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明細書 :ボルナ病ウイルスを利用するベクター及びその利用

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第5299879号 (P5299879)
登録日 平成25年6月28日(2013.6.28)
発行日 平成25年9月25日(2013.9.25)
発明の名称または考案の名称 ボルナ病ウイルスを利用するベクター及びその利用
国際特許分類 C12N  15/09        (2006.01)
C12N   7/00        (2006.01)
FI C12N 15/00 ZNAA
C12N 7/00
請求項の数または発明の数 15
全頁数 57
出願番号 特願2011-507086 (P2011-507086)
出願日 平成22年3月17日(2010.3.17)
国際出願番号 PCT/JP2010/054600
国際公開番号 WO2010/113647
国際公開日 平成22年10月7日(2010.10.7)
優先権出願番号 2009087608
優先日 平成21年3月31日(2009.3.31)
優先権主張国 日本国(JP)
審査請求日 平成23年8月10日(2011.8.10)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
発明者または考案者 【氏名】朝長 啓造
【氏名】大東 卓史
【氏名】本田 知之
個別代理人の代理人 【識別番号】100077012、【弁理士】、【氏名又は名称】岩谷 龍
審査官 【審査官】西村 亜希子
参考文献・文献 SCHNEIDER U et al.,A Borna disease virus vector for expression of foreign genes in neurons of rodents,J. Virol.,2007年 7月,Vol.81, No.13,pp.7293-7296
大東卓史ほか,BDVを利用したRNAウイルスベクターの開発の試み,第147回 日本獣医学会学術集会講演要旨集,2009年 3月 1日,p.247
大東卓史ほか,BDVリバースジェネティクスの確立とBDVベクターの開発に向けた検討,第56回日本ウイルス学会学術集会 プログラム・抄録集,2008年10月 1日,p.238
調査した分野 C12N 15/09
C12N 7/00
CAplus/MEDLINE/WPIDS/BIOSIS(STN)
PubMed
UniProt/GeneSeq
SwissProt/GeneSeq
JSTPlus(JDreamIII)
特許請求の範囲 【請求項1】
(a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置され、該(a)は、前記外来性遺伝子の3’末端側及び5’末端側にそれぞれ制限酵素サイトを含み、前記外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトとP遺伝子の翻訳領域との間、及び前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとL遺伝子の翻訳領域との間又はボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子をボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとM遺伝子の翻訳領域との間にそれぞれ、配列番号11に示す配列を含み、該外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトと配列番号11に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccが挿入され、かつ該外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトと配列番号11に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccaが挿入されていることを特徴とするウイルスベクター。
【請求項2】
(a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてG遺伝子が破壊された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである請求項1に記載のウイルスベクター。
【請求項3】
(a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてG遺伝子及びM遺伝子が破壊された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである請求項1又は2に記載のウイルスベクター。
【請求項4】
外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトが、Bst BIサイトであり、外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトが、Pac Iサイトである請求項1~3のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項5】
(c)プロモーター配列が、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列であることを特徴とする請求項1~4のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項6】
(a)組換えウイルスRNAのcDNAにおいて、ボルナ病ウイルスゲノムにおけるL遺伝子のイントロンが削除されている請求項2又は3に記載のウイルスベクター。
【請求項7】
請求項1~6のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるRNAを含むことを特徴とする組換えウイルス。
【請求項8】
請求項1~6のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてボルナ病ウイルスのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、及び該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
【請求項9】
ヘルパープラスミドとして、さらに、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する請求項8に記載の組換えウイルスの作製方法。
【請求項10】
ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスのM遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する請求項8又は9に記載の組換えウイルスの作製方法。
【請求項11】
請求項7に記載の組換えウイルス、又は請求項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスをin vitroの細胞又は動物(ヒトを除く)に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
【請求項12】
請求項7に記載の組換えウイルス、又は請求項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
【請求項13】
請求項7に記載の組換えウイルス、又は請求項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
【請求項14】
請求項1~6のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
【請求項15】
外来性遺伝子が、機能性RNAをコードするDNAである請求項1~6のいずれかに記載のウイルスベクター。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
本発明は、外来性遺伝子を細胞に導入するためのウイルスベクター、組換えウイルス及びその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
外来性遺伝子を生体又は細胞に運搬する手段として、ウイルスベクターを利用する方法が知られている。これまでに、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスを利用するベクターが開発されている。
【0003】
しかしながら、これらの既存のウイルスベクターでは、例えばDNAウイルスの場合には宿主染色体にウイルス遺伝子が組み込まれることにより宿主(例えば、ヒト)への病原性が発現するという問題点があった。また、ウイルスによっては感染可能な宿主域が狭く、特定の生物にしか適用できないという問題点や、外来性遺伝子のウイルスゲノムへの組込み部位により遺伝子導入効率に差があり、遺伝子導入効率が悪いという問題点があった。また、生体内での免疫応答によりウイルスが排除されたり、ウイルス遺伝子の変異やプロモーター効率の変化が生じたりすることから、安定性及び持続性が悪いという問題点もあった。
【0004】
さらに、遺伝子治療等においては、目的とする細胞のみに遺伝子を導入することができる遺伝子導入技術が期待されている。特に、神経系疾患の治療には遺伝子治療が有効であると考えられるため、神経細胞に選択的に遺伝子を導入でき、しかも安全性、安定性、持続性及び遺伝子導入効率が高いウイルスベクターの開発が望まれている。
【0005】
ボルナ病ウイルス(Borna disease virus:以下、BDVともいう)は、非分節のマイナス鎖、1本鎖のRNAをゲノムとして持つモノネガウイルス目に属するウイルスであり、神経細胞に感染指向性があるという特徴を有する。さらに、BDVは細胞核で複製するウイルスであるが、その感染は非細胞障害性であり長期に持続感染するという特徴や、感染可能な宿主域が極めて広いという特徴も有する(非特許文献1及び2等)。
【0006】
BDVを利用する外来性遺伝子の細胞への導入技術として、緑色蛍光蛋白質(GFP)の発現カセットをBDVゲノムの5’末端側の非翻訳領域に挿入し、この組換えウイルスを高活性のポリメラーゼと共にラットに感染させると、ラットの神経細胞においてGFP遺伝子が発現したことが報告されている(非特許文献3)。
【0007】
特許文献1には、(a)ボルナ病ウイルスゲノムをコードするcDNAのG遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNA、(b)リボザイムをコードするcDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているウイルスベクターが開示されている。
【0008】
BDVを利用する上記技術によれば、中枢神経系の細胞に選択的に外来性遺伝子を挿入することができると考えられる。しかしながら、上記BDVを用いる技術においては、遺伝子の導入効率が十分高くないため、遺伝子の導入効率をより高くするための改良の余地があった。従って、組換えウイルスの複製効率が高く、感染可能な宿主域が広く、安全性及び外来性遺伝子の導入効率が高く、安定性及び持続性が良好であり、しかも中枢神経系に選択的に外来性遺伝子を導入することができるウイルスベクターは、未だ開発されていなかった。
【先行技術文献】
【0009】

