請求項31に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖において、少なくとも1つのRNAヌクレオチド及び又は少なくとも1つのヌクレオチドアナログが、ホスホロチオエート化されている、医薬組成物。
【請求項33】
請求項2~20のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖がPNAヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項34】
請求項1~4及び6~28のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記二本鎖核酸複合体が、第2の核酸鎖にアニーリングする第3の核酸鎖を更に含む複合体である、医薬組成物。
【請求項35】
請求項34に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖は第1の核酸鎖と同じである、医薬組成物。
【請求項36】
請求項34に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、
(ii)第2の転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、かつ
(iv)第2の転写産物にハイブリダイズする
核酸である、医薬組成物。
【請求項37】
請求項34に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖はPNAヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項38】
請求項3437のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項39】
請求項1~41のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分が、脂質、ペプチド及びタンパク質から選択される分子である、医薬組成物。
【請求項40】
請求項39に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分が、前記核酸鎖の3’末端のヌクレオチド又は5’末端のヌクレオチドに結合している、医薬組成物。
【請求項41】
請求項39又は40に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分が脂質である、医薬組成物。
【請求項42】
請求項41に記載の医薬組成物であって、前記脂質が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質及びグリセリドから選択される、医薬組成物。
【請求項43】
請求項41に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分が、コレステロール、トコフェロール及びトコトリエノールから選択される脂質である、医薬組成物。
【請求項44】
請求項39又は40に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分が、受容体のリガンド及び抗体から選択されるペプチド又はタンパク質である医薬組成物。
【請求項45】
医薬組成物であって、
(A)第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含み、突出したヌクレオチドを有さない、二本鎖核酸複合体と、
(B)薬理学上許容される担体とを含み、
第1の核酸鎖が、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~25であり、
(ii)遺伝子の転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドを含み、
(iii)架橋化ヌクレオチドからなる5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、(iv)ホスホロチオエート化されているヌクレオチドを任意に含み、かつ、
(v)前記転写産物にハイブリダイズする核酸鎖であり、
第2の核酸鎖が、
i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、
ii)少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドを含み、かつ、
iii)ホスホロチオエート化されているヌクレオチドを任意に含む核酸鎖であ
さらに、第2の核酸鎖にアニーリングする第3の核酸鎖を更に含む、医薬組成物。
【請求項46】
請求項45に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖及び第3の核酸鎖のうちの少なくとも1の核酸鎖が、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、医薬組成物。
【請求項47】
請求項45又は46に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分がビタミンE及びコレステロールから選択される、医薬組成物。
【請求項48】
請求項4547のうちのいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記架橋化ヌクレオチドがLNAである、医薬組成物。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
本発明は、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する活性を有する二重鎖核酸に関し、より詳しくは、4塩基以上の連続した核酸を含む領域を含む、標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸と、該核酸に相補的な核酸とを含む二重鎖核酸に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、オリゴヌクレオチドは、核酸医薬と称される医薬品としての開発が進められており、特に標的遺伝子の選択性の高さや低毒性の観点から、アンチセンス法を利用した核酸医薬の開発が精力的に進められている。アンチセンス法は、標的遺伝子のmRNA(センス鎖)の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO))を細胞内に導入することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を選択的に阻害する方法である。
【0003】
図1(上部)に示す通り、ASOとしてRNAからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合には、標的遺伝子の転写産物(mRNA)と当該ASOとが結合して、部分的に二本鎖が形成される。そして、この二本鎖が蓋の役割をして、リボソームによる翻訳を生じさせず、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害されることが知られている。
【0004】
一方、ASOとしてDNAからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合には、部分的にDNA-RNAのヘテロオリゴヌクレオチドが形成される。そして、RNaseHによってこの部分が認識され、標的遺伝子のmRNAが分解されるため、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害される(図1、下部)。また、ASOとしてDNAを用いた方(RNaseH依存的経路)がRNAを用いるよりも、多くの場合において遺伝子発現の抑制効果が高いことも明らかになっている。
【0005】
オリゴヌクレオチドを核酸医薬として利用する際には、標的RNAへの結合親和性の向上や生体内での安定性等を考慮し、ロックド核酸(Locked Nucleic Acid(LNA)(登録商標))等の様々な修飾核酸等が開発されている。
【0006】
図2に示す通り、天然核酸(RNAやDNA)の糖部分は4つの炭素原子と1つの酸素原子とからなる5員環を有し、その糖部分はN型とS型の2種類のコンホメーションを取る。これらコンホメーションは互いに揺らいでおり、これにより核酸のらせん構造もA型とB型の異なった型をとることが知られている。前述のASOの標的となるmRNAは主に糖鎖がN型でA型のらせん構造をとっているため、RNAに対する親和性を高めるという観点から、ASOの糖鎖もN型をとることが重要になる。このコンセプトのもとに開発されたのがLNA(2’-O,4’-C-メチレン-架橋化核酸(2’,4’-BNA))等の修飾核酸である。例えば、LNAにおいては、2’位の酸素と4’位の炭素とをメチレン基によって架橋することにより、そのコンホメーションはN型に固定され、コンホメーション間のゆらぎは生じない。そのため、LNAを数ユニット組み込んで合成されたオリゴヌクレオチドは、従来の天然の核酸で合成されたオリゴヌクレオチドに比べて、RNAに対する結合力や配列特異性が極めて高く、かつ、優れた耐熱性とヌクレアーゼ耐性とを示す(特許文献1 参照)。他の人工核酸もかかる特性を有していることから、アンチセンス法の利用等において、人工核酸は強く注目されている(特許文献1~7 参照)。
【0007】
また、オリゴヌクレオチドを医薬に適用する際には、当該オリゴヌクレオチドを標的部位に特異性高く効率良く送達できることが重要である。そして、オリゴヌクレオチドの送達方法として、コレステロールやビタミンE等の脂質を利用する方法(非特許文献1及び2)や、RVG-9R等の受容体特異的ペプチドを利用する方法(非特許文献3)や、標的部位に特異的な抗体を利用する方法(非特許文献4)が開発されている。
【先行技術文献】
【0008】

【特許文献1】特開平10-304889号公報
【特許文献2】国際公開第2005/021570号
【特許文献3】特開平10-195098号公報
【特許文献4】特表2002-521310号公報
【特許文献5】国際公開第2007/143315号
【特許文献6】国際公開第2008/043753号
【特許文献7】国際公開第2008/029619号
【0009】

