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明細書 :光学測定装置及び光学測定方法

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 公開特許公報(A)
公開番号 特開2016-038218 (P2016-038218A)
公開日 平成28年3月22日(2016.3.22)
発明の名称または考案の名称 光学測定装置及び光学測定方法
国際特許分類 G01N  21/64        (2006.01)
G02B  21/06        (2006.01)
FI G01N 21/64 E
G02B 21/06
請求項の数または発明の数 10
出願形態 OL
全頁数 16
出願番号 特願2014-159837 (P2014-159837)
出願日 平成26年8月5日(2014.8.5)
発明者または考案者 【氏名】小林 孝嘉
【氏名】王 楠
【氏名】宮崎 淳
出願人 【識別番号】504133110
【氏名又は名称】国立大学法人電気通信大学
個別代理人の代理人 【識別番号】100107766、【弁理士】、【氏名又は名称】伊東 忠重
【識別番号】100070150、【弁理士】、【氏名又は名称】伊東 忠彦
審査請求 未請求
テーマコード 2G043
2H052
Fターム 2G043AA03
2G043BA16
2G043DA05
2G043EA01
2G043FA01
2G043FA02
2G043FA06
2G043GA01
2G043GA08
2G043GB01
2G043GB05
2G043GB18
2G043HA02
2G043HA06
2G043HA07
2G043HA09
2G043HA12
2G043KA09
2G043LA02
2G043NA01
2G043NA05
2H052AA07
2H052AA09
2H052AC15
2H052AC34
2H052AD18
要約 【課題】 サブトラクション超解像法で機械的要素を低減または排除して、信頼性の高い超解像イメージングを実現する。
【解決手段】 光源からの光を2つに分割し、一方のビームをそのままガウスビームとして用いて第1の変調周波数で変調し、他方のビームを第2の変調周波数で変調するとともにドーナツビームにモード変換し、第1の変調周波数で変調されたガウスビームと、第2の変調周変調で変調されたドーナツビームを重畳して試料を照射し、試料からの蛍光のうち、ガウスビームの照射による第1の蛍光成分とドーナツビームの照射による第2の蛍光成分を、前記第1の変調周波数と前記第2の変調周波数のそれぞれで同時に復調し、第1の蛍光成分と第2の蛍光成分の差分を算出することで迅速かつ信頼性の高い超高解像の光学測定を実現する。
【選択図】図1
特許請求の範囲 【請求項1】
光源と、
前記光源から出射される光を第1ビームと第2ビームに分割するビームスプリッタと、
前記第1ビームを第1の変調周波数で変調する第1の光変調器と、
前記第2ビームを第2の変調周波数で変調する第2の光変調器と、
前記第2ビームを、焦点面でドーナツ型の強度分布を有するドーナツモードのビームに変換するモード変換素子と、
前記第1の変調周波数で変調された前記第1ビームと、前記第2の変調周変調で変調され、かつ前記ドーナツモードに変換された前記第2ビームを重畳して試料に導く光学素子と、
前記試料からの蛍光を前記第1の変調周波数で復調する第1のロックイン増幅器と、
前記試料からの蛍光を前記第2の変調周波数で復調する第2のロックイン増幅器と、
前記第1のロックイン増幅器で復調された蛍光成分と、前記第2のロックイン増幅器で復調された蛍光成分の差分を測定結果として算出する演算装置と、
を有することを特徴とする光学測定装置。
【請求項2】
前記第1及び第2の光変調器は電気光学変調器であり、
前記モード変換器は、前記第2の光変調器の後段に配置されることを特徴とする請求項1に記載の光学測定装置。
【請求項3】
前記第1及び第2の光変調器は光チョッパーであり、
前記モード変換器は、前記第2の光変調器の前段に挿入されることを特徴とする請求項1に記載の光学測定装置。
【請求項4】
前記試料からの蛍光を検出する蛍光検出器、
をさらに有し、前記蛍光検出器で検出された蛍光が、前記第1のロックイン増幅器と前記第2のロックイン増幅器に入力されることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項に記載の光学測定装置。
【請求項5】
前記試料を1次元的、2次元的、または3次元的に駆動する駆動メカニズム、
をさらに有し、
前記演算装置は、前記第1の蛍光成分と前記第2の蛍光成分の差分を前記重畳されたビームのスポット位置ごとに算出する
ことを特徴とする請求項1~4のいずれか1項に記載の光学測定装置。
【請求項6】
光源からの光を第1ビームと第2ビームに分割し、
前記第1ビームを第1の変調周波数で変調し、
前記第2ビームを第2の変調周波数で変調するとともに、焦点面でドーナツ型の強度分布を有するドーナツモードのビームに変換し、
前記第1の変調周波数で変調された前記第1ビームと、前記第2の変調周変調で変調され、かつ前記ドーナツモードに変換された前記第2ビームを重畳して試料を照射し、
前記試料からの蛍光のうち、前記第1ビームにより励起され放出された第1の蛍光成分を前記第1の変調周波数で復調し、
前記試料からの蛍光のうち、前記ドーナツモードのビームに変換された前記第2ビームにより励起され放出された第2の蛍光成分を前記第2の変調周波数で復調し、
前記第1の蛍光成分と前記第2の蛍光成分の差分を算出する、
工程を有することを特徴とする光学測定方法。
【請求項7】
前記第1の変調周波数による変調と、前記第2の変調周波数による変調を電気光学変調器によって行い、
前記第2ビームを前記第2の変調周波数で変調した後に、前記ドーナツモードのビームに変換する、
ことを特徴とする請求項6に記載の光学測定方法。
【請求項8】
前記第1の変調周波数による変調と、前記第2の変調周波数による変調を光チョッパーによって行い、
前記第2ビームを前記ドーナツモードのビームに変換した後に、前記第2の変調周波数で変調する、
ことを特徴とする請求項6に記載の光学測定方法。
【請求項9】
前記試料からの蛍光を検出し、
前記検出された蛍光を、第1のロックイン増幅器と第2のロックイン増幅器に入力し、前記第1のロックイン増幅器で前記第1の蛍光成分を復調し、前記第2のロックイン増幅器で前記第2の蛍光成分を復調する、
ことを特徴とする請求項6~8のいずれか1項に記載の光学測定方法。
【請求項10】
前記試料を1次元的、2次元的、または3次元的に駆動し、
前記第1の蛍光成分と前記第2の蛍光成分の差分を前記重畳されたビームのスポット位置ごとに算出する
ことを特徴とする請求項6~9のいずれか1項に記載の光学測定方法。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
本発明は、ガウスビームとドーナツビームを用いた光学測定技術に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、レーザ顕微鏡で光の回折限界値以下の空間分解能を有する超解像を得る様々な方法が提案されている。その一つに、焦点面において動径方向(r)にガウス関数状の強度分布を持つガウスモードのビーム(「ガウスビーム」と称する)と、ドーナツ状の強度分布を持つドーナツモードのビーム(「ドーナツビーム」と称する)で交互に試料を励起し、それぞれのビームによる蛍光イメージの差分をとることで解像度を向上させるサブトラクション超解像法が知られている(たとえば、非特許文献1及び2参照)。
【0003】
公知のサブトラクション超解像法では、メカニカルシャッターや回転式のミラーによりガウスビームとドーナツビームを切り替えている。しかし、機械的な機構では切り替え時間に数ミリ秒以上の時間がかかるため、一方のビームで1フレームまたは1ライン分の測定を行った後にビームを切り替え、その後同じ領域を他方のビームで走査して差分を計算している。
【先行技術文献】
【0004】