【特許文献1】特開2010-22338号公報
【0010】

【非特許文献1】蛋白質 核酸 酵素、Vol.52、No.10、p.1168-1174(2007)
【非特許文献2】朝長啓造、「ボルナ病ウイルス感染と中枢神経系疾患」、最新医学・第60巻・第2号(2005年2月号別刷)、79-85頁
【非特許文献3】U. Schneider et al., Journal of Virology (2007) p.7293-7296
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも目的細胞(例えば、脳神経系等の中枢神経系の細胞等)に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ目的細胞以外の細胞に伝播しないため病原性が低い(安全性が高い)組換えウイルスを効率よく産生できるウイルスベクター、組換えウイルス及び該組換えウイルスを利用する外来性遺伝子の導入方法、外来性遺伝子導入剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
上記課題を解決するため、本発明者らはBDVゲノム(RNAウイルスゲノム)における外来性遺伝子の挿入部位について鋭意研究を行った。その結果、BDVゲノムをコードするcDNA(BDVゲノムRNAのcDNA)の種々の部位に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスゲノムのcDNAを含むウイルスベクターを作製し、これらを後述するヘルパープラスミド(BDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド(群))と共に細胞に導入して組換えウイルスを産生させ、得られた組換えウイルスを細胞に感染させたところ、BDVゲノムにおいてP遺伝子の翻訳領域(ORF)とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域(P遺伝子のORFの下流に結合する非翻訳領域)に外来性遺伝子を挿入した場合に、該ベクターの組換えウイルスの産生能が高い(該ベクターから産生される組換えウイルスの複製効率が高い)ことを見出し、さらに、該ベクターから産生される組換えウイルスにより細胞において外来性遺伝子が効率よく発現されること、すなわち細胞に外来性遺伝子を非常に効率よく導入することができることを見出した。
【0013】
これまで、このようなP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えBDVベクターの作製は不可能であると考えられていたが、本発明者らは、このような組換えBDVベクターの作製に初めて成功した。既存の組換えBDVベクターにおいては、外来性遺伝子をG遺伝子領域(特許文献1)又はゲノムの5’末端領域(非特許文献3)に挿入して該遺伝子を発現させていた。しかしながら、外来性遺伝子をG遺伝子領域に挿入したベクターは、組換えウイルス産生能が低く、また、該ベクターから産生される組換えウイルスの細胞への感染は一過性であり、持続的に外来性遺伝子を発現できなかった。また、ゲノムの5’末端領域に外来性遺伝子を挿入した組換えBDVベクターは、遺伝子の導入効率が低かった。本発明者らは、P遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えBDVベクターは、既存の組換えBDVベクターよりウイルス産生能が高いものであること、該ベクターから産生される組換えウイルスは、脳神経系細胞においても高効率に、長期間目的遺伝子を発現することができるものであることを見出し、これらを用いると様々な外来性遺伝子を目的細胞に効率よく導入することができることに想到した。
【0014】
本発明者らはまた、上記BDVゲノムのP遺伝子のORFとM遺伝子のORFとの間の非翻訳領域(P遺伝子のORFの下流に結合する非翻訳領域)内に外来性遺伝子を挿入した組換えBDVゲノムのcDNAを使用するウイルスベクターにおいて、G遺伝子をコードする配列を破壊(削除)すると、該ベクターから産生される組換えウイルスの病原性を低減できることを見出した。このようなG遺伝子欠損型のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、細胞内における複製能は維持されているため導入された細胞には持続感染するが、G蛋白質を合成できないため他の細胞に伝播しない。本発明者らは、このようなウイルスベクターにおいてG遺伝子及びM遺伝子を破壊させると、組換えウイルスの細胞内における複製能は維持したまま、その伝播能力をより低減することができることを見出した。さらに、ウイルスベクターにおいて、L遺伝子のイントロン(G遺伝子の一部)を削除することにより、BDVゲノムではG遺伝子により分断されているL遺伝子のORFを結合させると、産生される組換えウイルスの複製能力を向上させることができる、すなわち細胞内における外来性遺伝子の複製速度を速くすることができることを見出した。
【0015】
本発明者らは更に、上記のG遺伝子を破壊したウイルスベクターと共に、他のウイルスの外殻蛋白質をコードする遺伝子を用いて組換えウイルスを製造すると、組換えウイルスの細胞指向性を変化させることができるため、種々の細胞に目的遺伝子を効率よく導入できることを見出した。
【0016】
なお、BDVゲノムには、少なくとも6つの蛋白質、すなわち核蛋白質(N蛋白質)、X蛋白質、リン酸化蛋白質(P蛋白質)、マトリックス蛋白質(M蛋白質)、表面糖蛋白質(G蛋白質)及びRNA依存性RNAポリメラーゼ(L蛋白質)がコードされている。図1は、BDVゲノムの構造を模式的に示す図である。図1において、N、X、P、M、G及びLは、それぞれの遺伝子のORFを模式的に示している。BDVゲノムは、図1に示すように、N、X、P、M、G及びLの各遺伝子を、3’末端からこの順に有する。本明細書中、G蛋白質、M蛋白質、N蛋白質、P蛋白質及びL蛋白質をコードするウイルスRNAを、それぞれG遺伝子、M遺伝子、N遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子という。また、例えば、「G遺伝子のcDNA」とは、G遺伝子をコードするcDNAを意味する。
【0017】
すなわち、本発明は、以下の項1~項14に関する。