【非特許文献1】Kazutaka Nishinaら、Molecular Therapy、2008年、16巻、734~740ページ
【非特許文献2】Jurgen Soutscheckら、Nature、2004年、432巻、173~178ページ
【非特許文献3】Kazutaka Nishinaら、Molecular Therapy、2008年、16巻、734~740ページ
【非特許文献4】Dan Peerら、Science、2008年、319巻、627~630ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
ある実施形態において、二重鎖核酸複合体は、標的遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸を含み、通常RNA転写産物レベルを抑制するアンチセンス核酸を含む。本発明の他の目的は、二重鎖核酸複合体により、特異性高く効率良く標的部位にアンチセンス核酸鎖を送達することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、アンチセンス法におけるASOの安定性、生体内における標的遺伝子の発現に対する抑制活性(アンチセンス効果)、並びにASOの標的部位への送達における特異性及び効率(送達性)を向上させるべく、脂質(コレステロール)を直接結合させた、LNA及びDNAを含むASO(LNA/DNAギャップマー)を調製し、このASOをマウスに静脈投与して送達性及びアンチセンス効果を評価した。その結果、コレステロールを結合させることにより、ASOの肝臓への送達性は向上する一方で、アンチセンス効果は喪失してしまうことが明らかになった。
【0012】
そこで、本発明者らは、ASOの送達性を高めつつ、高いアンチセンス効果を有する核酸を開発すべく、鋭意研究を重ねた結果、1の実施形態において、LNA/DNAギャップマーとそれに対するRNAからなる相補鎖とをアニーリングさせた二重鎖核酸複合体を新たに着想し、先ずはそのアンチセンス効果について評価した。その結果、前記二重鎖核酸のアンチセンス効果は、1本鎖のLNA/DNAギャップマーのそれと概して変わらず、むしろ用いるASOの鎖長によっては亢進することが明らかになった。また、本発明者らは、前記RNAを含む相補鎖にトコフェロールを結合させた二重鎖核酸を調製した。そして、当該二重鎖核酸をマウスに静脈投与し、そのアンチセンス効果を評価した。その結果、トコフェロールを結合させた相補鎖を含む二重鎖核酸は非常に高いアンチセンス効果を有していることが明らかになった。また、前記RNAの代わりにPNA(ペプチド核酸)を含む相補鎖とアニーリングさせたLNA/DNAギャップマーのアンチセンス効果は、1本鎖のLNA/DNAギャップマーのそれと少なくとも同等であるか、または優れていることも本発明者らは見出した。さらに、PNAは、ASOと、ペプチド、タンパク質又は抗体とを直接結合させる上で有用であり、ASOの特定の部位への直接的な送達を可能とするものである。
【0013】
ある実施形態において、以下を提供する。
(1) 標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する活性を有する、下記(a)及び(b)の核酸を含む二重鎖核酸
(a)標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸であって、4塩基以上の連続したDNAからなる領域を含む核酸
(b)(a)の核酸に相補的な核酸。
(2) (a)の核酸が、前記4塩基以上の連続したDNAからなる領域の5'末側及び3'末側の少なくともいずれか一方に配置された修飾核酸を含む領域をさらに含む核酸である(1)に記載の二重鎖核酸。
(3) (a)の核酸の修飾核酸を含む領域が、4塩基以上の連続したDNAからなる領域の5'末側及び3'末側に配置された修飾核酸を含む領域であり、該修飾核酸がLNAである、(2)に記載の二重鎖核酸。
(4) (b)の核酸がRNA又はPNAである、(1)~(3)のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
(5) (b)の核酸がRNAであって、(a)の核酸の修飾核酸を含む領域に対して相補的な領域が修飾されており、前記修飾がRNA分解酵素による分解を抑制する効果を有するものである、(1)~(3)のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
(6) 前記修飾が、2’-O-メチル化及び/又はホスホロチオエート化である、(5)に記載の二重鎖核酸。
(7) (b)の核酸に機能性分子が結合している、(1)~(6)のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
(8) (a)又は(b)の核酸の鎖長が同一である、(1)~(7)のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
(9) (a)又は(b)の核酸の鎖長が異なる、(1)~(7)のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
(10) さらに、下記(c)の核酸を含む、(9)に記載の二重鎖核酸
(c)(a)又は(b)の核酸のうち鎖長が長い核酸における他の一方の核酸に対して突出した領域に対して相補的な核酸。
(11) (c)の核酸がPNAである、(10)に記載の二重鎖核酸。
(12) (c)の核酸に機能性分子が結合している、(10)又は(11)に記載の二重鎖核酸。
(13) 機能性分子が、二重鎖核酸を標的部位に送達させる活性を有する分子である、(7)又は(12)に記載の二重鎖核酸。
(14) (1)~(13)のいずれか一に記載の二重鎖核酸を有効成分として含有する、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制するための組成物。
(15) 細胞内の転写産物レベルを低減する方法であって、
該細胞と組成物とを接触させる工程を含み、
該組成物は、(a)第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含む二重鎖核酸複合体を含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、
(ii)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、方法。
(16) 哺乳動物における遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
該哺乳動物に、医薬組成物を有効量投与する工程を含み、
該医薬組成物は、(a)第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含む二重鎖核酸複合体と、(b)薬理学上許容される担体とを含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、
(ii)前記遺伝子の転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、方法。
(17) 精製又は単離された二重鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、
(ii)転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)少なくとも1つの非天然ヌクレオチドを含み、かつ、
(iv)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
(18) 哺乳動物を治療するための医薬組成物であって、前記転写産物が哺乳動物の転写産物であり、(17)に記載の二重鎖核酸複合体と、薬理学上許容される担体とを含む、医薬組成物。
【0014】
本発明の他の実施形態において、以下を提供する。
<1> 精製又は単離された二重鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含み、
第1の核酸鎖は、DNAヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、
また、第1の核酸鎖は、5’末側に配置された1又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む5’ウィング領域、及び/又は、3’末側に配置された1又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む3’ウィング領域を含み、
また、第1の核酸鎖は、少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドを含み、
また、第1の核酸鎖におけるDNAヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数は、10~100ヌクレオチドであり、
第1の核酸鎖は、転写産物の配列の一部と相補的な少なくとも10個の連続したヌクレオチド配列を更に有し、かつ、
第2の核酸鎖は、
(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
(iii)PNAヌクレオチドを含み、
また、第2の核酸鎖は、5’末側に配置された1又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む5’ウィング領域、及び/又は、3’末側に配置された1又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む3’ウィング領域を含み、
また、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの総数は、10~100ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<2> 前記転写産物は、タンパク質をコードするmRNA転写産物である、<1>に記載の二重鎖核酸複合体。
<3> 前記転写産物は、タンパク質をコードしない転写産物である、<1>に記載の二重鎖核酸複合体。
<4> <1>~<3>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチドの数と、第2の核酸鎖におけるそれとが同じである、二重鎖核酸複合体。
<5> <1>~<3>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチドの数と、第2の核酸鎖におけるそれとが異なる、二重鎖核酸複合体。
<6> <5>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖におけるヌクレオチドの数が、第1の核酸鎖におけるヌクレオチドの数よりも大きい、二重鎖核酸複合体。
<7> <1>~<6>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖に含まれるヌクレオチドの総数が10~35ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<8> <1>~<7>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖に含まれるヌクレオチドは、全てヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<9> <1>~<8>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、
1又は複数のヌクレオチドアナログを含む前記5’ウィング領域、及び/又は、
3’末側に配置された1又は複数のヌクレオチドアナログを含む前記3’ウィング領域を含む、二重鎖核酸複合体。
<10> <1>~<9>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、
5’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる前記5’ウィング領域と、3’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる前記3’ウィング領域とを含む、二重鎖核酸複合体。
<11> <10>に記載の二重鎖核酸複合体であって、
前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~10個のヌクレオチドアナログからなる、二重鎖核酸複合体。
<12> 請求項11に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~3個のヌクレオチドアナログを含む、方法。
<13> <1>~<12>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログが架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<14> <1>~<13>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖に含まれるヌクレオチドアナログは、架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<15> <14>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドが、LNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)及びcMOE-BNAから独立して選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<16> <14>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドが、4’-(CH-O-2’、4’-(CH-S-2’、4’-(CH-OCO-2’、4’-(CH-N(R)-O-(CH-2’によって、2’位の炭素と4’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体(p、m及びnは、各々1~4、0~2及び1~3の整数である。Rは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す)。
<17> <1>~<16>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖における前記DNAヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
<18> <1>~<17>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖における前記ヌクレオチドアナログがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
<19> <1>~<18>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖は、4~20個の連続したDNAヌクレオチドからなる部分を含む、二重鎖核酸複合体。
<20> <1>~<19>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖が、
(i)5’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、
(ii)3’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域、及び、
(iii)少なくとも4個の連続したDNAヌクレオチド
を含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<21> <1>~<19>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖は、
(i)5’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、
(ii)3’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域、及び、
(iii)少なくとも4個の連続したDNAヌクレオチド
を含み、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域における前記ヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、前記架橋化ヌクレオチド及び前記DNAヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
<22> <1>~<21>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖の鎖長が12~25ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<23> <1>~<22>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖が、RNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログと、任意にDNAとを含む、二重鎖核酸複合体。
<24> <23>に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖における前記5’ウィング領域は少なくとも1のヌクレオチドアナログを含み、第2の核酸鎖における前記3’ウィング領域は少なくとも1のヌクレオチドアナログを含み、かつ、第2の核酸鎖は、少なくとも4個の連続したRNAヌクレオチドを含む、二重鎖核酸複合体。
<25> <23>に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖における前記5’ウィング領域は少なくとも1のホスホロチオエート化されているヌクレオチドを含み、第2の核酸鎖における前記3’ウィング領域は少なくとも1のホスホロチオエート化されているヌクレオチドを含み、かつ、第2の核酸鎖は、少なくとも4個の連続したRNAヌクレオチドを含む、二重鎖核酸複合体。
<26> <24>又は<25>に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖における前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域の全てのヌクレオチドが、ホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
<27> <24>~<26>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖における前記ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドは、架橋化ヌクレオチド及び2’-O-メチル化RNAから独立して選択されるヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<28> <27>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドは、LNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)及びcMOE-BNAから独立して選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<29> <27>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドが、4’-(CH-O-2’、4’-(CH-S-2’、4’-(CH-OCO-2’、4’-(CH-N(R)-O-(CH-2’によって、2’位の炭素と4’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体(p、m及びnは、各々1~4、0~2及び1~3の整数である。Rは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す)。
<30> <24>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖は、
(i)前記5’末側に少なくとも2つの、ホスホロチオエート化されている2’-O-メチル化RNAヌクレオチドからなる5’ウィング領域、
(ii)前記3’末側に少なくとも2つの、ホスホロチオエート化されている2’-O-メチル化RNAヌクレオチドからなる3’ウィング領域、及び、
(iii)少なくとも4個の連続した天然RNAヌクレオチドであって、独立して、任意にホスホロチオエート化されている天然RNAヌクレオチド
を含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<31> <24>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖は、
(i)前記5’末側に少なくとも2つの、ホスホロチオエート化されている架橋化ヌクレオチドからなる5’ウィング領域、
(ii)前記3’末側に少なくとも2つの、ホスホロチオエート化されている架橋化ヌクレオチドからなる3’ウィング領域、及び、
(iii)少なくとも4個の連続した天然RNAヌクレオチドであって、独立して、任意にホスホロチオエート化されている天然RNAヌクレオチド
を含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<32> <1>~<22>のいずれか1に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖はPNAヌクレオチドを含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<33> <23>~<32>のいずれか1に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<34> <1>~<3>及び<5>~<33>のいずれか1に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖にアニーリングする第3の核酸鎖を更に含む二重鎖核酸複合体。
<35> <34>に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第3の核酸鎖は、DNAヌクレオチド及び任意にヌクレオチドアナログを含み、
また、第3の核酸鎖は、4個の連続したDNAヌクレオチドを含み、
ヌクレオチドの総数が10~100ヌクレオチドであり、
該第3の核酸鎖は、転写産物の配列の一部と相補的な少なくとも10個の連続したヌクレオチド配列を更に有する、二重鎖核酸複合体。
<36> <35>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第3の核酸鎖は、
(i)前記5’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、
(ii)前記3’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域、及び、
(iii)少なくとも4個の連続したDNAヌクレオチド
を含み、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域における前記ヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、前記架橋化ヌクレオチド及び前記DNAヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
<37> <34>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第3の核酸鎖はPNAヌクレオチドを含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<38> <34>~<37>のいずれか1に記載の二重鎖核酸複合体であって、第3の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<39> <33>~<38>のいずれか1に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、脂質、ペプチド及びタンパク質から選択される分子である、二重鎖核酸複合体。
<40> <39>に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、前記3’末端のヌクレオチド又は前記5’末端のヌクレオチドに結合している、二重鎖核酸複合体。
<41> <39>又は<40>に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が脂質である、二重鎖核酸複合体。
<42> <41>に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質及びグリセリドから選択される脂質である、二重鎖核酸複合体。
<43> <41>に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、コレステロール、トコフェロール及びトコトリエノールから選択される脂質である、二重鎖核酸複合体。
<44> <39>又は<40>に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、受容体のリガンド及び抗体から選択されるペプチド又はタンパク質である、二重鎖核酸複合体。
<45> 薬理学上許容される担体と、<1>~<44>のうちのいずれかに記載の二重鎖核酸複合体とを含む、医薬組成物。
<46> 哺乳動物において遺伝子の発現を低減するための薬剤を製造するための、<1>~<44>のうちのいずれかに記載の二重鎖核酸複合体の使用。
<47> 哺乳動物において遺伝子の発現を低減するための、<1>~<44>のうちのいずれかに記載の二重鎖核酸複合体の使用。
<48> 哺乳動物における遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
該哺乳動物に、医薬組成物を有効量投与する工程を含み、
第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖と、薬理学上許容される担体とを含む、単離又は精製された二重鎖核酸複合体を、前記医薬組成物は含み、
第1の核酸鎖は、DNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、少なくとも4個の連続したDNAヌクレオチドとを含み、第1の核酸鎖におけるDNAヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数は10~100ヌクレオチドであり、
第1の核酸鎖は、哺乳動物の転写産物の配列の一部と相補的な少なくとも10個の連続したヌクレオチド配列を更に有し、かつ、
第2の核酸鎖は、
(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
(iii)PNAヌクレオチドを含み、
第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの総数は、10~100ヌクレオチドである、方法。
<49> <48>に記載の方法であって、投与経路が経腸管的である、方法。
<50> <48>に記載の方法であって、投与経路が非経腸管的である、方法。
<51> <48>~<50>のいずれか一に記載の方法であって、前記二重鎖核酸複合体の投与量が、0.001mg/kg/日~50mg/kg/日である、方法。
<52> <48>~<51>の方法であって、前記哺乳動物がヒトある、方法。
【発明の効果】
【0015】
ある実施形態によれば、二重鎖核酸複合体中のアンチセンス核酸を送達することができ、かつ当該アンチセンス核酸によって標的遺伝子の発現を特異的に、非常に効果的に抑制することが可能となる。いくつかの実施形態においては、二重鎖核酸複合体に送達部分を結合させることによって、該複合体を特異性高く効率的に標的部位に送達することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】図1は、アンチセンス法の一般的なメカニズムを示す図である。概略図に示す通り、標的遺伝子のmRNAの部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO))(図中「DNA」)を細胞内に導入することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が選択的に阻害される。破線での囲み部分においては、ASOにハイブリダイズした部位においてRNaseHによるmRNAの切断が生じる、分解のメカニズムを示す。RNaseHによる切断の結果、機能的な遺伝子発現産物を製造するための翻訳に、通常mRNAを供することができなくなる。
【図2】図2は、RNA、DNA及びLNAヌクレオチドの構造を示す概略図である。
【図3】図3A~Bは、二重鎖核酸複合体の好適な態様を示す概略図である。5’-LNA-DNA-LNA-3’核酸鎖は、標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸である。図中「(s)」はホスホロチオエート結合している核酸を示し、「(o)」は、天然のホスホロチオエート結合している核酸を示し、「(m/s)」は、ホスホロチオエート化及び2’-O-メチル化されているRNAを示す。また、「X」は機能性分子を表わし、脂質(例えば、コレステロール、トコフェロール)、糖等、又はタンパク質やペプチド(例えば、抗体)等を独立して示す。
【図4】図4A~Bは、3本の核酸鎖を含む二重鎖核酸複合体の好適な態様を示す概略図である。該二重鎖核酸複合体においては、第1のASO核酸鎖と第2の相補的核酸鎖とが異なる鎖長を有し、ペプチド、抗体等の機能性部分を結合させるためのPNAを含む、第3の核酸鎖が含まれる。図中の表記は図3におけるそれらと同義である。
【図5】図5A~Bは、少なくとも第1のASO核酸鎖と第2の相補的核酸鎖とが異なる鎖長を有している、二重鎖核酸複合体の好適な態様を示す概略図である。これらの態様においては、(A)第2の核酸鎖に相補的な第3の核酸鎖を更に含む核酸、及び、(B)第2の核酸鎖にヘアピンリンカーによって結合している、ホスホロチオエート化しているDNAからなる自己相補的領域を更に含む、第2の核酸のいずれかである。図中、「(m)」は2’-O-メチル化されているRNAを示す。他の表記は図3におけるそれらと同義である。
【図6】図6Aは、5’-LNA-DNA-LNA-3’の構造を有する核酸であって、5’末端をCy3蛍光色素にて標識した核酸を示す概略図である。図6Bは、5’-LNA-DNA-LNA-3’の構造を有する核酸であって、5’末端をCy3蛍光色素にて標識し、3’末端をコレステロール(「Chol」)にて標識した核酸を示す概略図である。「(S)」はホスホロチオエート化されている核酸を示す。
【図7】図7は、Cy3にて蛍光標識してある「LNA」(図6Aに基づく)又はCy3にて蛍光標識してある「chol-LNA」(図6Bに基づく)を投与したマウスの肝臓を観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。
【図8】図8は、ApoB1遺伝子の塩基配列と相補的な配列を有する、「12mer Cy3-Chol-LNA(ApoB1)」(図6Bに基づく)、「20mer Cy3-Chol-LNA(ApoB1)」若しくは「29mer Cy3-Chol-LNA(ApoB1)」、又は「12mer Cy3-LNA(ApoB1)」(図6Aに基づく)をマウスに投与し、これらマウスの肝臓におけるApoB1遺伝子の発現量を定量的PCRにて分析した結果を示すグラフである。
【図9】図9は、二重鎖核酸のある態様を示す概略図である。表記は図3~6におけるそれらと同義である。
【図10】図10は、ある実施態様によって、二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価するために用いた、アンチセンス鎖(ASO)と、その相補鎖(cRNA(o)、cRNA(G)、及びcRNA(m/S))とを示す概略図である。表記は、図3~6及び9におけるそれらと同義である。
【図11】図11は、図10に示したアンチセンス鎖と相補鎖とのアニーリングの有無を電気泳動により分析した結果を示す写真である。パネルAはUV照射下で写真撮影した結果を示し、パネルBはゲルの写真を示す。
【図12】図12は、図10に示したアンチセンス鎖と相補鎖とをアニーリングさせ、さらにRNaseHにて処理したものを電気泳動により分析した結果を示す、UV照射下にて撮影した写真である。
【図13】図13は、図10に示したアンチセンス鎖、又は、図10に示したアンチセンス鎖と相補鎖のうちの1つとからなる二重鎖核酸を(0.4nM又は10nMの濃度にて)細胞に導入して、得られた結果を示すグラフである。転写産物が前記アンチセンス鎖の標的となるApoB1遺伝子の前記細胞における発現量は定量的PCRにて分析した。
【図14】図14は、図10に示したアンチセンス鎖、又は、図10に示したアンチセンス鎖と相補鎖のうちの1つとからなる二重鎖核酸を導入した細胞におけるApoB1遺伝子の発現量を、アンチセンス鎖のみを導入した細胞におけるそれを基準にして分析した結果を示すグラフである。
【図15】図15は、二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価するために用いた、アンチセンス鎖と、相補鎖(cRNA(G))と、トコフェロール機能性部分を備えた相補鎖(Toc-cRNA(G))とを示す概略図である。「Toc」は、トコフェロールを示す。他の表記は、図3~6、9及び10におけるそれらと同義である。
【図16】図16は、図15に示したアンチセンス鎖、又は、図15に示したアンチセンス鎖と相補鎖のうちの1つとからなる二重鎖核酸をマウスに投与し、転写産物が該アンチセンス鎖の標的となるApoB1遺伝子の当該マウスにおける発現量を分析した結果を示すグラフである。
【図17】図17は、図15に示したアンチセンス鎖及びトコフェロールが結合している相補鎖からなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果の特異性を評価した結果を示すグラフである。
【図18】図18は、図15に示したアンチセンス鎖及びトコフェロールが結合している相補鎖からなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果の用量依存性を評価した結果を示すグラフである。
【図19A】図19Aは、図15に示したアンチセンス鎖及びトコフェロールが結合している相補鎖からなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果の持続性を評価した結果を示すグラフである。なお図中、「d」は当該二重鎖核酸を投与してからの日数を示す。
【図19B】図19Bは、図15に示したアンチセンス鎖及びトコフェロールが結合している相補鎖からなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果の持続性を評価した結果を示すグラフである。なお図中、「d」は当該二重鎖核酸を投与してからの日数を示す。
【図20A】図20Aは、ある実施態様における、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補鎖とを示す概略図である。
【図20B】図20Bは、全て2’-O-メチル化処理されているRNAを含む相補鎖を有する、本発明のある実施態様における二重鎖核酸複合体(LNA/cRNA(G)-OM)のアンチセンス効果を評価することにより、得られた結果を比較したグラフである。
【図21】図21は、機能性部分としてのペプチド、タンパク質等を組み込むために利用可能な、二重鎖核酸の好適な態様を示す概略図である。図中の表記は図3及び4におけるそれらと同義である。
【図22】図22は、3本の鎖、すなわちアンチセンス鎖と、RNAを含む相補鎖と、ペプチド等を結合させるためのPNA鎖とからなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価することによって得られた結果を示すグラフである。
【図23】図23は、PNAを含む相補鎖とアンチセンス鎖とからなる二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価することによって得られた結果を示すグラフである。
【図24】図24は、ある実施態様における、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補鎖とを示す概略図である。
【図25A】図25Aは、図24に示す鎖から調製した二重鎖核酸複合体に関し、得られた結果を示すグラフである。
【図25B】図25Bは、図24に示す鎖から調製した二重鎖核酸複合体に関し、得られた結果を示すグラフである。
【図26】図26は、二重鎖核酸複合体による発現抑制に関し、実施例11において得られた結果を示すグラフである。
【図27A】図27Aは、異なる鎖長の二重鎖核酸複合体によるhTTRの発現抑制を評価した、実施例12において得られた結果を示すグラフである。
【図27B】図27Bは、異なる鎖長の二重鎖核酸複合体によるhTTRの発現抑制を評価した、実施例12において得られた結果を示すグラフである。
【図28】図28は、二重鎖核酸複合体が標的とするタンパク質の血清中のレベルを、該複合体の投与前後にて評価した、実施例12において得られた結果を示すグラフである。
【図29】図29は、3本の鎖を含む二重鎖核酸複合体の局在を示す、実施例13において得られた結果を示す蛍光画像である。
【図30】図30は、3本の鎖を含む二重鎖核酸複合体によって生じる発現抑制を示す、実施例13の結果を示すグラフである。
【図31】図31は、miRNAレベルの抑制を示す、実施例14の結果を示すグラフである。
【図32】図32は、アミドBNA(AmNA)ヌクレオチドアナログを有するASOを含む二重鎖核酸複合体による発現抑制を示す、実施例15において得られた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0017】
アンチセンス核酸と該アンチセンス核酸に相補的な核酸とを含む二重鎖核酸複合体
ある実施形態において、精製又は単離された二重鎖核酸複合体は、第2の核酸鎖にアニーリングしている第1の核酸鎖を含み、標的遺伝子の発現、又は通常転写産物レベルをアンチセンス効果によって抑制する活性を有する。