【非特許文献1】"Breaking the Diffraction Barrier Using Fluorescence Emission Difference Microscopy" Scientific Report 3, 1441(2013)
【非特許文献2】"Resolution and contrast enhancement in laser scanning microscopy using dark beam imaging"Optics Express 21, 15912 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
サブトラクション超解像法では、測定中に外部からの振動や温度変化等に起因するドリフトの影響を受けると、2つのビームの間で測定した場所がずれてしまうため、差分により計算された像は正しい象を反映しておらず、間違った結果を生じる。
【0006】
また、機械的機構は切り替え時に光学系に振動を与え、測定に不安定をもたらす。サブトラクション超解像法では、厳密に同じ位置に照射した2本のビームの差を計算することが重要であるから、従来の機械的なビームの切り替えは信頼性の観点から好ましくない。
【0007】
本発明は、サブトラクション超解像法で機械的要素を低減または排除して、信頼性の高い超解像イメージングを実現することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
課題を解決するために、実施形態では、ガウスビームとドーナツビームの機械的な切り替えを行わず、ロックイン検出法により同時測定を行い、ピクセル毎に差分を計算する。
【0009】
具体的には、光学測定装置は、
光源と、
前記光源から出射される光を第1ビームと第2ビームに分割するビームスプリッタと、
前記第1ビームを第1の変調周波数で変調する第1の光変調器と、
前記第2ビームを第2の変調周波数で変調する第2の光変調器と、
前記第2ビームを、焦点面でドーナツ型の強度分布を有するドーナツモードのビームに変換するモード変換素子と、
前記第1の変調周波数で変調された前記第1ビームと、前記第2の変調周変調で変調され、かつ前記ドーナツモードに変換された前記第2ビームを重畳して試料に導く光学素子と、
前記試料からの蛍光を前記第1の変調周波数で復調する第1のロックイン増幅器と、
前記試料からの蛍光を前記第2の変調周波数で復調する第2のロックイン増幅器と、
前記第1のロックイン増幅器で復調された蛍光成分と、前記第2のロックイン増幅器で復調された蛍光成分の差分を測定結果として算出する演算装置と、
を有する。
【発明の効果】
【0010】
サブトラクション超解像法において機械的な要素を排除または低減して、信頼性の高い超解像イメージングを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】実施形態の光学測定装置の概略構成図である。
【図2】焦点面におけるガウスビームとドーナツビームの点広がり関数(PSF:Point Spread Function)のサイズと、ドーナツビームの強度プロファイルの図である。
【図3】サブトラクション超解像法の原理を説明する図である。
【図4】減算係数を説明する図である。
【図5】実施形態の光学測定装置の変形例を示す図である。
【図6】実施形態の光学測定法による蛍光ビーズの画像である。
【図7】実施形態の光学測定法により得られた標識したマウスの神経細胞の画像を、ガウスビームによる通常の画像と比較して示す図である。
【図8】実施形態の光学測定法により得られた標識したマウスの神経細胞の画像を、ガウスビームによる通常の画像と比較して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
図1は、実施形態の光学測定装置10Aの概略構成図である。光学測定装置10Aは、従来のサブトラクション超解像法と異なり、ガウスビームとドーナツビームを機械的に切り替えて差分をとるのではなく、2台のロックイン増幅器を用いた同時検出により、各ビームによる蛍光の強度差分をピクセルごとに算出する。