項1. (a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクター。
項2. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてG遺伝子が破壊された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである項1に記載のウイルスベクター。
項3. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてG遺伝子及びM遺伝子が破壊された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである項1又は2に記載のウイルスベクター。
項4. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNAである項1に記載のウイルスベクター
項5. (c)プロモーター配列が、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列であることを特徴とする項1~4のいずれかに記載のウイルスベクター。
項6. (a)組換えウイルスRNAのcDNAの上流に(b1)ハンマーヘッドリボザイムをコードするcDNAが配置され、かつ、該(a)の下流に(b2)δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするcDNA配列が配置されていることを特徴とする項1~5のいずれかに記載のウイルスベクター。
【0018】
項7. 項1~6のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるRNAを含むことを特徴とする組換えウイルス。
項8. 項1~6のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてボルナ病ウイルスのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、及び該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項9. ヘルパープラスミドとして、さらに、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する項8に記載の組換えウイルスの作製方法。
項10. ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスのM遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する項8又は9に記載の組換えウイルスの作製方法。
【0019】
項11. 項7に記載の組換えウイルス、又は項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを細胞又は動物に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
項12. 項7に記載の組換えウイルス、又は項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
項13. 項7に記載の組換えウイルス、又は項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
項14. 項1~6のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
【0020】
本発明はまた、以下の方法、使用等も包含する。
項7に記載の組換えウイルス、又は項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを動物に投与する脳神経系細胞への外来性遺伝子の導入方法、
項7に記載の組換えウイルス、又は項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
項7に記載の組換えウイルス、又は項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
in vitroの細胞又は動物に外来性遺伝子を導入するための、項7に記載の組換えウイルス、又は項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するための、項7に記載の組換えウイルス、又は項8~10のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
【発明の効果】
【0021】
本発明によれば、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため宿主細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも脳神経系の細胞等の目的細胞に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ目的細胞以外の細胞には伝播しないため病原性が低い(安全性が高い)組換えウイルスを高い生産性で産生できるウイルスベクター及び組換えウイルスを作製することができる。また、本発明によれば、外来性遺伝子を脳神経系の細胞等の目的細胞に選択的にかつ効率よく導入することができ、該細胞において外来性遺伝子を持続的に発現させることができる。さらに、本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、脳神経系細胞等の細胞の核内で持続感染を起こすため、宿主免疫の攻撃を受け難く、排除が起こりにくい。また、本発明の組換えウイルスが持つP蛋白質には、宿主免疫の応答経路を阻害するという働きがあり、ウイルス感染細胞では自然免疫の活性化も起こらない。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】図1は、ボルナ病ウイルスのゲノム(野生型)の構造を模式的に示す図である。
【図2】図2(a)は、野生型のBDVゲノムのcDNAにおけるP遺伝子のORFとM遺伝子のORFとの間の非翻訳領域(BDVゲノムの塩基の番号で1875~1895)を模式的に示した図であり、(b)は、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子挿入部位の一例を模式的に示した図である。