【0018】
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、
(ii)転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)少なくとも1つの非天然ヌクレオチドを含み、
(iv)前記転写産物にハイブリダイズする。

【0019】
第2の核酸鎖は、
(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
(iii)PNAヌクレオチドを含む。

【0020】
「アンチセンス効果」とは、標的転写産物(RNAセンス鎖)と、例えば、その部分配列に相補的なDNA鎖、又は通常アンチセンス効果が生じるように設計された鎖等とがハイブリダイズすることによって生じる、標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルの抑制を意味する。ある場合において、ハイブリダイゼーション産物により前記転写産物を被覆することによって生じ得る翻訳の阻害又はエキソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果(図1の点線囲み枠外上部分の記載 参照)、及び/又は、ハイブリダイズした部分が認識されることにより生じ得る前記転写産物の分解(図1の点線囲み枠内の記載 参照)によって生じる、前記抑制を意味する。

【0021】
アンチセンス効果によって発現が抑制される「標的遺伝子」又は「標的転写産物」としては、特に制限はなく、各種疾患において発現が亢進している遺伝子が挙げられる。また「標的遺伝子の転写産物」とは、標的遺伝子をコードするゲノムDNAから転写されたmRNAのことであり、塩基の修飾を受けていないmRNAや、スプライシングを受けていないmRNA前駆体等も含まれる。通常、「転写産物」は、DNA依存性RNAポリメラーゼによって合成される、いかなるRNAでもよい。

【0022】
「精製又は単離された二重鎖核酸複合体」という文言は、ここでは少なくとも1のヌクレオチド鎖を含む核酸複合体であって、天然では生じず、また天然に生じる核酸物質を実質的に含まないものを意味する。

【0023】
「相補的」という文言は、ここでは水素結合を介して、いわゆるワトソン-クリック型塩基対(天然型塩基対)や非ワトソン-クリック型塩基対(フーグスティーン型塩基対等)を形成できる関係のことを意味する。標的転写産物の塩基配列、例えば、標的遺伝子の転写産物と、第1の核酸鎖の塩基配列とは、完全に相補的である必要はなく、少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の相補性を有していればよい。配列の相補性は、BLASTプログラム等を利用することにより決定することができる。第1の核酸鎖と第2の核酸鎖とは、それらの配列が相補的である場合に「アニーリング」し得る。当業者であれば、2本の核酸鎖がアニーリングできる条件(温度、塩濃度等)を容易に決定することができる。また、当業者であれば、例えば、標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。

【0024】
ある実施形態においては、第1の核酸鎖は、標的遺伝子の転写産物等の標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸であって、第1の核酸鎖が前記転写産物にハイブリダイズした際に、少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含む領域を有する核酸である。

【0025】
ここでは、「核酸」とはモノマーヌクレオチドを意味する場合もあり、複数のモノマーから構成されるオリゴヌクレオチドを意味する場合もある。「核酸鎖」という文言は、ここではオリゴヌクレオチドを称するためにも用いられる。核酸鎖は、その全部又は一部を、自動合成機の使用といった化学合成法によって調製してもよく、ポリメラ—ゼ、ライゲース又は制限酵素反応に限定されるわけではないが、酵素処理により調製してもよい。

【0026】
第1の核酸鎖の鎖長としては特に制限はないが、少なくとも8塩基であり、少なくとも10塩基であり、少なくとも12塩基であり、又は少なくとも13塩基である。前記鎖長は、20塩基以下、25塩基以下又は35塩基以下であってもよく、約100塩基であってもよい。前記鎖長の範囲は、10~35塩基であり、12~25塩基であり、又は13~20塩基である。ある場合においては、通常、前記標的に対する核酸鎖によるアンチセンス効果の強さや、費用、合成収率等の他の要素に応じて、鎖長は選択される。

【0027】
「RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチド」は、通常、4~20塩基の連続したヌクレオチドを含む領域であり、5~16塩基の連続したヌクレオチドを含む領域であり、又は、6~12塩基の連続しヌクレオチドを含む領域である。また、この領域には、天然型DNAのような、RNAヌクレオチドにハイブリダイズした際に、RNA鎖を切断するRNaseHによって認識されるヌクレオチドを用いることができる。修飾されたDNAヌクレオチド及び他の塩基といった、好適なヌクレオチドは、この分野において知られている。また、RNAヌクレオチドのような、2’位にヒドロキシ基を有するヌクレオチドは、不適当であることも知られている。「少なくとも4つの連続したヌクレオチド」を含むこの領域への利用に関し、当業者であればヌクレオチドの適合性を容易に決定することができる。

【0028】
ある実施形態において、第1の核酸鎖は「ヌクレオチド及び任意にヌクレオチドアナログ」を含む。この文言は、第1の核酸鎖は、DNAヌクレオチド、RNAヌクレオチドを有し、また当該核酸鎖において任意にヌクレオチドアナログを更に有していてもよいということを意味する。

【0029】
ここで「DNAヌクレオチド」は、天然に存在するDNAヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているDNAヌクレオチドを意味する。同様に、「RNAヌクレオチド」は、天然に存在するRNAヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているRNAヌクレオチドを意味する。塩基、糖又はリン酸塩結合のサブユニットの修飾とは、1の置換基の付加、又は、サブユニット内における1の置換のことであり、サブユニット全体を異なる化学基に置換することではない。ヌクレオチドを含む領域の一部又は全部は、DNA分解酵素等に対する耐性が高いという観点から、DNAは修飾されたヌクレオチドであってもよい。このような修飾としては、例えば、シトシンの5-メチル化、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、N4-メチル化、チミジンの5-デメチル化、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、アデニンのN6-メチル化、8-ブロモ化、グアニンのN2-メチル化、8-ブロモ化、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル-メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、2’-O-メチル化、2’-メトキシエチル(MOE)化、2’-アミノプロピル(AP)化、2’-フルオロ化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が好ましい。さらに、かかる修飾は同一のDNAに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。また、後述の通り、同様の効果を奏するために、RNAヌクレオチドに修飾を施してもよい。

【0030】
ある場合において、修飾されたDNAの数や位置によっては、ここで開示する二重鎖核酸が奏するアンチセンス効果等に影響を与えることになるかもしれない。これらの態様は、標的遺伝子の配列等によっても異なるため、一概には言えないが、当業者であれば、前記アンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、決定することができる。また、修飾後の二重鎖核酸複合体が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前の二重鎖核酸複合体のそれよりも有意に低下していなければ(例えば、修飾後の二重鎖核酸複合体の測定値が修飾前の二重鎖核酸複合体の測定値の30%以上であれば)、当該修飾は評価することができる。アンチセンス効果の測定は、例えば、後述の実施例において示されているような、細胞等に被検核酸化合物を導入し、該被検核酸化合物が奏するアンチセンス効果によって抑制された該細胞等における標的遺伝子の発現量(mRNA量、cDNA量、タンパク質量等)を、ノザンブロッティング、定量的PCR、ウェスタンブロッティング等の公知の手法を適宜利用することによって行うことができる。

【0031】
ここで「ヌクレオチドアナログ」は天然には存在しないヌクレオチドを意味し、ヌクレオチドの塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットにおいて、2以上の置換基が付加されており、若しくは、サブユニット内が2以上置換されており、又はサブユニット全体を異なる化学基に置換されていることを意味する。2以上の置換を伴うアナログの例としては、架橋化核酸が挙げられる。架橋化核酸は、糖環における2箇所の置換に基づいて架橋ユニットが付加されるヌクレオチドアナログであり、典型的には、2’位の炭素と4’位の炭素とが結合しているヌクレオチドアナログが挙げられる。ある実施形態における第1の核酸鎖においては、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び/又は核酸分解酵素に対する耐性が増大させるという観点から、第1の核酸鎖はヌクレオチドアナログをさらに含む。「ヌクレオチドアナログ」としては、修飾(架橋、置換等)により、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び/又は核酸分解酵素に対する耐性が増大されているヌクレオチドであればよく、例えば、特開平10-304889号公報国際公開第2005/021570号、特開平10-195098号公報、特表2002-521310号公報、国際公開第2007/143315号、国際公開第2008/043753号、国際公開第2008/029619号、国際公開第2008/049085号(以下、これら文献を「アンチセンス法に関する文献」とも称する)において、アンチセンス法に好適に用いられるとして開示されている核酸が挙げられる。すなわち、前記文献に開示されている核酸:ヘキシトール核酸(HNA)、シクロヘキセン核酸(CeNA)、ペプチド核酸(PNA)、グリコール核酸(GNA)、トレオース核酸(TNA)、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA(tcDNA)、2’-O-メチル化核酸、2’-MOE(2’-O-メトキシエチル)化核酸、2’-AP(2’-O-アミノプロピル)化核酸、2’-フルオロ化核酸、2’F‐アラビノ核酸(2'-F-ANA)、BNA(架橋化核酸(Bridged Nucleic Acid)が挙げられる。

【0032】
ある実施態様におけるBNAとしては、2’位の炭素と4’位の炭素とが、2以上の原子によって架橋されているリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであればよい。架橋化核酸の例は当業者に知られている。このようなBNAの一のサブグループとしては、2’位の炭素と4’位の炭素とが、4’-(CH-O-2’、4’-(CH-S-2’、4’-(CH-OCO-2’、4’-(CH-N(R)-O-(CH-2’によって架橋されているBNAを挙げられる(ここで、p、m及びnは、各々1~4、0~2及び1~3の整数である。Rは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基(蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は細胞内若しくは核内移行シグナルペプチド等)を示す)。さらに、ある実施態様におけるBNAにおいて、3’位の炭素における置換基:OR及び5’位の炭素における置換基:ORのR及びRは、典型的には水素原子であるが、同一又は異なっていてもよく、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、-P(R)R(式中、R及びRは、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数1~5のアルコキシ基、炭素数1~5のアルキルチオ基、炭素数1~6のシアノアルコキシ基、又は、炭素数1~5のアルキル基で置換されたアミノ基を示す)であってもよい。このようなBNAとしては、例えば、LNA(ロックド核酸(Locked Nucleic Acid(登録商標)、2’,4’-BNA)とも称される、α-L-メチレンオキシ(4’-CH-O-2’)BNA)又はβ-D-メチレンオキシ(4’-CH-O-2’)BNA、ENAとも称されるエチレンオキシ(4’-(CH-O-2’)BNA)、β-D-チオ(4’-CH-S-2’)BNA、アミノオキシ(4’-CH-O-N(R)-2’)BNA、2’,4’-BNANCとも称されるオキシアミノ(4’-CH-N(R)-O-2’)BNA、2’,4’-BNACOC、3’アミノ-2’,4’-BNA,5’-メチルBNA,cEt-BNAとも称される(4’-CH(CH)-O-2’)BNA,cMOE-BNAとも称される(4’-CH(CHOCH)-O-2’)BNA,AmNAとも称されるアミドBNA (4’-C(O)-N(R)-2’)BNA (R=H,Me),当業者に知られた他のBNAが挙げられる。

【0033】
さらに、ある実施態様における修飾核酸においては、塩基部位が修飾されていてもよい。塩基部位の修飾としては、例えば、シトシンの5-メチル化、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、N4-メチル化、チミジンの5-デメチル化、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、アデニンのN6-メチル化、8-ブロモ化、グアニンのN2-メチル化、8-ブロモ化が挙げられる。さらにまた、ある実施態様における修飾核酸においては、リン酸ジエステル結合部位が修飾されていてもよい。リン酸ジエステル結合部位の修飾としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル-メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が用いられる。また、このような塩基部位の修飾やリン酸ジエステル結合部位の修飾は同一の核酸に対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。

【0034】
全体として、修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドアナログは、ここで例示したものに限定されるわけではない。多数の修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドアナログが当該分野では知られており、例えば、Tachasらの米国特許第8299039号明細書の記載、特に17~22欄の記載を、本願の実施態様として利用することもできる。

【0035】
当業者であれば、このような修飾核酸の中から、アンチセンス効果、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性、核酸分解酵素に対する耐性等の観点を考慮し、適宜ヌクレオチドアナログを選択して利用することができるが、ある実施形態において、ヌクレオチドアナログは下記式(1)で表わされるLNAである。

【0036】
【化1】
JP0006112569B2_000002t.gif

【0037】
(式(1)中、Baseは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基若しくは芳香族炭化水素環基、例えば、天然型ヌクレオシドの塩基部位(プリン塩基、ピリミジン塩基)又は非天然型(修飾)ヌクレオシドの塩基部位を示す。なお、塩基部位の修飾の例は、前述の通りである。
、Rは、同一又は異なっていてもよく、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、-P(R)R[ここで、R及びRは、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数1~5のアルコキシ基、炭素数1~5のアルキルチオ基、炭素数1~6のシアノアルコキシ基、又は、炭素数1~5のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。]を示す。

【0038】
なお、前記化学式において示されている化合物はヌクレオシドであるが、ある実施形態における「LNA」及び通常BNAには、当該ヌクレオシドにリン酸基が結合した形態(ヌクレオチド)も含まれる。すなわち、LNAといったBNAは、二重鎖核酸複合体を含む核酸鎖に、ヌクレオチドとして組み込まれる。

【0039】
ある実施態様における「1又は複数のヌクレオチドアナログを含むウィング領域」は、前記少なくとも4つ以上の連続したDNAヌクレオチドを含む領域(以下「DNAギャップ領域」とも称する)の5'末側及び/又は3'末側に配置されるものである。

【0040】
該DNAギャップ領域の5’末端に配置されたヌクレオチドアナログを含む領域(以下「5’ウィング領域」とも称する)、及び該DNAギャップ領域の3’末端に配置されたヌクレオチドアナログを含む領域(以下「3’ウィング領域」とも称する)は、それぞれ独立したものであり、前記アンチセンス法に関する文献に挙げられているヌクレオチドアナログを少なくとも1種含んでいればよく、さらに、かかるヌクレオチドアナログ以外に天然型の核酸(DNA又はRNA)も含まれていてもよい。また、5’ウィング領域及び3’ウィング領域の鎖長は独立的に、通常1~10塩基であり、1~7塩基、又は2~5塩基である。