【0013】
光学測定装置10Aでは、単一光源としての半導体レーザ11から出射される同一波長のビームをビームスプリッタ12で2つに分割し、一方をそのままガウスビームLとして用い、他方をドーナツビームLに変換して用いる。ガウスビームLは、ビームの動径方向にガウスモードの強度分布exp(-r2/(2*w2))を有する。ドーナツビームLは、焦点面でドーナツモードの強度分布r2*exp(-r2/(2*w2))を有する。ここで、rはビーム中心軸からの距離、wはビームのスポットサイズである。

【0014】
図2(A)に示すように、ガウスビームLは焦点面においてスポット中心で強度が最も大きくなり、ドーナツビームLは、焦点面においてスポット中心が暗いドーナツ型の強度分布を有する。図2(B)の強度プロファイルに示すように、ドーナツビームLは強度がほぼゼロとなる中心に対して、径方向に対称な2つのピークと広いフリンジを有する。

【0015】
図1に戻って、ガウスビームLは第1の変調器16に導かれ、角周波数ω1で変調される。この例では、変調器16は電気光学変調器(EOM:Electro-Optic Modulator)であり機械的動作を含まない。

【0016】
分割された他方のビームは、ミラー13により第2の変調器17に導かれ、ω1と異なる角周波数ω2で変調される。第2の変調器17も電気光学変調器(EOM)であり、機械的動作を含まない。ω2で変調された他方のビームは、モード変換素子としての可変位相板(VPP:Variable Phase Plate)15に導かれてドーナツビームLに変換される。