【図3】図3は、本発明のウイルスベクターの構造の一例を模式的に示す図である。
【図4】図4は、BDVゲノムの5’末端側の非翻訳領域にGFP遺伝子を挿入した組換えウイルスベクター(rBDV-5’GFP)の構造を模式的に示す図である。
【図5】図5は、野生型又は組換え型BDVに感染したVero細胞の経時変化(感染後0日から19日の感染率変化)を示す図である。
【図6】図6(a)及び(b)は、野生型BDV、組換えウイルスp/mGFP及び組換えウイルス5’GFPそれぞれを感染させた細胞における遺伝子の発現をノーザンブロット法により調べた結果(a)、及び蛋白質の発現をウェスタンブロット法により調べた結果を示す図(b)である。
【図7】図7a~fはそれぞれ、野生型BDV、組換えウイルスp/mGFP及び組換えウイルス5’GFPそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真である。
【図8】図8a~fはそれぞれ、野生型BDV、組換えウイルスp/mGFP及び組換えウイルス5’GFPそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真である。
【図9】図9は、ラット脳へのウイルスの感染を調べる実験方法を説明するための図である。
【図10】図10は、ラット脳へのウイルスの接種部位を示す図である。
【図11】図11は、ラット脳において発現したBDVゲノムのPCR産物を電気泳動した結果を示す図である。
【図12】図12a~dはそれぞれ、組換えウイルス接種後14日後のラット脳を切開して裏返したマクロ写真(a及びb)、及び該脳のマクロ蛍光写真(c及びd)である。
【図13】図13上図及びa~dはそれぞれ、ウイルスを感染させたラット脳の大脳皮質のマクロ写真(上図)及び該大脳皮質の切片の顕微鏡写真(a~d)である。
【図14】図14(a)及び(b)は、rBDV-p/mDsRedベクターから得られた組換えウイルスを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真である。
【図15】図15(a)及び(b)はそれぞれ、rBDV-p/mLuciベクターから得られた組換えウイルスを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真(a)及びルシフェラーゼの活性(b)を示す図である。
【図16】図16は、本発明のウイルスベクターの構造の一例を模式的に示す図である。
【図17】図17は、本発明のウイルスベクターの構造の一例を模式的に示す図である。
【図18】図18は、組換えウイルス接種8カ月後のマウスの脳切断面の蛍光顕微鏡写真(図18a:マクロ写真、図18b:図18aの400倍拡大写真)である。
【図19】図19は、プラスミドp/mGFP ΔGの作製手順の概略を示す図である。
【図20】図20は、プラスミドp/mGFP ΔG LLの作製手順の概略を示す図である。
【図21】図21は、BDVのG遺伝子発現プラスミドの作製手順の概略を示す図である。
【図22】図22は、プラスミドp/mGFPΔG及びp/mGFP ΔG LLそれぞれによる組換えBDV産生能力を比較した図である。
【図23】図23は、G遺伝子安定発現Vero細胞及びVero細胞へのp/mGFP ΔG-LLウイルスの感染率の推移を示す図である。
【図24】図24aは、野生型BDV及びG欠損型組換えウイルスそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現をウェスタンブロット法により調べた結果を示す図であり、図24bは、G欠損型組換えウイルスの感染によりGFPを発現したVero細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図25】図25は、BDV G遺伝子細胞内領域と水疱性口内炎ウイルス(VSV)のG遺伝子細胞外及び膜貫通領域とを有するキメラ蛋白質発現プラスミドの作製手順の概略を示す図である。
【図26】図26は、ヘルパープラスミドとしてBDVのG遺伝子、又はVSV及び狂犬病ウイルス(Rab)のいずれかの外殻遺伝子を用いた場合のG欠損型組換えウイルスの回収効率を示す図である。
【図27】図27は、M遺伝子を欠損させたプラスミドp/mGFP ΔM-G LLの作製手順の概略を示す図である。
【図28】図28は、p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorの作製手順の概略を示す図である。
【図29】図29は、組換えウイルスp/mNEP感染細胞のWestern Blottingの結果を示す図である。
【図30】図30は、組換えウイルスを感染させた細胞におけるNEPの酵素活性を示す図である。
【図31】図31は、p/m miR155導入用ベクター(pSIRIUS-B)の作製手順の概略を示す図である。
【図32】図32は、プラスミドp/m miR155の作製手順の概略を示す図である。
【図33】図33は、組換えウイルスを感染させた細胞における標的遺伝子の転写阻害効率を示す図である。
【図34】図34は、プラスミドp/m miRx2の作製手順の概略を示す図である。
【図35】図35は、miRNA×1(p/m miR155)、miRNA×2及びmiRNA×4を挿入したp/mベクターの模式図である。
【図36】図36は、GAPDHに対するmiRNAを挿入した組換えウイルスRNAを有する組換えウイルスp/m-miR-GAPDHを感染させた効果を示す図である。
【図37】図37は、APP(アミロイド前駆蛋白質)に対するmiRNAを挿入した組換えウイルスRNAを有する組換えウイルスp/m-miR-APPを感染させた効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下に、本発明を説明する。
1.ウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、(a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているものである。
以下、上記(a)の組換えウイルスRNAのcDNAを、単に「(a)組換えBDVゲノムのcDNA」ともいう。本発明のウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、上記(a)、(b)及び(c)以外の配列を含んでもよい。