【0041】
さらに、5’ウィング領域及び3’ウィング領域において、ヌクレオチドアナログ及び天然型のヌクレオチドの種類や数や位置については、ある実施形態における二重鎖核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、好ましい態様は、配列等によっても変わり得る。一概には言えないが、当業者であれば、前記アンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、好ましい態様を決定することができる。また、前記「少なくとも4つ以上の連続したDNAヌクレオチド」を含む領域同様に、修飾後の二重鎖核酸が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前の二重鎖核酸のそれよりも有意に低下していなければ、当該修飾は好ましい態様であると評価することができる。

【0042】
なお、従前から試みられているRNAやLNAのみからなるアンチセンス法は、標的となるmRNAと結合することで翻訳を抑制したが、その効果は概して不十分であった。一方DNAのみからなるアンチセンス法では、標的遺伝子と結合するとDNAとRNAからなる二本鎖構造となるため、RNaseHの標的となることでmRNAが切断されることにより強い標的遺伝子発現抑制効果が期待できたが、標的遺伝子との結合自体が弱いため実際の効果はやはり不十分だった。

【0043】
従って、第1の核酸鎖において、中央に少なくとも4塩基以上の鎖長のDNAが配置され、さらにRNA(すなわち、標的転写産物)と強い結合能力を持つLNA(又は他のBNA)が両端に配置されることによって、このような複合鎖は、RNaseHによる標的RNAの切断を促進することとなる。「鎖長が4塩基であるDNA」は、DNAヌクレオチドだけに制限されるわけではなく、第1の核酸鎖が転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを、第1の核酸鎖が含むことも意図するものである。ある実施形態において、標的転写産物とのヘテロ二重鎖形成により生じるアンチセンス効果が極めて高いという観点から、第1の核酸鎖が転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含む領域の、5'末側及び3'末側に配置された修飾核酸を含む領域は、任意にヌクレオチドアナログを含んでいることが望ましい。該ヌクレオチドアナログはBNAであってもよく、例えばLNAであってもよい。

【0044】
ある実施形態における第2の核酸鎖は、前述の第1の核酸鎖と相補的な核酸である。第2の核酸鎖の塩基配列と第1の核酸鎖の塩基配列とは、完全に相補的である必要はなく、少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の相補性を有していればよい。

【0045】
第2の核酸鎖としては、RNA、DNA、PNA(ペプチド核酸)及びBNA(例えば、LNA)からなる群から選択される少なくとも1種の核酸からなるオリゴブクレオチドである。より具体的には、第2の核酸鎖は、(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、(iii)PNAヌクレオチドを含む。

【0046】
「RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含む」という文言は、第2の核酸鎖はRNAヌクレオチドを含み、さらに任意にヌクレオチドアナログを含んでもよく、さらにまた任意にDNAヌクレオチドを含んでもよいということを意味する。「DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含む」という文言は、第2の核酸鎖はDNAヌクレオチド及びヌクレオチドアナログのいずれかを含んでいてもよく、またDNAヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを共に含んでいてもよいということを意味する。「PNAヌクレオチドを含む」とは第2の核酸鎖はPNAヌクレオチドから構成されてもよいということを意味する。

【0047】
しかしながら、後述の実施例において示すように、ある実施形態における二重鎖核酸複合体が細胞内のRNaseHに認識され、第2の核酸鎖が分解されることにより、第1の核酸鎖のアンチセンス効果が発揮し易くなるという観点から、第2の核酸鎖はRNAを含む。また、ある実施形態における二重鎖核酸複合体にペプチド等の機能性分子を結合させ易いという観点からは、第2の核酸鎖はPNAである。

【0048】
ここで、「RNAヌクレオチド」は、天然に存在するRNAヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているRNAヌクレオチドを意味する。塩基、糖又はリン酸塩結合のサブユニットの修飾とは、1の置換基の付加、又は、サブユニット内における1の置換のことであり、サブユニット全体を異なる化学基に置換することではない。

【0049】
第2の核酸鎖において、核酸の一部又は全部は、RNA分解酵素等の核酸分解酵素に対する耐性が高いという観点から、修飾されたヌクレオチドであってもよい。このような修飾としては、例えば、シトシンの5-メチル化、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、N4-メチル化、チミジンの5-デメチル化、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、アデニンのN6-メチル化、8-ブロモ化、グアニンのN2-メチル化、8-ブロモ化、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル-メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、2’-O-メチル化、2’-メトキシエチル(MOE)化、2’-アミノプロピル(AP)化、2’-フルオロ化が挙げられる。また、ウラシル塩基をチミジン塩基に置換したRNAヌクレオチドの利用も考えられるが、薬物動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が用いられる。また、かかる修飾は同一の核酸に対して、複数種組み合わせて施されていても良く、例えば、後述の実施例において用いられているように、酵素による切断に対する抵抗性を付与するため、同一のRNAに対して、ホスホロチオエ—ト化及び2’-O-メチル化を施してもよい。しかしながら、RNaseHによってRNAヌクレオチドが切断されることを期待し、又は望む場合には、ホスホロチオエ—ト化及び2’-O-メチル化のいずれかのみを施すことができる。

【0050】
修飾の数や位置は、ある実施形態における二重鎖核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、第2の核酸鎖におけるヌクレオチドアナログの数及び修飾の位置には好ましい態様が存在する。この好ましい態様は、修飾対象となる核酸の種類、配列等によっても異なるため、一概には言えないが、前述の第1の核酸鎖同様に、修飾後の二重鎖核酸が有するアンチセンス効果を測定することにより特定することができる。このような好ましい態様として、第2の核酸鎖が特定の細胞の核内に送達されるまで、RNaseA等のRNA分解酵素による分解を抑制しつつも、特定の細胞内においてはRNaseHにより該核酸鎖が分解されることにより、アンチセンス効果を発揮し易いという観点から、第2の核酸鎖はRNAであって、第1の核酸鎖のヌクレオチドアナログを含む領域(すなわち、5’ウィング領域及び/又は3’ウィング領域)に対して相補的な領域は、修飾された核酸又はヌクレオチドアナログであり、前記修飾又はアナログがRNA分解酵素等の酵素による分解を抑制する効果を有するものである。ある実施態様においては、前記修飾はRNAに対する2’-O-メチル化及び/又はホスホロチオエ—ト化である。また、このような場合、第1の核酸鎖のヌクレオチドアナログを含む領域に相補的な領域の全てが修飾されていてもよく、第1の核酸鎖の修飾核酸を含む領域に相補的な領域の一部が修飾されていてもよい。さらに、修飾されている領域は、該一部を含む限り、第1の核酸鎖の修飾核酸を含む領域よりも長くなっていてもよく、短くなっていてもよい。

【0051】
ある実施形態における二重鎖核酸複合体において、第2の核酸鎖に機能性部分が結合していてもよい。第2の核酸鎖と機能性部分との結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、ある実施形態において、共有結合、イオン結合、水素結合等で第2の核酸鎖と機能性部分とが直接的に結合していることが好ましく、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合がより好ましい。

【0052】
ある実施形態において、「機能性部分」の構造上、特に制限はなく、それを結合する二重鎖核酸複合体及び/又は核酸鎖に所望の機能を付与する。所望の機能としては、標識機能、精製機能及び標的への送達機能が挙げられる。標識機能を付与する部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。精製機能を付与する部分の例としては、ビオチン、アビジン、Hisタグペプチド、GSTタグペプチド、FLAGタグペプチド等の化合物が挙げられる。

【0053】
また、第1の核酸鎖を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制するという観点から、第2の核酸鎖に機能性部分として、ある実施形態における二重鎖核酸複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。

【0054】
「標的への送達機能」を有する部分として、例えば、肝臓等に特異性高く効率的にある実施形態における二重鎖核酸複合体を送達できるという観点から、脂質が挙げられる。このような脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質(例えば、ビタミンE(トコフェロール類、トコトリエノール類)、ビタミンA,ビタミンD)、ビタミンK等の脂溶性ビタミン(例えば、アシルカルニチン)、アシルCoA等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、並びにそれらの誘導体等を例示することができるが、これらの中では、より安全性が高いという観点から、ある実施形態において、コレステロール、ビタミンE(トコフェロール類、トコトリエノール類)を利用することが好ましい。また、脳に特異性高く効率的に本発明の二重鎖核酸を送達できるという観点から、ある実施形態における「機能性部分」としては、糖(例えば、グルコース、スクロース)が挙げられる。また、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に結合することにより、当該臓器に特異性高く効率的にある実施形態における二重鎖核酸複合体を送達できるという観点から、受容体のリガンドや抗体、及び/又はそれらの断片等のペプチド又はタンパク質が、ある実施形態における「機能性部分」として挙げられる。

【0055】
ある実施形態における二重鎖核酸複合体において、第1の核酸鎖の鎖長と第2の核酸鎖の鎖長とは同一であってもよく、異なっていてもよい。ある実施形態において、第1の核酸鎖又は第2の核酸鎖の鎖長が同一である二重鎖核酸複合体としては、例えば、図3に示す二重鎖核酸の態様が挙げられる。

【0056】
また、ある実施形態において、第1の核酸鎖又は第2の核酸鎖の鎖長が異なる本発明の二重鎖核酸としては、例えば、図4及び5に示す二重鎖核酸の態様が挙げられる。すなわち、いくつかの実施態様においては、前述の第1及び第2の核酸鎖に加え、さらに、第3の核酸鎖を含む、二重鎖核酸を提供することができる。

【0057】
第3の核酸鎖は、第1及び第2の核酸鎖のうち鎖長が長い核酸における他の一方の核酸に対して突出した領域に対して相補的な核酸鎖である。

【0058】
いくつかの実施形態において、第3の核酸鎖は、第1の核酸鎖のように、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして機能する。第3の核酸鎖は、第1の核酸鎖と同一の配列を標的とすることも、異なる配列を標的とすることもできる。このように、前述の第1の核酸鎖に関する構造及びヌクレオチドの構成は、同様に、第3の核酸鎖の構造及び構成として適用し得る。また第2の核酸鎖と同様に、第3の核酸鎖に前述の機能性部分を直接又は間接的に結合させることにより、様々な機能を第3の核酸鎖に付与することができ、例えば、薬剤送達複合体として機能させることができる。

【0059】
例えば、図4に示すように、第3の核酸鎖としてPNAを用いた場合には、PNAとタンパク質(アミノ酸)とはペプチド結合を介して結合させることができるので、いくつかの実施形態において、タンパク質等を含む機能性部分を有する二重鎖核酸複合体を容易に調製することができる。また、図4に示す二重鎖核酸のPNAは、図3の下部に示す、いくつかの実施形態における二重鎖核酸のRNAよりも鎖長が短くて済み、さらに標的遺伝子の塩基配列にPNAを対応させる必要がないので、量産することができる。一般的にPNAの合成にはコストがかかるため、図4に示す二重鎖核酸は比較的安価な二重鎖核酸を提供できるという点で好ましい態様である。特に、図4の下部に示す二重鎖核酸については、タンパク質等を含む第1の機能性部分のみならず、脂質等を含んでいてもよい第2の機能性部分も有しているので、二重鎖核酸複合体を標的部位により特異性高く、より効率良く送達することが可能となる。

【0060】
また、一般的に、化合物を経腸投与(経口投与等)した場合には、その化合物は血管ではなく、リンパ管を通して生体内に拡散されていく。しかしながら、リンパ管に達するためには、化合物の分子量は11000~17000ダルトン以上であることが必要となる。さらに、経腸投与した化合物は、腸管内のRNaseAに曝露されることになるため、RNAを含有する核酸医薬は、当該RNAの部分を全て2’-O-メチル化等にて修飾しておくことが極めて好ましい。従って、図5に示す二重鎖核酸は、約18000ダルトンの分子量を有し、RNA部分が全て2’-O-メチル化されているので、経腸投与に好適に利用できる。また、図5の下部に示す二重鎖核酸においては、DNA鎖(第3の核酸鎖)と、該DNA鎖及びRNAからなる相補鎖(第2の核酸鎖)を結合させるヘアピンループ核酸(好ましくは4~9塩基からなる核酸)とを有する。

【0061】
以上、いくつかの実施態様において、二重鎖核酸複合体の好適な典型例について説明したが、いくつかの実施態様における二重鎖核酸は上記典型例に限定されるものではない。また、いくつかの実施形態において、第1の核酸鎖、第2の核酸鎖及び第3の核酸鎖は、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができる。例えば、標的転写産物の塩基配列(又は、いくつかの場合においては標的遺伝子の塩基配列)の情報に基づいて、核酸の塩基配列を設計し、市販の核酸自動合成機(アプライドバイオシステムズ社製、べックマン社製等)を用いて合成し、次いで、得られるオリゴヌクレオチドを逆相カラム等を用いて精製することにより、核酸を調製することができる。そして、このようにして調製した核酸を適当な緩衝液中にて混合し、約90~98℃にて数分間(例えば、5分間)かけて変性させた後、約30~70℃にて約1~8時間かけてアニーリングさせることにより、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体を調製することができる。また、機能性部分が結合している二重鎖核酸複合体は、予め機能性部分を結合させた核酸種を用いて、前記の通り、合成、精製及びアニーリングすることにより、調製することができる。機能性部分と核酸とを結合させるための多くの方法は、当該分野においてよく知られている。

【0062】
以上、本発明の二重鎖核酸の好適な実施態様について説明したが、後述の実施例において示す通り、いくつかの実施形態にかかる「第2の核酸鎖」は、アンチセンス効果を低下させることなく、アンチセンス核酸を標的部位に効率良く送達できるという点において優れている。従って、いくつかの実施形態における二重鎖核酸は上記実施態様に限定されるものではなく、例えば、前述の第1の核酸鎖の代わりに、下記アンチセンス核酸を含む態様も提供することができる。

【0063】
標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する活性を有する二重鎖核酸複合体であって、(i)標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸であって、DNAを含まない核酸と、(ii)(i)の核酸に相補的な核酸とを含む二重鎖核酸複合体。

【0064】
すなわち、ある実施形態において、アンチセンス核酸はRNaseH非依存的アンチセンス効果を有する。「RNaseH非依存的アンチセンス効果」とは、標的遺伝子の転写産物(RNAセンス鎖)と、その部分配列に相補的な核酸鎖とがハイブリダイズすることによる翻訳の阻害やエキソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果によって生じる標的遺伝子の発現を抑制する活性のことを意味する(図1の点線囲み枠外上部分の記載 参照)。

【0065】
「DNAを含まない核酸」は、天然型DNA及び修飾されたDNAを含まないアンチセンス核酸を意味し、例えば、PNA又はモルホリノ核酸からなる核酸が挙げられる。また、「DNAを含まない核酸」において、第1の核酸鎖又は第2の核酸鎖同様に、核酸の一部又は全部は、核酸分解酵素に対する耐性が高いという観点から、修飾されたヌクレオチドにて構成されていてもよい。このような修飾の例としては前述の通りであり、さらに、修飾は同一の核酸に対して複数種組み合わせて施されていてもよい。また、修飾された核酸の数や修飾の位置に関する好ましい態様は、前述の第1の核酸鎖同様に、修飾後の二重鎖核酸が有するアンチセンス効果を測定することにより特定することができる。