【0017】
EOM16、17に供給される変調周波数ω1とω2は、2チャンネルファンクションジェネレータ21により生成され、ドライバ22、23を介してEOM16,17の図示しない電気光学結晶に印加される。ドライバ22、23の出力は、ロックイン検出のための参照信号としても使用される。ロックイン検出については後述する。

【0018】
ドーナツビームLは焦点面、すなわち試料20の表面で動径方向にドーナツ状の強度分布を持つが、可変位相板15の出射直後は、等位相面が螺旋状になった光渦として生成される。可変位相板15は、たとえば、円周方向に屈折率が変化する位相板であり、結晶中にドープする不純物濃度を円周方向に変化させることで屈折率を変えることができる。図2(B)の強度プロファイルは、可変位相板15を用いて生成したドーナツビームLの強度プロファイルである。

【0019】
可変位相板15の中心部では円周方向への屈折率変化が少ないため、光渦の密度はほとんどないが、円周に向かうほど屈折された光が異なる方向に分かれやすいため螺旋状の光渦が生成される。実施形態では、可変位相板15で形成される光ビームを、「ガウスビームL」と区別するために「ドーナツビームL」と称する。

【0020】
可変位相板15から出射されるドーナツビームLは、ミラー18によりビームコンバイナ19に導かれ、ガウスビームLと同軸に重ね合わせられる。重ね合されたガウスビームLとドーナツビームLは、ダイクロイックミラー24を透過し、対物レンズ25により試料20に入射する。

【0021】
試料20は、半導体レーザ11の波長で励起される蛍光色素で標識されており、ガウスビームLとドーナツビームLのそれぞれによって励起されて、光源波長よりも長い蛍光波長の光を発する。試料20からの蛍光は、ダイクロイックミラー24で反射されて励起光(入射ガウスビームL及び入射ドーナツビームL)と分離され、光電子増倍管などの蛍光検出器26に導かれる。

【0022】
蛍光検出器26で検出される蛍光には、ガウスビームLによる励起で放出された蛍光と、ドーナツビームLによる励起で放出された蛍光の2つの蛍光成分が含まれる。そこで、検出された蛍光を2つのロックイン増幅器(アンプ)27と28に入力し、対応する参照周波数ω1とω2でロックイン検出することで、ガウスビームLによる蛍光成分と、ドーナツビームLによる蛍光成分をそれぞれ個別に検出する。

【0023】
ロックイン増幅器27,28で参照周波数ω1とω2で復調された各周波数成分はA/D変換器29でディジタル信号に変換され、パーソナルコンピュータ(PC)30の演算装置に含まれるサブトラクタ(不図示)で、1ピクセル分の強度の差分が算出される。

【0024】
同軸上に重畳されたガウスビームLとドーナツビームLを、試料20面(X-Y面)に対して相対的に走査することで平面画像を得ることができる。3次元蛍光メージングを行う場合は、試料20をZ軸方向(試料のX-Y面に対する垂直方向)に駆動するピエゾステージ31を用いる。ピエゾステージ31は、たとえば圧電アクチュエータとしてチタン酸ジルコン酸鉛(PZT)セラミックを用いたPZTステージ31である。

【0025】
PC30は、1ピクセル分の強度差分が算出される都度、制御信号を生成する。D/A変換器33でアナログ変換された制御信号はPZTステージドライバ32に入力され、PZTステージドライバ32から出力される駆動信号で、試料20を保持するPZTステージ31が駆動される。

【0026】
図1の光学測定装置10Aは、機械的要素を全く含まないので、光学系に対する振動等の影響を排除することができる。また、ガウスビームLとドーナツビームLを重畳して同時に試料測定を行い、ピクセル単位で2つのロックイン増幅器27,28で各蛍光成分を検出し差分計算きることから、ドリフトの影響を排除することができる。したがって、非常に高速かつ安定した動作で、光の回折限界を超える超高解像の蛍光画像を取得することができる。