【0024】
(a)組換えBDVゲノムのcDNA
本発明における(a)組換えBDVゲノムのcDNAは、BDVゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する組換えBDV RNAのcDNAであり、該組換えBDV RNAは、前記P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する。
このような(a)組換えBDVゲノムのcDNAとして、BDVゲノム又はBDVゲノムにおいてG遺伝子及びM遺伝子のいずれか又は両方が破壊された配列において、P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列をコードするcDNA等が好適に用いられる。
中でも、本発明における(a)組換えBDVゲノムのcDNAとして、BDVゲノムにおいてG遺伝子及びM遺伝子のいずれか又は両方が破壊された配列を有し、P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有するRNAのcDNAが好適である。

【0025】
本発明における(a)組換えBDVゲノムのcDNAは、より好ましくは、BDVゲノムにおいてG遺伝子が破壊された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである。(a)組換えBDVゲノムのcDNAとして、このようなG遺伝子が破壊された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAを含むウイルスベクターを、以下、「G遺伝子欠損型ウイルスベクター」ともいう。G遺伝子が破壊されていることにより、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、導入された細胞以外の細胞に伝播しないため、病原性が低減されて安全性が高いものとなる。さらに好ましくは、BDVゲノムにおいてG遺伝子及びM遺伝子が破壊された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである。このような組換えウイルスRNAのcDNAを含むウイルスベクターを、以下、「G遺伝子及びM遺伝子欠損型ウイルスベクター」ともいう。G遺伝子及びM遺伝子が破壊されていることにより、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスの病原性がより低減され、安全性がより高くなる。
遺伝子を破壊するとは、通常、該遺伝子が蛋白質(例えばG遺伝子であればG蛋白質)をコードすることができる形態で存在しないことを意味する。遺伝子の破壊は、その遺伝子全体を削除することの他、該遺伝子の一部の削除、該遺伝子に他の配列を挿入する、該遺伝子中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する等により行うことができる。