【0066】
「DNAを含まない核酸」の塩基配列と、該核酸に相補的な核酸の塩基配列又は標的遺伝子の転写産物の塩基配列とは、完全に相補的である必要はなく、少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の相補性を有していればよい。

【0067】
「DNAを含まない核酸」の鎖長としては特に制限はないが、通常10~35塩基であり、好ましくは12~25塩基であり、より好ましくは13~20塩基である。

【0068】
いくつかの実施形態にかかる「DNAを含まない核酸に相補的な核酸」は、前述の第2の核酸鎖と同様である。また、DNAを含まない核酸と該核酸に相補的な核酸との鎖長が異なる場合には、この態様においても前記第3の核酸鎖を含んでもよい。さらに、この態様においても、「DNAを含まない核酸に相補的な核酸」及び/又は第3の核酸鎖に前述の機能性部分が結合していてもよい。

【0069】
標的遺伝子の発現又は標的転写産物をアンチセンス効果によって抑制するための組成物
いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体は、後述の実施例において示す通り、特異性高く効率良く標的部位に送達され、かつ標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することができる。従って、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体を有効成分として含有する、例えば、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制するための組成物を、本発明は提供することができる。特に、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体は、低濃度の投与により高い薬効を得ることができ、かつアンチセンス核酸の送達標的領域以外の臓器における分布を抑制することにより、副作用も低減できるため、代謝性疾患、腫瘍、感染症といった標的遺伝子の発現亢進に伴う疾患を治療、予防するための医薬組成物も、いくつかの実施形態において提供することができる。

【0070】
いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体を含む組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経腸管的(経口的等)又は非経腸管的に使用することができる。

【0071】
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、pH調節剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。

【0072】
製剤化等に際し、非特許文献1に示すように、機能性部分として脂質が結合している、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体においては、カイロミクロンやカイロミクロンレムナント等のリポタンパク質との複合体を形成させてもよい。さらに、経腸投与の効率を高めるという観点から、前記リポタンパク質に加え、大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する物質(例えば、中鎖脂肪酸、長鎖不飽和脂肪酸又はそれらの誘導体(塩、エステル体又はエーテル体))及び界面活性剤(非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤)との複合体(混合ミセル、エマルジョン)であってもよい。

【0073】
いくつかの実施形態における組成物の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経腸管的(経口的等)又は非経腸管的、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。

【0074】
いくつかの実施形態における組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。

【0075】
いくつかの実施形態における組成物を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類(医薬品、飲食品など)等に応じて、適宜選択されるが、ある実施形態にかかる組成物の有効摂取量は、ヌクレオチド換算で0.001mg/kg/日~50mg/kg/日であることが好ましい。