【0027】
図3は、サブトラクション超解像法の原理を説明する図である。たとえば、情報パターンSを有する試料20を光学測定する。ガウスビームを対物レンズ25を介して試料20に照射して蛍光標識された試料20を励起し、試料20からの蛍光を検出することで、強度Iの画像Aが得られる。また、ドーナツビームを対物レンズ25を介して試料20に照射して試料20を励起し、試料20からの蛍光を検出することで、強度Iの画像Bが得られる。

【0028】
焦点面で異なるスポット形状を有する2つのビームを照射することで、異なるPSFを有するコンフォーカルイメージが得られる。ガウスビームによるスポット画像(強度I)からドーナツビームによるスポット画像(強度I)を引き算することで、スポット中心部の強度情報だけを抽出することができ、解像度を向上することができる。

【0029】
引き算を行う際の係数を適切に選択することで、解像度を調整することができる。たとえば、PC30にてI-b×Iの演算を行う際に、減算係数bを変えることで所望の解像度を得ることができる。減算係数bは、ドーナツビーム画像の重み付け係数と言い換えることができる。画像Cはb=0.4のときの画像、画像Dはb=0.7のときの画像、画像Eはb=1.0のときの画像である。

【0030】
図4は、減算係数を説明する図である。サブトラクション超解像法では減算後に負になる部分は通常ゼロとする。そのため観察像のサイズは減算係数が大きいほど小さくなるが、大きすぎると実際のサイズより小さくなってしまい、間違ったイメージになる。従って観察像と実際の物体のサイズが等しくなる最適な減算係数を決める必要がある。

【0031】
図4(A)は物体のサイズとその観察像のサイズの減算係数依存性を計算した結果を示す。縦軸、及び横軸は入射光の波長で規格化している。対物レンズの開口数(NA)は1.3としている。実線Aは共焦点(コンフォーカル)顕微鏡での観察値、破線Bは回折限界値である。一点鎖線Cは物体のサイズと観察像が等しくなる条件を示しており、この直線上の減算係数値を最適な減算係数と定義することができる。

【0032】
図4(B)は最適な減算係数と物体サイズの関係を示す。波長より大きい物体の場合は減算係数を小さくして通常の共焦点顕微鏡に近い条件で観察するのが好ましく、一方で波長より小さい物体の場合は減算係数を大きくし、サブトラクション法を有効に働かせることで超解像を達成することができる。

【0033】
図4(B)から決まる最適な減算係数は照射光の波長や開口数によって異なるが、事前に光学測定装置10Aの減算係数曲線を求めておくことで、観察対象物のサイズに応じた減算係数を選択することができる。

【0034】
図1の光学測定装置10Aでは、ガウスビームLとドーナツビームLの差分をスポットごと、すなわちピクセルごとに算出するので、ステージを移動する際の機械的振動による誤差やドリフトによる誤差を含まない高解像の測定画像を得ることができる。また、適切に減算係数を選択することで観察画像の解像度を向上することができる。

【0035】
図5は、図1の変形例として、光学測定装置10Bの概略構成を示す。光学測定装置10Bでは、光変調器としてEOM16、17に替えて光チョッパー46、47を用い、可変位相板15に替えて、ラジアル偏光板45を用いる。その他の構成は、図1と同様である。

【0036】
半導体レーザ11を出射した光はビームスプリッタ12によりで2つに分割される。ビームスプリッタ12を透過した一方の光は、ガウスビームLとして光チョッパー46に入射し、変調周波数ω1で変調される。ビームスプリッタ12で反射された他方の光は、ミラー13によりラジアル偏光板45に導かれ、ドーナツビームLが生成される。生成されたドーナツビームLは光チョッパー47に入射し、変調周波数ω2で変調される。

【0037】
それぞれの周波数で変調されたガウスビームLとドーナツビームLは、ビームコンバイナ19で同軸に重ね合されて、試料20に入射する。試料20からの蛍光を、2つのロックイン増幅器27,28を用いて参照周波数ω1とω2で個別に復調する構成は図1と同様である。