【0026】
G遺伝子欠損型ウイルスベクター、及びG遺伝子及びM遺伝子欠損型ウイルスベクターにおいては、BDVゲノムにおけるL遺伝子のイントロンが削除されていることが好ましい。L遺伝子のイントロンを削除することにより、天然型BDVゲノムでは分断されているL遺伝子のORFが図16に示すように連結されるため、組換えウイルスの複製能力、すなわち細胞内での外来性遺伝子の発現効率がより向上する。また、L遺伝子のイントロンを削除すると、より大きな外来性遺伝子を挿入することが可能となる。L遺伝子のイントロンの除去は、公知の方法により行うことができる。

【0027】
本発明における(a)組換えBDVゲノムのcDNAとして、BDVゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNAを用いることもできる。このような組換えBDVゲノムのcDNAは、BDVゲノム(RNAウイルスゲノム)をコードするcDNAにおいて、BDVのP遺伝子の翻訳領域(ORF)とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に任意の外来性遺伝子が挿入されたものである。

【0028】
本発明のウイルスベクターにおける(a)組換えBDVゲノムのcDNAの構造の一例を、図3に模式的に示す。図3は、BDVゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNAである。

【0029】
本発明のウイルスベクターにおける(a)組換えBDVゲノムのcDNAの好ましい構造の一例を、図16に模式的に示す。図16に示される組換えBDVゲノムのcDNAは、BDVゲノムにおいてG遺伝子が破壊(削除)された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである。

【0030】
本発明のウイルスベクターにおける(a)組換えBDVゲノムのcDNAの別の好ましい構造の一例を、図17に模式的に示す。図17に示される組換えBDVゲノムのcDNAは、BDVゲノムにおいてG遺伝子及びM遺伝子が破壊(削除)された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである。図17中の点線で囲まれたMは、削除されたM遺伝子を示す。なお、図3においては、L遺伝子はG遺伝子により分断されているが、図16及び図17に示される組換えBDVゲノムのcDNAにおいては、G遺伝子の一部の削除によりBDVゲノムにおけるL遺伝子のイントロンが削除されているため、L遺伝子のORFが図中に矢印で示す部分において結合されている。

【0031】
本発明におけるBDVゲノムは、Bornaviridae(ボルナウイルス科)に属するウイルス又はその変異株の遺伝子であればよい。ボルナウイルス科に属するウイルスとしては、例えば、He80、H1766、Strain V、huP2br等の菌株が挙げられる。変異株としては、例えば、No/98、Bo/04w、HOT6等が挙げられる。これらのゲノム配列は、例えば、以下から入手可能である。
He80;GenBank Accession# L27077, Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994).
H1766;GenBank Accession# AJ311523, Pleschka,S., Staeheli,P., Kolodziejek,J., Richt,J.A., Nowotny,N. and Schwemmle,M. Conservation of coding potential and terminal sequences in four different isolates of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 82 (PT 11), 2681-2690 (2001).
Strain V;GenBank Accession# U04608, Briese,T., Schneemann,A., Lewis,A.J.,
Park,Y.S., Kim,S., Ludwig,H. and Lipkin,W.I. Genomic organization of Borna disease virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (10), 4362-4366 (1994).
huP2br;GenBank Accession# AB258389, Nakamura, Y., Takahashi, H., Shoya, Y., Nakaya, T., Watanabe, M., Tomonaga, K., Iwahashi, K., Ameno, K., Momiyama, N., Taniyama, H., Sata, T., Kurata, T., de la Torre, J. C., Ikuta, K. Isolation of Borna disease virus from human brain tissue, J. Virol 74 (2000) 4601-4611.
No/98;GenBank Accession# AJ311524, Nowotny,N. and Kolodziejek,J. Isolation and characterization of a new subtype of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 74, 5655-5658 (2000).
Bo/04w;GenBank Accession# AB246670, Watanabe,Y., Ibrahim,M.S., Hagiwara,K., Okamoto,M., Kamitani,W., Yanai,H., Ohtaki,N., Hayashi,Y., Taniyama,H., Ikuta,K. and Tomonaga,K. Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility. Microbes and Infection 9 (2007) 417-427.