【0076】
いくつかの実施形態における二重鎖核酸は、後述の実施例において示す通り、特異性高く効率的に標的部位に送達され、かつ標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することができる。従って、いくつかの実施形態においては、対象に対して、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体を投与し、標的遺伝子の発現又は標的転写産物をアンチセンス効果によって抑制する方法を提供することができる。また、いくつかの実施形態における組成物を対象に投与することによって、標的遺伝子の発現亢進等を伴う各種疾患を治療、予防するための方法をも提供することができる。
【実施例】
【0077】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下に記載の実験に供したマウスは、ICRマウス、4~6週齢、雌、体重は20~25gであり、マウスを用いた実験は特に断りのない限り、全てn=3~4にて施行した。また、本実施例で用いたBNAは前記式(1)で表わされるLNAである。また、比較例1及び実施例1~15に記載の配列を表1~3に示す。
【実施例】
【0078】
【表1】
JP0006112569B2_000003t.gif
【実施例】
【0079】
【表2】
JP0006112569B2_000004t.gif
【実施例】
【0080】
【表3】
JP0006112569B2_000005t.gif
【実施例】
【0081】
(比較例1)
アンチセンス法におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)の安定性、生体内における標的遺伝子の発現に対する抑制活性(アンチセンス効果)及び送達性を向上させるべく、コレステロールを直接結合させた、LNAヌクレオチド及びDNAヌクレオチドを含むASO(LNA/DNAギャップマー)の生体内における送達性及びアンチセンス効果を評価した。
【実施例】
【0082】
概要を図6に示した、LNA/DNAギャップマー構造を有する2つのASOを調製した。すなわち、蛍光色素であるCy3をLNA/DNAギャップマーASOの5’末端に共有結合したASO(Cy3-ASO)(図6A)と、Cy3-ASOの3’末端にコレステロールを共有結合したASO(Cy3-Chol-ASO)(図6B)とを用意した。なお、このASOの標的遺伝子はアポリポ蛋白B(ApoB)遺伝子であり、その配列は以下に示す通りである。また、これらASOは株式会社ジーンデザインに合成を依頼して調製した。
GCattggtatTC(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間:ホスホロチオエート結合)(配列番号:1)。
【実施例】
【0083】
なお、公知の手法に沿って、Cy3とASOとは、ホスホロチオエート結合にて結合させ、またコレステロールとASOとは、テトラエチレングリコールを介して結合させた。
【実施例】
【0084】
そして、これらASOをそれぞれマウス尾静脈から10mg/kgで静脈注射し、その1時間後に解剖して肝臓を取り出した。得られた肝臓を4% ホルマリン溶液で固定した後、30%スクロース溶液で置換し、OCTコンパウンドで包埋した後、10μmの厚さで切片を作製した。次いで、DAPIを用いて核染色した後、共焦点顕微鏡で切片におけるCy3の信号強度を比較した。得られた結果を図7に示す。
【実施例】
【0085】
また、Cy3-ASO及びCy3-Chol-ASOを、それぞれマウス3匹ずつに尾静脈から静脈注射し、その三日後にも二回目のASOの投与を行った。投与量はいずれも10mg/kgとした。また、陰性対照群としてASOの代わりにPBSのみを投与したマウスも用意した。そして、二回目の投与の翌日にマウスをPBSにて灌流した後、解剖して肝臓を摘出した。摘出した肝臓80mgに核酸抽出試薬(ISOGEN、ニッポンジーン社製)1mlを加え、添付のプロトコールに従ってmRNAを抽出した。次いで、これらのmRNAの濃度を測定し、一定量のmRNAからSuperScript III(インビトロジェン株式会社製)を用い、添付のプロトコールに従ってcDNAを合成した。そして、このように調製したcDNAを鋳型とし、TaqMan system(ロシュアプライドバイオサイエンス社製)を用いて定量的RT-PCRを行った。なお、定量的RT-PCRに用いたプライマーは、各遺伝子番号を元にライフテクノロジー社が設計、調製したものを使用した。また、温度、時間の条件は次の通りである。:95℃にて15秒、60℃にて30秒及び72℃にて1秒を1サイクルとし、それを40サイクル行った。そして、このようにして得られた定量的RT-PCRの結果に基づき、mApoBの発現量/mGAPDH(内部標準遺伝子)の発現量を各々算出して、陰性対照群の算出結果とASO投与群の算出結果とをt検定にて比較して評価した。得られた結果を図8に示す。
【実施例】
【0086】
図7に示した結果から明らかなように、コレステロールを直接結合させたLNA/DNAギャップマーの方が、コレステロールを結合させていないそれよりもはるかに多く肝臓に集積していた。
【実施例】
【0087】
しかし、図8に示す通り、LNA/DNAギャップマーにコレステロールを直接結合させて用いると、そのアンチセンス効果は喪失してしまうことが明らかになった。
【実施例】
【0088】
(実施例1)
コレステロール等の機能性部分をLNA/DNAギャップマー(アンチセンス鎖)に直接結合すると、そのアンチセンス効果が損なわれてしまうことが明らかになった。そこで、ASOの相補鎖が、ASOを直接送達するための機能性部分のキャリアーとして機能する、二重鎖核酸複合体を利用することを本発明者らは着想した。図9に、かかる複合体の1の実施態様の概略を示す。
【実施例】
【0089】
例えば、LNA/DNAギャップマー(LNA及びDNAを含むASO)の相補鎖としてRNAを用い、さらに当該RNAに機能性部分を結合させた場合には、当該ASOとRNAからなる相補鎖(cRNA)との複合体は、cRNAに結合させた機能性分子により標的部位に特異的に効率良く送達されることになる。そして、標的部位の細胞の核内に運ばれると、元々RNA-DNAヘテロオリゴヌクレオチドであるため核内に存在するRNaseHによってcRNAが切断され、前記ASOは単独で存在することになる。次いで、このASOが標的遺伝子のmRNAに結合し、新たなRNA-DNAヘテロ二重鎖が形成されることにより、アンチセンス効果を奏するため、RNaseHにより当該mRNAを分解されることになる。
【実施例】
【0090】
すなわち、機能性部分が結合しているcRNAの切断と、標的遺伝子のmRNAの分解とをRNaseHを利用して行うことにより、LNA/DNAギャップマー(LNA及びDNAを含むASO)を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ、当該ASOのアンチセンス効果は機能性部分によって阻害されることなく、標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制することが可能となることを、本発明者らは着想した。
【実施例】
【0091】
そして、このような着想を実証すべく、先ずは、以下に示す方法にて、LNA/DNAギャップマーとcRNAとの二重鎖DNAを調製し、その物性について評価した。
【実施例】
【0092】
LNA/DNAギャップマーとして、比較例1と同様に調製したCy3-ASOを使用した。また、cRNAとして、異なる3つの相補鎖を調製した。それら構造の概要を図10に示す。1の構造は、通常のRNA(天然型RNA)のみからなる相補鎖(cRNA-O)である。第2の構造においては、cRNA鎖の両末端の2塩基ずつを化学修飾(2’-O-メチル化及びホスホロチオエート化)してRNase耐性を持たせている(cRNA(G))。第3の構造においては、全て化学修飾(2’-O-メチル化及びホスホロチオエート化)してRNaseで切断されないようにしている(cRNA(m/S))。これらプローブは、北海道システム・サイエンス株式会社に委託して製造した。cRNA鎖の配列は以下の通りである。
cRNA(o):5’-GAAUACCAAUGC-3’(配列番号:2)
cRNA(G):5’-gAUACCAAUc-3’(配列番号:3)
cRNA(m/s):5’-gc-3’(配列番号:4)
(大文字:RNA,小文字:2’-OMe-RNA,s:核酸間の結合がホスホロチエート結合)。
【実施例】
【0093】
LNA/DNAギャップマーとcRNAとをそれぞれ等モル量にて混合し、95℃で5分間加熱した後、37℃で1時間保温することにより、これら核酸鎖をアニーリングさせ、二重鎖核酸複合体を形成させた。アニーリングさせた核酸は4℃又は氷上で保存した。
【実施例】
【0094】
次いで、各cRNAとアニーリングさせたCy3-ASO、及びCy3-ASOを、それぞれLNA量で100pmolずつ15%アクリルアミドゲルにアプライし、100Vで1時間電気泳動した。泳動後、ゲルを直接写真撮影し、次いでUV下で写真撮影した。得られた結果を図11A、Bに示す。
【実施例】
【0095】
また、各cRNAとアニーリングさせたCy3-ASO、及びCy3-ASOをRNaseHに処理したものを前記同様に電気泳動し、ゲルをUV照射下にて写真撮影した。得られた結果を図12に示す。
【実施例】
【0096】
図11に示した結果から明らかなように、一本鎖ASOであるCy3-LNA(レーン1)と比較して、Cy3-ASOとcRNA(o)とをアニーリングさせたもの、Cy3-ASOとcRNA(G)とをアニーリングさせたもの、Cy3-ASOとcRNA(m/S)とをアニーリングさせたものは、移動速度が遅く、各々二重鎖核酸を形成していることが確認された。
【実施例】
【0097】
また、図には示さないが、DNAを含む相補鎖(cDNA)とCy3-ASOとを混合して、前記同様にアニーリング処理したものを電気泳動にて分析したが、Cy3-ASOとバンドの高さが等しく、cDNAとCy3-ASOとでは二重鎖核酸が形成できないことも確認した。なお、評価したcDNAの配列及び修飾は、ウラシルをチミンに変更した以外、前記cRNA(o)、cRNA(G)及びcRNA(m/S)と同じである(以下、同様)。
【実施例】
【0098】
また、図12に示した結果から明らかなように、RNaseH処理を施しても、Cy3-ASO及びcRNA(m/s)からなる二本鎖は二重鎖核酸構造を維持したままであった。一方、cRNA(o)及びcRNA(G)は、Cy3-ASOと同程度の移動度であったため、二本鎖のうちの相補的RNA鎖がRNaseHにより分解され、1本鎖核酸Cy3-ASOが二本鎖から放出され、一本鎖と同程度の移動を示し得ることが確認された。
【実施例】
【0099】
次に、前記電気泳動の他、LNA/DNAギャップマー及びcRNAを含む二重鎖核酸の融点(Tm)について下記に示す方法にて評価した。
【実施例】
【0100】
終濃度をそれぞれ塩化ナトリウム100mM、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)10mM、各オリゴヌクレオチド鎖2μMとしたサンプル溶液(100μL)を沸騰水中に浴し、12時間かけて室温まで冷却した後、4℃で2時間放置した。窒素気流下、サンプル溶液を5℃まで冷却し、さらに15分間5℃に保った後、測定を開始した。0.5℃/minの割合で90℃まで昇温し、0.5℃間隔で260nmにおける吸光度をプロットした。また、T値は微分法により算出した。なお、上記測定はSHIMADZU UV-1650PCを用いて行った。得られた結果を表4に示す。
【実施例】
【0101】
【表4】
JP0006112569B2_000006t.gif
【実施例】
【0102】
表4に示した結果から明らかなように、LNA/DNAギャップマーとcDNAとが乖離する温度(Tm)は、全て体温よりも低かった。それに対し、LNA/DNAギャップマーとcRNAとが乖離する温度(Tm)は、いずれも40℃台を保っており、当該二重鎖核酸は室温や体温では乖離しないことが明らかになった。
【実施例】
【0103】
(実施例2)
実施例1と同様に、通常のRNAのみからなる相補鎖(cRNA(o))(配列番号:2)、全てのRNAにおいて2’-OMe(2’-O-メチル化)修飾及び核酸間がホスホロチオエート結合(S化)してある相補鎖(cRNA(m/S))(配列番号:4)、末端の2塩基のRNAのみに2’-OMe修飾及び核酸間がS化してあり、中央の8塩基を通常のRNAとしている相補鎖(cRNA(G))(配列番号:3)を用意し、いずれもLNA/DNAギャップマーとアニーリングさせ、二重鎖核酸を調製した。LNA/DNAギャップマーの標的遺伝子はラット由来のアポリポ蛋白B(rApoB)遺伝子である。ASOは、株式会社ジーンデザインにおいて合成にて製造された。
【実施例】
【0104】
ラット肝細胞の培養系(McA-RH7777)に、LNA/DNAギャップマー単独又は前記二重鎖核酸を、Lipofectamine2000(インビトロジェン社製)を用いて、添付の使用プロトコールに従い、トランスフェクションした。トランスフェクションの際の培地への添加濃度は0.4nM又は10nMとした。また、コントロールとして、核酸未添加の細胞も用意した。次いで、トランスフェクションしてから24時間後にISOGENを用いて細胞を回収して、添付の使用プロトコールに従い、mRNAを採取した。
【実施例】
【0105】
これらmRNAの濃度を測定し、一定量のmRNAからSuperScript IIIを用いて、添付のプロトコールに従ってcDNAを合成した。次いで、このように調製したcDNAを鋳型とし、TaqMan systemを用いて、定量的RT-PCRを行った。なお、定量的RT-PCRに用いたプライマーは、各遺伝子番号を元にライフテクノロジー社が設計、調製したものを使用した。また、温度、時間の条件は次の通りである。95℃にて15秒、60℃にて30秒及び72℃にて1秒を1サイクルとし、それを40サイクル行った。そして、このようにして得られた定量的RT-PCRの結果に基づき、rApoBの発現量/rGAPDH(内部標準遺伝子)の発現量を各々算出して、コントロールの算出結果と核酸投与群の算出結果とをt検定にて比較して評価した。得られた結果を図13に示す。また、前記二重鎖核酸複合体における算出結果とLNA/DNAギャップマー単独における算出結果とをt検定にて比較して評価した。得られた結果を図14に示す。
【実施例】
【0106】
図13に示す通り、0.4nMという低濃度で投与した場合には、LNA/DNAギャップマー(ss-ASO)と比較して、LNA/DNAギャップマー及びcRNA(o)を含む二重鎖核酸(LNA/RNA(o))、並びにLNA/DNAギャップマー及びcRNA(G)を含む二重鎖核酸(LNA/RNA(G))のアンチセンス効果はほぼ変わらないものであった。しかしながら、図14に示す通り、10nMという高濃度で投与した場合には、その結果から、相補鎖は切断の影響を受けやすく(LNA/RNA(o)及びLNA/RNA(G))、一本鎖としてギャップマーASOを投与した場合と比較して、約20%までアンチセンス効果が改善されることが示された。
【実施例】
【0107】
従って、LNA/DNAギャップマーにRNAを含む相補鎖をハイブリダイズさせて2重鎖核酸複合体としても、細胞内の標的遺伝子の発現抑制効果(アンチセンス効果)は保たれていることが明らかになった。また、RNaseHに影響を受けやすい相補的RNA鎖を用いた場合、さらに細胞内のアンチセンス効果が上昇した。かかるアンチセンス効果の上昇は、核内で相補的RNA鎖が切断されことによるものだと推測される。
【実施例】
【0108】
(実施例3)
次に、図15に示す通り、前記cRNA(G)の5’末端にトコフェロール(Toc)を結合させた相補的RNA鎖(Toc-cRNA(G))を作製した。さらにLNA/DNAギャップマー(アンチセンス鎖)をアニーリングさせることにより、間接的にトコフェロールをアンチセンス鎖に結合することに成功した。なお、実施例において用いたLNA/DNAギャップマー及び相補鎖(cRNA)の配列、構成及び鎖長は下記の通りである。
【実施例】
【0109】
アンチセンスLNA/DNAギャップマー鎖
1.ASO 12mer:5’-GCattggtatTC-3’(配列番号:1)
2.ASO 13mer:5’-GCattggtatTCA-3’(配列番号:5)
3.ASO 14mer:5’-AGCattggtatTCA-3’(配列番号:6)
(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間は全てホスホロチオエート結合である)
相補鎖
1.cRNA 12mer:5’-gAUACCAAUc-3’(配列番号:2)
2.cRNA 13mer:5’-uAUACCAAUc-3’(配列番号:7)
3.cRNA 14mer:5’-uAUACCAAUu-3’(配列番号:6)
(大文字:RNA、小文字:2’-OMe-RNA、下線付:PNA、s:核酸間がホスホロチオエート結合である)。
【実施例】
【0110】
トコフェロールとcRNAとの結合は、公知の手法に沿って行った。トコフェロールのクロマン環の6位の水酸基をホスホルアミダイト化したトコフェロールアミダイトを用意した。そして、標準的なカップリング法を用い、RNAの5‘末端とトコフェロールアミダイトとを連結させた。
【実施例】
【0111】
そして、このように調製した、12塩基、13塩基又は14塩基の鎖長を有する、LNA/DNAギャップマー(ss-ASO)、LNA/DNAギャップマー及びcRNA(G)を含む二重鎖核酸複合体(LNA/cRNA(G))、並びにLNA/DNAギャップマー及びToc-cRNA(G)からなる二重鎖核酸複合体(LNA/Toc-cRNA(G))を0.75mg/kgずつ、それぞれマウスに尾静脈から静脈注射した。また、陰性対照群として一本鎖ASO又は二重鎖核酸複合体の代わりにPBSのみを注射したマウスも用意した。そして、注射してから72時間後に、マウスをPBSにて灌流した後、解剖して肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の方法と同様の方法にて、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT-PCRを行い、mApoBの発現量/mGAPDH(内部標準遺伝子)の発現量を算出して、PBSのみ投与した群(PBS only)と核酸投与群とを比較した。得られた結果を図16に示す。
【実施例】
【0112】
図16に示す通り、相補鎖にトコフェロールを結合させることにより、ASO/Toc-cRNA(G)は特異的に効率良く肝臓に送達、集積され、ASO/cRNA(G)と比較しても、顕著なアンチセンス効果を有していることが明らかになった。特に13塩基の鎖長を有するASO/Toc-cRNAにおけるその効果は格別のものであった。
【実施例】
【0113】
(実施例4)
実施例3に記載の方法と同様の方法にて、ASO/Toc-cRNAの標的遺伝子に対する特異性を評価した。すなわち、13塩基の鎖長を有するLNA/DNAギャップマー及びToc-cRNA(G)を含む二重鎖核酸(ASO/Toc-cRNA(G))を調製した。そして、それをマウスに静脈注射し、当該マウスから得られた肝臓由来のcDNAを用いて、肝臓内の標的遺伝子(mApoB遺伝子)及び内在性コントロール遺伝子(mTTR遺伝子、mSOD1遺伝子及びmGAPDH遺伝子)の発現を定量的PCRにて評価した。なお、定量的RT-PCRに用いたプライマーは、各遺伝子番号を元にライフテクノロジー社が設計、調製したものを使用した。得られた結果を図17に示す。
【実施例】
【0114】
図17に示した結果から明らかなように、ASO/Toc-cRNA 13merを投与したマウスの肝臓においては、LNA/DNAギャップマー(ASO)の標的となる遺伝子転写産物である、mApoB遺伝子のみについて、その発現の顕著な低下が示された。従って、LNA/DNAギャップマー及びToc-cRNA(G)を含む二重鎖核酸複合体においても、標的遺伝子に対する高い特異性が維持されていることが明らかになった。
【実施例】
【0115】
(実施例5)