【0038】
図5の構成では、光チョッパー46、47はドライバ22、23からの駆動信号によって機械的に回転する。これらはビームの指向方向を全く変えないでガウスビームLとドーナツビームLを切り替える。一方、従来の方法ではビームの切り替えにメカニカルシャッターやフリップミラーを用いている。これらの機械的パーツはビームの指向方向の揺らぎを与える機械的変動要因を有する。本方法では、それらを用いていないので、その影響はない。また、図1と同様に、スポットごと(ピクセルごと)に2つのビーム照射による蛍光の差分を算出できるので、迅速かつ安定して高解像画像を得ることができる。差分を算出する際に、減算係数bを適切に選択することで解像度を向上できる点も図1の光学測定装置10Aと同様である。

【0039】
なお、ドーナツモードの強度分布を実現する光渦の生成には、屈折率可変位相板やラジアル偏光板の他、表面形状を螺旋状に加工した螺旋位相板等、任意のモード変換素子を用いてもよい。光変調器として、電気光学光変調器16、17や光チョッパー46、47の他に、磁気的な光変調器や、光励起キャリアの生成による光変調器を用いてもよい。

【0040】
図6は、図1の光学測定装置10Aによる蛍光ビーズの観察画像である。図6(A)はガウスビームLの入射による蛍光像、図6(B)はドーナツビームLの入射による蛍光像、図6(C)と図6(D)は、図6(A)から図6(B)を引き算したときに得られるサブトラクション像である。ガウスビームLの変調・復調周波数ω1は1.2kHz、ドーナツビームLの変調・復調周波数ω2は1.8kHz、図6(C)の減算係数bは0.3、図6(D)の減算係数bは0.7である。

【0041】
図6(A)の蛍光像は、通常の光学顕微鏡でガウスビームのみの照射で得られる画像と等価である。実施例の光学測定装置10Aで得られる画像の空間分解能は、減算係数bの値に依存するが、通常の蛍光像(図5(A))と比較して2倍前後に向上する。図6(C)で減算係数b=0.3のときのFWHM(Full Width at Half Maximum:半値全幅)は160nm、図6(D)で減算係数b=0.7のときのFWHMは100nmである。図6(A)のガウスビームによる通常の光学測定のFWHMである220nmと比較して、空間分解能が大きく向上していることがわかる。

【0042】
図7及び図8は、YFP(Yellow Fluorescent Protein:黄色蛍光タンパク質)で標識したマウスの神経細胞の観察結果を示す図である。図7(A)及び図8(A)は、実施形態の光学測定装置10Aによる蛍光像(測定画像)、図7(B)及び図8(B)は、比較例として通常のガウスビームによる蛍光像を示す。図7(C)は、図7(A)と図7(B)の矢印で示す範囲の強度分布を示すグラフ、図8(C)は、図8(A)と図8(B)の矢印で示す範囲の強度分布を示すグラフである。図7(C)と図8(C)で、実線(A)が実施形態の方法による強度スペクトル、破線(B)がガウスビームの通常測定で得られる強度スペクトルである。

【0043】
図8においても、ガウスビームを用いた通常測定でのFWHMが300nmであるのに対し、実施形態の方法による測定では、FWHMが150nmにまで低減され、2倍の分解能が得られることがわかる。

【0044】
実施形態では、ひとつの光源11を用いて、同一波長のガウスビームとドーナツビームを重畳して用いるので、生体試料を対称とした多色イメージングへの拡張が容易である。また、単色の測定では、光源として数mW程度の汎用の半導体レーザを1つ用いるだけなので、STED(Stimulated Emission Depletion:誘導放出抑制)法等の他の超解像法と比較してコストを1/4~1/2に低減することができる。
【符号の説明】
【0045】
10A、10B 光学測定装置
11 半導体レーザ(光源)
15 可変位相板(モード変換素子)
16,46 第1の光変調器
17、47 第2の光変調器
19 ビームコンバイナ
20 試料
21 2チャンネルファンクションジェネレータ
22、23 ドライバ
24 ダイクロイックミラー
25 対物レンズ
26 蛍光検出器
27,28 ロックイン増幅器
30 PC(演算装置)
31 PZTステージ
45 ラジアル偏光板(モード変換素子)
図面
【図1】
0
【図5】
1
【図2】
2
【図3】
3
【図4】
4
【図6】
5
【図7】
6
【図8】
7