【0032】
また、BDVゲノムは、BDVとしての機能が保持されている限り、これらのゲノム配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、1乃至数個(通常1~5個、好ましくは1~3個、さらに好ましくは1~2個)であってよい。

【0033】
BDVゲノム、及びBDVゲノムにおいてG遺伝子等が破壊された配列を有するRNAのcDNA、すなわちこのような配列のRNAをコードするcDNAは、当該ウイルスゲノム情報に基づいて調製することができる。例えば、RNAゲノムから、配列逆転酵素を使用してcDNAを調製することができる。また、BDVゲノムにおいてG遺伝子が破壊された配列を有するRNAのcDNAは、例えば、BDVゲノムのcDNAを鋳型に、適当なプライマーを用いてPCRを行なうことにより容易に作製することができる。BDVゲノムにおいてG遺伝子及びM遺伝子が破壊された配列を有するRNAのcDNAは、例えば、BDVゲノムのcDNA又は該ゲノムにおいてG遺伝子が破壊された配列を有するRNAのcDNAを鋳型に、適当なプライマーを用いてPCRを行なうことにより容易に作製することができる。また、RNAゲノムの配列、又は該RNAゲノムからG遺伝子等を欠損させた配列に基づき、DNA合成機を用いて化学合成することができる。あるいは、本発明における(a)組換えBDVゲノムのcDNAを取得する方法として、公知のPCR等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。PCR、プライマーの調製等の操作は、公知の遺伝子工学的手法(遺伝子操作技術)により、行うことができる。

【0034】
(a)組換えBDVゲノムのcDNAは、BDVゲノムにおけるP遺伝子のORFの下流に連結する非翻訳領域内に任意の外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである。P遺伝子のORFの下流に連結する非翻訳領域は、例えば、BDVゲノムにおいては、P遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域(以下、単に「P遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域」ともいう)である。外来性遺伝子がこのような箇所に挿入されていることにより、ウイルスベクターの組換えウイルス生産性、すなわち該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスの複製効率を高くすることができるため、効率よく組換えウイルスを産生することができる。また、該ウイルスベクターから産生(複製)される組換えウイルスは、細胞に導入した場合に外来性遺伝子を効率よく発現できるものとなる。従って、本発明のウイルスベクターを細胞に導入した際、又は該ウイルスベクターから産生される組換えBDVを細胞に感染させた際に、任意の外来性遺伝子が効率よく細胞に導入される。すなわち、外来性遺伝子が細胞内において効率よく発現されることになる。図2(a)に示すように、野生型のBDVゲノムのcDNAにおいて、P遺伝子のORFの下流に連結する非翻訳領域(すなわちBDVゲノムにおけるP遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域)(例えば、配列番号1にそのcDNA配列が示されるBDVゲノムの塩基の番号で1875~1895(すなわち配列番号1の1875~1895番の塩基))には、P遺伝子の停止シグナル配列(配列番号1の塩基の番号で1875~1882)及びM遺伝子の開始シグナル配列(配列番号1の塩基の番号で1875~1890)が存在する。P遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域(例えば、配列番号1の塩基の番号で1878~1892の間)における外来性遺伝子の挿入部位としては、P遺伝子の停止シグナル配列及び/又はM遺伝子の開始シグナル配列を含まない領域が好ましく、P遺伝子の停止シグナル配列及びM遺伝子の開始シグナル配列を含まない領域がより好ましく、例えば、配列番号1にそのcDNA配列が示されるBDVゲノムであれば、配列番号1の塩基の番号で1890と1891の間等が特に好ましい。

【0035】
本発明における組換えBDVゲノムは、外来性遺伝子の両側又は片側(好ましくは、両側)に制限酵素サイトを含むことができる。制限酵素サイトを有すると、外来性遺伝子をBDVゲノムの配列中に容易に組み込みやすくなると共に、外来性遺伝子の蛋白質への翻訳効率が上昇するため好ましい。本発明において、外来性遺伝子の両側又は片側に配置することができる制限酵素サイトとしては、例えば、外来性遺伝子の3’末端側については、Bst BIサイト、Pac Iサイト、Sse8387 Iサイト、Swa Iサイト、Kpn Iサイト等が挙げられ、Bst BIサイトが好ましい。外来性遺伝子の5’末端側については、Pac Iサイト、Bst BIサイト、Sse8387 Iサイト、Swa Iサイト、Kpn Iサイト等が挙げられ、Pac Iサイトが好ましい。