実施例3に記載の方法と同様の方法にて、13塩基の核酸鎖を用い、ASO/Toc-cRNA(G)によるアンチセンス効果の用量依存性を評価した。すなわち、ASO/Toc-cRNA(G) 13mer二重鎖核酸複合体を0、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.09mg/kg又は0.75mg/kgずつマウスに静脈注射し、当該マウスから得られた肝臓由来のcDNAを用いて、mApoB遺伝子の発現を定量的PCRにて評価した。得られた結果を図18に示す。
【実施例】
【0116】
図18に示した結果から明らかなように、ASO/Toc-cRNA(G)のアンチセンス効果は用量依存的に発揮されることが示された。また、この結果から、ASO/Toc-cRNA(G)の標的遺伝子の発現を半分まで抑制するのに必要な量(ED50)は、約0.036mg/kgであり、極めて低い濃度にて50%抑制を達成することが明らかになった。
【実施例】
【0117】
(実施例6)
実施例3に記載の方法と同様の方法にて、ASO/cRNA及びASO/Toc-cRNAによるアンチセンス効果の持続性を評価した。すなわち、LNA/DNAギャップマー(ss-ASO)、LNA/DNAギャップマー及びcRNA-Gを含む二重鎖核酸(ASO/cRNA(G))又はLNA/DNAギャップマー及びToc-cRNAを含む二重鎖核酸(ASO/Toc-cRNA(G))をマウスに静脈注射した。静脈注射した全ての核酸の鎖長は13塩基である。コントロールとして、核酸を含まないPBS溶液のみを注射したマウスも用意した。第1の実験においては、静脈注射してから1日後、3日後、7日後、14日後、28日後に肝臓を摘出し、当該肝臓由来のcDNAを用いて、mApoB遺伝子の発現を定量的PCRにて評価した。得られた結果を図19Aに示す。PBS溶液コントロール、一本鎖LNAのみ、及び二重鎖複合体ASO/Toc-cRNA(G)を用いて実験を繰り返し、同様の方法にて、静脈注射してから1日後、3日後、7日後、14日後、28日後及び42日後のmApoB遺伝子の発現レベルを評価した。得られた結果を図19Bに示す。
【実施例】
【0118】
図19Aに示す通り、供試したいずれの核酸においても、投与してから3日目に最大のアンチセンス効果が示された。また、投与7日後でも投与1日目と同様のアンチセンス効果が示された。さらに、投与14日後でも標的遺伝子の発現を60%程度、投与28日後でも20%程度、一本鎖ASOと比較して、それぞれ有意差を持って抑制することが示された。第2の実験においても、図19Bに示す通り、同様の傾向が示された。投与してから3日目に最大のアンチセンス効果が示された。また、投与7日後でも投与1日目と同様のアンチセンス効果が示された。投与14日後及び28日後において、各々80%及び50%抑制することが示された。また、投与42日後でも測定可能な効果が検出された。従って、いくつかの実施形態において、二重鎖核酸はアンチセンス効果に関して高い持続性を有していることも明らかになった。
【実施例】
【0119】
(実施例7)
他の実施形態における二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価した。その比較する核酸鎖の構成の概要を図20Aに示す。先の実験においては、天然型のRNA塩基からなる中央領域と、2’-OMe修飾及びホスホロチオエート化してある5’及び3’ウィング領域とを有する、cRNA(G)(配列番号:3)を用いた。ここで用いる相補鎖は、同じ5’及び3’ウィング領域(末端の2塩基のRNA塩基に2’-OMe修飾及びホスホロチオエート結合)を有する。しかし、中央の8塩基のRNAに2’-OMe修飾が施されており、核酸間は天然型のリン酸ジエステル結合である(cRNA(G)-OM)(配列番号:9)。
【実施例】
【0120】
すなわち、マウスアポリポ蛋白B(mApoB)に対する12-mer LNA/DNAギャップマー、異なる修飾が施されたRNA塩基が組み込まれている12塩基の相補鎖を設計し、調製した。
【実施例】
【0121】
アンチセンスLNA/DNAギャップマー鎖
ASO 12mer:5’-GCattggtatTC-3’(配列番号:1)
(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間は全てホスホロチオエート結合である)
相補鎖
1.cRNA(G):5’-gAUACCAAUc-3’(配列番号:3)
2.cRNA(G)-OM:5’-gauaccaauc-3’(配列番号:9)
(大文字:RNA、小文字:2’-OMe-RNA、s:核酸間がホスホロチオエート結合である)。
【実施例】
【0122】
前記LNA/DNAギャップマーは、株式会社ジーンデザインに委託して調製したものを用いた。前記相補鎖は、北海道システム・サイエンス株式会社に委託して調製したものを用いた。
【実施例】
【0123】
そして、前記LNA/DNAギャップマーと前記相補鎖とを等モル量にて加え、95℃にて5分間加熱した後、37℃にて1時間、定温にて放置し、アニーリングさせた。また、すぐに使用しない場合はその後4℃にて保存した。
【実施例】
【0124】
次いで、LNA 12mer及びcRNA 12merを含む二重鎖核酸(ASO/cRNA(G))又はLNA 12mer及びcRNA(G)-OM 12merを含む二重鎖核酸(ASO/cRNA(G)-OM)を、マウスの尾静脈から0.75mg/kgずつ静脈注射した。また、コントロールとしてPBSのみ投与したマウスも用意した。そして、静脈注射してから3日後に、当該マウスをPBSにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の方法と同様の方法にて、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT-PCRを行い、mApoBの発現量/mGAPDH(内部標準遺伝子)の発現量を算出して、PBSのみ投与した群(PBS only)と核酸投与群とを比較した。得られた結果を図20Bに示す。
【実施例】
【0125】
図20Bに示した結果から明らかなように、cRNA(G)の代わりにcRNA(G)-OMを本発明の二重鎖核酸に用いても、そのアンチセンス効果は減弱することはなかった。
【実施例】
【0126】
一般的に、医薬品を経腸投与(経口投与等)した場合には、その医薬品は腸管内のRNaseAに曝露されることになるため、RNAを含有する核酸医薬は、当該RNAの部分を全て2’-OMe等にて修飾しておくことが極めて好ましい。
【実施例】
【0127】
従って、いくつかの実施形態において、二重鎖核酸における相補鎖として、全て2’-OMe修飾したRNA鎖も利用することができるため、いくつかの実施形態における二重鎖核酸は経腸投与の態様にも適用できることが明らかになった。
【実施例】
【0128】
(実施例8)
LNA/DNAギャップマー及びToc-cRNAを含む二重鎖核酸複合体については前述の通り、高いアンチセンス効果を有しつつ、肝臓等へ特異的に効率良く送達できることが明らかになった。
【実施例】
【0129】
このように、トコフェロール等の脂質を結合させることにより肝臓等への送達性は飛躍的に増大するが、他の臓器への送達は逆に困難となることが知られている。現在、他臓器への送達方法として最もよく用いられているのは、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に結合するような、一種の標的ペプチドを利用する方法である。いくつかの実施形態においては、上述のようなRNAを含む相補鎖を有する二重鎖複合体にて、核酸と送達性部分としてのペプチドとを直接結合させることが検討され得る。
【実施例】
【0130】
他の実施形態においては、後述の実施例にて示されるような、ペプチド又は抗体を基礎とする機能性部分への結合が容易であるペプチド核酸(PNA)を、
いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体の相補鎖として用いた。下記式に示す通り、PNAは、通常の核酸のようにリン酸結合を持たず、ペプチド結合となっているところが大きな特徴であり、そのためペプチドとの結合が容易になる。その他、LNAと同様に高いTm値を有し、二重鎖が離れにくいことやRNaseに対する耐性が強いこと等の特徴も有している。
【実施例】
【0131】
【化2】
JP0006112569B2_000007t.gif
【実施例】
【0132】
前記検証において、LNA/DNAギャップマーに標的ペプチド等の機能性分子を直接結合させない二重鎖核酸複合体の一部であって、標的ペプチド等を結合させるための核酸鎖(ペプチド結合鎖)について、多くの実施形態を検討した。そのような実施形態の例を図21A~Cに示す。図21Aにおいて、機能性部分は相補的RNA鎖に結合している。図21Bにおいて、二重鎖核酸複合体を形成するために、3本の核酸鎖が用いられる。ここで、相補的RNA鎖は、LNA/DNAアンチセンス鎖及びPNA鎖にアニーリングする。ペプチドを基礎とする機能性部分をPNA鎖に結合することによって、送達機能性部分を複合体に担持させる。しかし、該部分はアンチセンスオリゴヌクレオチドに直接結合していない。第3の核酸鎖はPNAでなくともよく、DNA、RNA及び/又はヌクレオチドアナログを含み得る。通常、この態様において、アンチセンス鎖よりも長い相補鎖を用い、その相補鎖における突出部分に第3の核酸鎖を備えさせ、アンチセンス鎖と機能性部分とを間接的に結合させることができる。また、図21Cに示す通り、相補鎖自体に機能性部分を備えさせることもできる。図21Cに示す機能性部分は独立して選択される。
【実施例】
【0133】
次に、このコンセプトに基づき、以下に示す通り、マウスアポリポ蛋白B(mApoB)に対するLNA/DNAギャップマー、RNAを含む相補鎖及びペプチド結合鎖を、本発明者らは設計して調製した。
【実施例】
【0134】
アンチセンスLNA/DNAギャップマー鎖
ASO 12mer:5’-GCattggtatTC-3’(配列番号:1)
(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間は全てホスホロチオエート結合である)
相補鎖
cRNA 21mer:5’-ucGCACCAGAAUACCAAuc-3’(配列番号:10)
(大文字:RNA、小文字:2’-OMe-RNA、s:核酸間がホスホロチオエート結合である)
第3の核酸(ペプチド)鎖
PNA 9mer:N‘-TGGTGCGAA-C’(配列番号:11)
(下線付:PNA)。
【実施例】
【0135】
前記LNA/DNAギャップマーは、株式会社ジーンデザインに委託して調製したものを用いた。前記相補鎖は、北海道システム・サイエンス株式会社が調製したものを用いた。また、前記ペプチド結合鎖は、株式会社ファスマックが調製したものを用いた。
【実施例】
【0136】
そして、前記LNA/DNAギャップマー、前記相補鎖及び前記ペプチドを基礎とする鎖を等モル量にて加え、95℃にて5分間加熱した後、37℃にて1時間、定温にて放置し、アニーリングさせた。また、すぐに使用しない場合はその後4℃にて保存した。
【実施例】
【0137】
次いで、ASO 12mer(ss-ASO)又は(1)ASO 12mer、(2)cRNA(G)21mer及び(3)PNA 9merを含む二重鎖核酸複合体(ASO,PNA/crNA(G))を、マウスの尾静脈から0.75mg/kgずつ静脈注射した。また、コントロールとしてPBSのみ投与したマウスも用意した。そして、静脈注射してから3日後に、当該マウスをPBSにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の方法と同様の方法にて、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT-PCRを行い、mApoBの発現量/mGAPDH(内部標準遺伝子)の発現量を算出して、PBSのみ投与した群(PBS only)と核酸投与群とを比較した。得られた結果を図22に示す。
【実施例】
【0138】
図22に示した結果から明らかなように、ASO,PNA/crNA(G)複合体のアンチセンス効果は、LNA 12merのそれと比較して減弱していなかった。
【実施例】
【0139】
(実施例9)
PNA鎖が二重鎖核酸の相補鎖として利用できることを以下に示す実施例にて実証した。
【実施例】
【0140】
すなわち、図3Bに示すように、相補鎖としてRNAの代わりにPNA鎖を利用し得ることを検討した。この配置においては、アンチセンス鎖(例えば、LNA/DNAギャップマー)に標的ペプチド等の機能性部分を直接結合させないが、間接的に結合させる、二重鎖核酸複合体の態様を可能とする。
【実施例】
【0141】
このコンセプトに基づき、以下に示す通り、マウスアポリポ蛋白B(mApoB)に対するLNA/DNAギャップマー及びPNAを含む相補鎖を設計して調製した。
【実施例】
【0142】
アンチセンスLNA/DNAギャップマー鎖
ASO 12mer:5’-GCattggtatTC-3’(配列番号:1)
(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間は全てホスホロチオエート結合である)
相補鎖
1.cPNA 12mer:N‘-GAAUACCAAUGC-C’(配列番号:12)
2.cPNA 10mer:N‘-GAAUACCAAU-C’(配列番号:13)
3.cPNA 8mer:N‘-GAAUACCA-C’(配列番号:14)
(下線付:PNA)。
【実施例】
【0143】
前記LNA/DNAギャップマーは、株式会社ジーンデザインが調製したものを用いた。前記相補鎖は、株式会社ファスマックが調製したものを用いた。
【実施例】
【0144】
前記LNA/DNAギャップマー及び各相補鎖を等モル量にて加え、95℃にて5分間加熱した後、37℃にて1時間、定温にて放置し、アニーリングさせた。また、すぐに使用しない場合はその後4℃にて保存した。
【実施例】
【0145】
次いで、ASO 12mer(ss-ASO)、ASO 12mer及びcPNA 12merを含む二重鎖核酸(ASO/cPNA 12mer)、ASO 12mer及びcPNA 10merを含む二重鎖核酸(ASO/cPNA 10mer)又はASO 12mer及びcPNA 8mer含む二重鎖核酸(ASO/cPNA 8mer)を、マウスの尾静脈から0.75mg/kgずつ静脈注射した。また、コントロールとしてPBSのみ投与したマウスも用意した。そして、静脈注射してから3日後に、当該マウスをPBSにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の方法と同様の方法にて、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT-PCRを行い、mApoBの発現量/mGAPDH(内部標準遺伝子)の発現量を算出して、PBSのみ投与した群(PBS only)と核酸投与群とを比較した。得られた結果を図23に示す。
【実施例】
【0146】
図23に示した結果から明らかなように、ASO/cPNA複合体のアンチセンス効果は、いずれにおいても、ssーASO 12merのそれと比較して減弱していなかった。
【実施例】
【0147】
(実施例10)
この実施例においては、「RNAヌクレオチド及び任意にヌクレオチドアナログ」を含む、様々な構造の相補鎖を用いても、二重鎖核酸複合体がアンチセンス効果を発揮できることを実証する。4種類の相補鎖構造を設計し、調製した。それら構造の概要を図24に示す。図24に示す通り、2種類の中央の領域と、2種類の5‘及び3‘ウィング領域とを結合させた。ウィング領域は、ホスホロチエート結合を伴う2‘-Oメチル化修飾されたRNAと、ホスホロチエート結合を伴うヌクレオチドアナログとの、いずれかを含むものである。中央領域は、天然型リン酸ジエステル結合のRNAと、ホスホロチエート結合のRNAとのいずれかを含むものである。
【実施例】
【0148】
以下に示す13塩基のヌクレオチド鎖を作製して試験した。
【実施例】
【0149】
アンチセンスLNA/DNAギャップマー鎖
ASO13-mer:5’-GCattggtatTCA-3’(配列番号:5)
(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間の全ての結合はホスホロチエート結合である)
相補鎖
1.Toc-cRNA(G):5’-uAUACCAAUsgsc-3’(配列番号:7)
2.Toc-cLNA(G):5’-uAUACCAAUsgsc-3’(配列番号:15)
3.Toc-cLNA(s):5’-uAsUsAsCsCsAsAsUc-3’(配列番号:16)
4.Toc-cRNA(s):5’-uUsAsCsCsAsAsUc-3’(配列番号:17)
(大文字:RNA、小文字:2’-OMe-RNA、下線付小文字:LNA、s:核酸間の結合がホスホロチエート結合である)
LNA/DNAギャップマーと各相補鎖とを等モル量混合し、実施例7に記載の通り、アニーリングした。次に、二重鎖核酸複合体をマウスの尾静脈から0.75mg/kgずつ静脈注射した。また、コントロールマウスとしてPBS溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。そして、注射してから3日後に、当該マウスをPBSにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の通り、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT-PCRを行った。mApoBの相対的発現レベルを、mGAPDH(内部標準遺伝子)と比較して算出した。得られた結果を図25A~Bに示す
図25Aに示す通り、Toc-cRNA(G)とToc-cLNA(G)との結果を比較したところ、RNA同様に、相補鎖の5‘及び3’ウィング領域を架橋化核酸にて調製しても、同等の高いアンチセンス効果を得ることができた、
さらに、このデータから、ウィング領域のいずれかの種類に対しても、核酸鎖の中央のRNA部分をホスホロチエート化することができ、核酸鎖の中央部分が天然型のRNAとした場合に得られたアンチセンス効果と同程度のそれが維持されていることが示された。Toc-cLNA(s)及びToc-cRNA(s)において、得られた効果に関し、Toc-cRNA(G)と比較した結果を、図25A及び図25Bに各々示す。
【実施例】
【0150】
実施例7と併せて論じるに、アンチセンス効果を損なうことなく、相補鎖のヌクレアーゼ耐性を向上させることができる他の態様が、この実施例において示された。
【実施例】
【0151】
特に、相補鎖において、その全長をホスホロチエート化することができ、なおかつ、ホスホロチエート修飾されたRNAを含む中央領域を有していても、アンチセンス鎖を放出することができ、さらにmRNA転写産物レベルを抑制することもできることが示された。
【実施例】
【0152】
(実施例11)
この実施例においては、たとえ第1の核酸鎖と第2の核酸鎖(アンチセンスと相補鎖)との鎖長が異なっていたとしても、アンチセンス効果は発揮されるということを実証する。ここで、13塩基のLNA/DNAギャップマーと、31塩基の相補的RNAを基礎とする核酸鎖とをアニーリングさせ、マウスにおけるApoB遺伝子の発現抑制試験に供した。また、該31塩基の核酸鎖は、3つの2’-Oメチル修飾及びホスホロチエート化されたRNAヌクレオチドを含む5’ウィング領域と、20個の2’-Oメチル修飾及びホスホロチエート化されたRNAヌクレオチドと、ホスホロチオエート結合している8個のRNAヌクレオチドを含む中央領域とを結合させることにより、調製した。13-mer/31-mer複合体の活性と、13-mer/13-mer複合体の活性とを比較した。
【実施例】
【0153】
アンチセンスLNA/DNAギャップマー鎖
LNA 13-mer:5’-GCattggtatTCA-3’(配列番号:5)
(大文字:LNA,小文字:DNA,核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合)
相補鎖
1.13-mer Toc-cRNA(G):5’-uAUACCAAUc-3’(配列番号:7)
2.31-mer Toc-cRNA(s):5’-uAUACCAAUgcuacgcauacgcaccaa-3’(配列番号:18)
(大文字:RNA,小文字:2’-OMe-RNA,s:核酸間の結合がホスホロチエート結合)。
【実施例】
【0154】
LNA/DNAギャップマーと各相補鎖とを等モル量混合し、実施例7に記載の通り、アニーリングした。次に、アニーリングした二重鎖核酸複合体をマウスの尾静脈から0.75mg/kgずつ静脈注射した。また、コントロールマウスとしてPBS溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。そして、注射してから3日後に、当該マウスをPBSにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の通り、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT-PCRを行った。mApoBの相対的発現レベルを、mGAPDH(内部標準遺伝子)と比較して算出した。結果を図26に示す。
【実施例】
【0155】
図26に示す通り、31-mer Toc-cRNA(s)相補鎖を有する二重鎖複合体によって達成される抑制と、13-mer Toc-cLNA(G)相補鎖を有する二重鎖複合体によって達成されるそれとを比較したところ、共に同程度に高いアンチセンス効果が得られていた。
【実施例】
【0156】
このデータから、相補鎖において中央のRNA部分をホスホロチオエートすることができ、たとえ該相補鎖の鎖長がアンチセンス鎖と異なっていたとしても、相補鎖の中央領域を天然型のRNAとした場合と比較して、同程度のアンチセンス効果が維持されていることが、更に示された。
【実施例】
【0157】
(実施例12)
ここで開示した二重鎖核酸複合体は、配列特異性及び普遍的な適用性を有していることを実証するため、異なる遺伝子、ヒトのトランスチレチン(hTTR)の転写産物を標的とするアンチセンスプローブを調製した。実験は、hTTRを有するよう改変されたトランスジェニックマウスを用いて行った(該マウスは、hTTR及びmTTRを有する)。アンチセンスと相補鎖とは、2つの鎖長のもの、13塩基の核酸鎖及び20塩基の核酸鎖を用意した。そして、13-mer/13-mer二重鎖複合体と20-mer/20-mer二重鎖複合体とを試験に供した。また、該複合体が肝臓に送達されるよう、5’-トコフェロール機能性部分を備えた相補鎖を調製した。また、hTTRは、最終的には血中で検出されるタンパク質として産生されるので、その発現タンパク質の血清濃度を分析した。そして、二重鎖複合体注入後に生じる発現の減少を検出した。以下に示す様々な核酸鎖の配列及び複合体を設計して作製し、試験に供した。
【実施例】
【0158】
アンチセンスLNA/DNAギャップマー核酸鎖
1.ASO 13-mer:5’-TGtctctgccTGG-3’(配列番号:19)
2.ASO 20-mer:5’-TTATTgtctctgcctGGACT-3’(配列番号:21)
(大文字:LNA,小文字:DNA,核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である)
相補鎖
1.13-mer Toc-cRNA(G):5’-cGGCAGAGAa-3’(配列番号:20)
2.20-mer Toc-cRNA(G):5’-aAGGCAGAGACa-3’(配列番号:22)
(大文字:RNA,小文字:2’-OMe-RNA,s:核酸間の結合がホスホロチエート結合である)
13塩基のアンチセンス及び相補鎖を、20塩基のアンチセンス及び相補鎖を、各々等モル量にて混合し、実施例7に記載の通り、アニーリングさせた。次に、13塩基のアンチセンス単一鎖と、アニーリングした13塩基の二重鎖複合体とを、各々トランスジェニックマウスの尾静脈から0.75mg/kgずつ静脈注射した。同様に、20塩基のアンチセンス単一鎖と、アニーリングした20塩基の二重鎖複合体とを、6mg/kgずつ注射した。また、コントロールマウスとしてPBS溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。そして、注射してから3日後に、当該マウスをPBSにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の通り、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT-PCRを行った。hTTRの相対的発現レベルを、mGAPDH(内部標準遺伝子)と比較して算出した。13塩基の核酸鎖に関する結果を図27Aに、20塩基の核酸鎖に関する結果を図27Bに示す。
【実施例】
【0159】
hTTRは肝臓で合成され、血中へと分泌される。従って、もしアンチセンスプローブが肝臓に送達され、hTTRの発現を効率的に抑制できるのなら、この抑制の結果、該タンパク質の血清中の濃度は低減されるはずである。血清中の濃度レベルは、13塩基の核酸鎖を注射する前、該注射の3日後に、民間試験所にて測定した。得られた血清濃度を図28に示す。
【実施例】
【0160】
図27Aに示す通り、13塩基の二重鎖核酸複合体は効果的にmRNA転写を95%以上抑制した。それと比較して、ASO単一鎖のみによる抑制は約50%であった。また、図27Bに示す通り、20塩基の複合体による抑制レベルも同程度の約50%であったが、20塩基の単一鎖を用いた場合には、実質的な抑制は認められなかった。オリゴヌクレオチドの鎖長が長くなるほど、通常、発現抑制能は低減されることが認められる。しかしながら、オリゴヌクレオチドが長いほど、選択性がより高まり、それゆえに安全性も高まることになる。例えば、アンチセンス鎖の、投与量、投与計画、鎖長、配列及び組成物を調節することによって、治療の効能を適合させることができる。しかしながら、これら実施例において示す通り、本発明の様々な実施形態における二重鎖核酸複合体として、アンチセンス鎖を送達させることによって単一鎖としてアンチセンス鎖を送達した場合よりも、顕著に高い抑制を達成することができる。
【実施例】
【0161】
処置前後の血清濃度レベルを図28に示す。その結果から、13塩基の二重鎖複合体により、~40mg/dl~<5mg/dlという、13塩基の単一鎖の場合(~44mg/dl~~28mg/dl)及びPBSコントロール(ほぼ変化なし)と比較して、顕著な低減が認められた。
【実施例】
【0162】
(実施例13)
この実施例においては、送達機能性部分としてペプチドを用い、神経系の細胞に二重鎖核酸複合体が送達されることを実証した。図28に一般的な構造を示した、アンチセンス鎖、相補鎖及びPNA鎖の3つの核酸鎖を含む二重鎖複合体を用いた。後神経節(DRG)細胞に該複合体を局在させるための薬剤として機能させるため、ドデカペプチド DRG1を、9塩基のPNA鎖のN末端に結合させた。この9塩基のPNAを、以下に示す、13塩基のアンチセンス鎖及び22塩基の相補鎖にアニーリングさせることにより、二重鎖複合体を形成させ、本実験に用いた。該アンチセンス鎖が標的とする遺伝子は、TRPV1である。
【実施例】
【0163】
アンチセンスLNA/DNAギャップマー鎖
ASO 13-mer:5’-TAgtccagttCAC-3’(配列番号:23)
(大文字:LNA;小文字:DNA;核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である)
相補鎖
cRNA(G) 22-mer:5’-gAACUGGACuauacgcaca-3’(配列番号:24)
(大文字:RNA;小文字:2’-OMe-RNA;s:核酸間の結合がホスホロチエート結合)
第3の核酸(ペプチド)鎖
pep-PNA 9-mer:N’-SPGARAFGGGGS-tggtgcgta-C’(配列番号:25及び31)
(大文字:アミノ酸;下線付,小文字:PNA)
LNA/DNAギャップマー、相補鎖及びペプチド-PNA鎖を、等モル量にて混合し、この混合物を95℃で5分間加熱した。その後、3本の核酸鎖をアニーリングさせるべく、該混合物を37℃にて1時間、定温にて放置した(「ts-TRPV1」)。また、すぐに使用しない場合は4℃にて保存した。また、同様に、アンチセンス鎖及び相補鎖のみを含有する二重鎖複合体を調製した(「ds-TRPV1」)。マウスは、三協ラボサービス株式会社(東京、日本)より入手し、病原体フリ—の施設内にて維持し、自由に餌及び水を摂取させた。8週齢、平均体重27gの雌ICRマウスに、髄腔内注射にて、PBS、ds-TRPV1又はts-TRPV1を2.66μgずつ投与した。動物の処置は、東京医科歯科大学の動物実験委員会の承認を得た倫理性及び安全性に関わる実験計画書に従って、動物実験の許可を得た処置者によって行われた。抱水クロラ—ル(0.5mg/g体重)及び塩酸ケタミン(0.05mg/g体重)の腹腔内注射により、麻酔導入した後に髄腔内注射を行った。全てのマウスをうつ伏せにし、第2腰椎及び第3腰椎(L2-L3)において部分椎弓切除を施した。一旦露出させたこれら脊椎骨をs 27ゲージ針にて穿刺し、次いで、10μLハミルトンシリンジが接続されているPE-10カテーテルを、くも膜下腔内の後方、大体L5付近に挿入した。そして、1分間にわたって10μL量を着実に投与した。カテーテルを除去した後に、筋膜及び皮膚を4-0-ナイロンにて縫合し、抗生物質溶液にて処理した。そして、当該動物の頭部を挙上させ、加温パッド上で回復させた。
【実施例】
【0164】
組織学的分析は以下の通りにして行った。注射してから2日後に、3mgの抱水クロラ—ルを腹腔内注射することによってマウスを安楽死させた。PFA(4%パラホルムアルデヒドPBS溶液)にて灌流固定した後、PBSにて灌流した。DRG(L6の片側)を回収し、4%ホルマリン溶液に固定した。次いで、30%スクロース溶液で置換し、肝臓をOCTコンパウンドで包埋した後、10μmの厚さで切片を作製した。次いで、DAPIを用いて核染色した後、共焦点顕微鏡で切片におけるCy3の信号強度を検出した。共焦点顕微鏡による画像分析を図29に示す。
【実施例】
【0165】
TRPV1の相対的発現レベルの分析を以下の通りにして行った。麻酔導入及び経心臓的PBS灌流にて、注射してから7日後のマウスを犠牲死させた。各マウスから3つの片側DRG、すなわちL4、L5及びL6の腰椎DRG(LSD)を回収した。その後、mRNA抽出、cDNA合成及び定量的RT-PCRを、比較例1に記載の通りに行った。mTRPV1の相対的発現レベルは、mGAPDH(内部標準遺伝子)と比較して算出した。得られた結果を図30に示す。
【実施例】
【0166】
図29に示した組織学的分析から、Cy3標識アンチセンス鎖はDRG細胞の核に局在していることが明らかになった。これは、アンチセンス鎖上の蛍光標識の蛍光シグナルと、核染色のそれとが一致したことから明らかである。また、この実験により、二重鎖複合体に含まれている3本の核酸鎖は損傷を受けることなく、第3の核酸鎖上の送達性部分によって、アンチセンス鎖は所望の細胞まで送達されていることが示された。図30に示す通り、mTRPV1発現抑制により、アンチセンス効果は検出された。DRG細胞に誘導可能なペプチド-PNA鎖を含むts-PRPV1複合体は、約40%の抑制を示した。対して、ペプチド-PNA鎖を欠くds-TRPV1複合体は、遺伝子発現を抑制したが、せいぜい20%程度であった。この実施例において、再度、3本の核酸鎖を含む複合体を用いることによって、アンチセンス鎖を細胞の種類特異的に送達できることが示された。また、この実施例において、送達を誘導するペプチドを用いることにより、他の実施例に示したものと異なる細胞の種類(DRG)及び組織にも(肝臓の代わりに神経系にも)、アンチセンス鎖を送達できることも示された。
【実施例】
【0167】
(実施例14)
この実施例においては、非タンパク質コーディングRNA転写産物、すなわちmiRNAに対する、二重鎖核酸複合体によるアンチセンス効果について実証する。マウスの肝臓においては、miR-122というmiRNAが発現していることが知られている。15塩基のアンチmiR鎖を設計し、3つのヌクレオチドアナログ(架橋化核酸、LNA)を含む5’ウィング及び3’ウィングと、DNAを含む9塩基の中央領域とを調製した。なお、これら核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である。2’-OMe及びホスホロチエート化されたRNAを含む5’及び3’ウィングと、天然型のRNAを含む中央領域とを備えた相補鎖を調製した。
【実施例】
【0168】
アンチ-miR LNA/DNAギャップマー鎖
ASO 15-mer:5’-CCAttgtcacacTCC-3’(配列番号:26)
(大文字:LNA;小文字:DNA;核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である)
相補鎖
Toc-cRNA(G) 15-mer:5’-Toc-gsgsasGUGUGACCAsusgsg-3’(配列番号:27)
(大文字:RNA;小文字:2’-OMe-RNA;s:核酸間の結合が、ホスホロチエート結合である)。
【実施例】
【0169】
アンチ-miR LNA/DNAギャップマー及び相補鎖を、等モル量にて混合し、実施例7に記載の通りアニーリングさせた。次に、アンチmiR単一鎖と、アニーリングした二重鎖核酸複合体とを、各々トランスジェニックマウスの尾静脈から0.75mg/kgずつ静脈注射した。コントロールマウスとしてPBS溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。そして、注射してから3日後に、当該マウスをPBSにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の通り、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT-PCRを行った。mApoBの相対的発現レベルを、mGAPDH(内部標準遺伝子)と比較して算出した。結果を図31に示す。
【実施例】
【0170】
図31に示す通り、二重鎖複合体により、miR-122レベルは、ほぼ50%に減少した。一方、アンチ-miRオリゴヌクレオチドによっては~20%だけ減少した。特筆すべきは、miRNAレベルを低減させるための典型的な方法では、ミックスマー(mixmer)型プローブ構造が用いられ、そのプローブにより50%の減少を達成するためには、~10mg/kgの投与量(ED50)にて送達する必要がある。前述の通り、この実施例において示した、いくつかの実施形態における二重鎖複合体によれば、相当に低い投与量をED50とすることができる。
【実施例】
【0171】
(実施例15)
この実施例においては、アンチセンス効果を奏するために、アミド架橋化核酸である「アミドBNA」を含むアンチセンス鎖を用いた。アミド架橋化核酸(「AmNAs」とも称する)は、LNAアナログであり、糖環における2’位の炭素と4’位の炭素とが結合している、環状アミド架橋構造(4’-C(O)-N(R)-2’;R=H,Me)を有する。
AmNAsの合成、それらオリゴヌクレオチドへの導入や、結合強度及びヌクレアーゼ耐性等の物性については、A.Yaharaら、ChemBioChem 2012年、13巻、2513~2516ページにて最近報告されている。この文献に開示されている内容は、この参照により、本願明細書において援用される。Yaharaらが開示している通り、AmNAsは相補鎖に対して優れた結合活性を示し、また高いヌクレアーゼ耐性を示す。このように、AmNAsは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用に適している。13塩基のアンチセンス鎖を設計し、ヌクレオチドアナログ(アミドBNA、AmNA)を2個及び3個各々含む、5’ウィング及び3’ウィングと、8塩基のDNAを含む中央領域とを調製した。なお、これら核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である。2’-OMe及びホスホロチエート化されたRNAを含む5’及び3’ウィングと、天然型のRNAを含む中央領域とを備えた相補鎖を調製した。
【実施例】
【0172】
アンチセンスアミドRNA(AmNA)/DNAギャップマー鎖
ASO 13-mer:5’-GCattggtatTCA-3’(配列番号:28)
(大文字:N-メチルアミドBNA(AmNA),小文字:DNA,核酸間の全ての結合はホスホロチエート結合である)
相補鎖
1.13-mer Toc-cRNA(G):5’-uAUACCAAUc-3’(配列番号:7)
(大文字:RNA,小文字:2’-OMe-RNA,s:核酸間の結合は、ホスホロチエート結合である)
アンチセンスアミドBNA/DNAギャップマー(ASO)と相補鎖とを、等モル量混合し、実施例7に記載の通り、アニーリングさせた。次に、ASO単一鎖と、アニーリングした二重鎖核酸複合体とを、各々トランスジェニックマウスの尾静脈から各々様々な投与量にて静脈注射した(ss-ASO:0.75mg/kg;2.25mg/kg;Toc-ASO/cRNA(G):0.33mg/kg;1.0mg/kg)。コントロールマウスとしてPBS溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。注射してから7日後又は14日後に、当該マウスをPBSにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の通り、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT-PCRを行った。mApoBの相対的発現レベルを、mGAPDH(内部標準遺伝子)と比較して算出した。結果を図32に示す。
【実施例】
【0173】
図32に示す通り、アミドBNA(AmNA)を第1の核酸鎖(アンチセンスオリゴブクレオチド)の5’ウィング及び3’ウィング領域に組み込んだ、二重鎖複合体は、生体内でアンチセンス効果を発揮した。二重鎖複合体をマウスに低量にて注射した時でさえ、ASO単一鎖を注射した場合よりも、二重鎖複合体はきわめて高い抑制を達成した。例えば、注射してから7日後に測定した際に、ASO/Toc-cRNA(G)複合体を1.0mg/kgにて注射した際には、mApoBの相対的発現レベルは約55%まで抑制されていた。これは、ssーASOを2.25mg/kg投与した場合において、ようやく20%抑制されたのに対し、顕著に低かった。この実施態様にて示す通り、ここで開示している二重鎖複合体を用いた方法を実践することによって、より少ない試薬量で、より大きな発現抑制が達成される。
【産業上の利用可能性】
【0174】
以上説明したように、本発明の実施形態にかかる二重鎖核酸複合体を用いることによって、いくつかの実施形態においては、アンチセンス核酸を特異性高く効率的に特定の臓器(細胞)に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することが可能となる。また、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体には、特定の臓器に送達させるための機能性分子として、脂質(例えば、トコフェロール、コレステロール)、糖(例えば、グルコース、スクロース)、タンパク質、ペプチド、抗体等の多種多様な分子を適用できるため、いくつかの実施形態における二重鎖核酸複合体は、様々な臓器、組織、細胞を標的とすることができる。さらには、いくつかの実施形態における二重鎖核酸に、RNase等に対する耐性を付与するための修飾を施しても、そのアンチセンス効果は低減することはないため、いくつかの実施形態における二重鎖核酸は、経腸投与の態様でも利用できる。
【0175】
したがって、いくつかの実施形態における二重鎖核酸は、低濃度の投与により高い薬効を得ることができ、かつアンチセンス核酸の標的以外の臓器における分布を抑制することにより、副作用も低減できるという点に優れているため、代謝性疾患、腫瘍、感染症等の、標的遺伝子の発現亢進及び/又は転写産物レベル亢進に伴う疾患を治療、予防するための医薬組成物等として、二重鎖核酸は有用である。
図面
【図1】
0
【図2】
1
【図3】
2
【図4】
3
【図5】
4
【図6】
5
【図7】
6
【図8】
7
【図9】
8
【図10】
9
【図11】
10
【図12】
11
【図13】
12
【図14】
13
【図15】
14
【図16】
15
【図17】
16
【図18】
17
【図19A】
18
【図19B】
19
【図20A】
20
【図20B】
21
【図21】
22
【図22】
23
【図23】
24
【図24】
25
【図25A】
26
【図25B】
27
【図26】
28
【図27A】
29
【図27B】
30
【図28】
31
【図29】
32
【図30】
33
【図31】
34
【図32】
35