【0036】
また、本発明における組換えBDVゲノムがM遺伝子を含む場合には、該組換えBDVゲノムのcDNAは、外来性遺伝子(及び必要に応じてその両側又は片側に配置される制限酵素サイト)とP遺伝子のORFとの間、及び外来性遺伝子(及び必要に応じてその両側又は片側に配置される制限酵素サイト)とM遺伝子のORFとの間にそれぞれ、P遺伝子の停止シグナル配列及びM遺伝子の開始シグナル配列(taaaaaaatcgaatca(配列番号11))を含む配列が存在することが好ましい。本発明における組換えBDVゲノムのcDNAにおいては、例えば、図2(b)にあるような配列で任意の外来性遺伝子が挿入されていることがより好ましい。図2(b)には、一例としてM遺伝子を含む組換えBDVゲノムのcDNAが示されている。M遺伝子欠損型のウイルスベクターの場合にも、図2(b)に示されるように、外来性遺伝子の下流にP遺伝子の停止シグナル配列及びM遺伝子の開始シグナル配列(配列番号11)を含む配列を有することが好ましい。M遺伝子欠損型のウイルスベクターの場合、図2(b)に示される外来性遺伝子の下流のP遺伝子の停止シグナル配列及びM遺伝子の開始シグナル配列は、外来性遺伝子の停止シグナル及びL遺伝子の開始シグナルとして機能する。なお、図2(b)では、一例として外来性遺伝子の3’末端側にBst BIサイト、外来性遺伝子の5’末端側にPac Iサイトをそれぞれ挿入した場合を示しているが、外来性遺伝子の両側に配置する制限酵素サイトは、これらに限定されるものではない。

【0037】
本発明における外来性遺伝子の種類や長さは特に限定されず、目的に応じて所望の遺伝子を用いることができる。例えば、蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子のcDNA、siRNA、short hairpin RNA (shRNA)、microRNA (miRNA)をコードするcDNA、RNAアプタマーをコードするcDNA等を用いることができる。本発明のウイルスベクターにおいては、1又は2以上の外来性遺伝子を使用することができる。

【0038】
(b)リボザイムをコードするDNA
リボザイムとしては、(a)組換えウイルスのcDNAから転写された任意の外来性遺伝子を切断することができる配列のものであればよい。(b)としては、例えば、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HDVRz)、ヘアピンリボザイム、人工リボザイム等のリボザイムをコードするcDNA等のDNAが挙げられる。また、リボザイム活性を有する限り、上記リボザイムの改変型リボザイムをコードするcDNA等のDNAも使用することができる。改変型リボザイムとしては、共通配列を有し、1~数個(数個とは、例えば、10個、好ましくは5個、より好ましくは3個、さらに好ましくは2個である)の塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列からなり、かつリボザイムとして機能するポリヌクレオチド等が挙げられる。中でも、本発明におけるリボザイムとしては、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HDVRz)が好ましい。また、(a)組換えBDVゲノムのcDNAの上流、すなわち3’末端側に(b1)HamRzをコードするDNA(好ましくはcDNA)が配置され、かつ、該(a)の下流、すなわち5’末端側に(b2)HDVRzをコードするDNA(好ましくはcDNA)配列が配置されていることが特に好ましい。これにより、細胞における外来性遺伝子の発現効率が向上する。

【0039】
HamRzの塩基配列は、Yanai et al., Microbes and Infections 8 (2006) 1522-1529、Mercier et al., J. Virol. 76 (2002) 2024-2027及びInoue et al., J. Virol. Methods 107 (2003) 229-236等に記載されている。
HDVRzの塩基配列は、Ferre-D'Amare,A.R., Zhou,K. and Doudna,J.A. Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme. Nature 395 (6702), 567-574 (1998)
等に記載されている。本発明においては、これらの文献に記載されているHamRzの塩基配列をコードするcDNAを用いることができる。本発明における特に好ましいHamRz及びHDVRzの塩基配列を、以下に示す。
HamRz:
5’-UUGUAGCCGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUAUAGGAAAGGAAUUCCUAUAGUCAGCGCUACAACAAA-3’(配列番号2)
HDVRz:
5’-GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACACCAUUGCACUCCGGUGGCGAAUGGGAC-3’
(配列番号3)

【0040】
(c)プロモーター配列
本発明における(c)プロモーター配列としては、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列、RNAポリメラーゼI系プロモーター配列、T7ポリメラーゼ系プロモーター配列が挙げられるが、中でもRNAポリメラーゼII系のプロモーター配列が好ましい。RNAポリメラーゼII系のプロモーターとしては、CMVプロモーター、CAGGSプロモーターが挙げられる。中でも、CAGGSプロモーターが特に好ましい。このようなプロモーター配列は、例えば、J.A. Sawicki, R.J. Morris, B. Monks, K. Sakai, J. Miyazaki, A composite CMV-IE enhancer/b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium, Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。

【0041】
本発明の好ましい態様においては、(a)組換えウイルスRNAのcDNA(組換えBDVゲノムのcDNA)の上流に(b1)ハンマーヘッドリボザイムをコードするcDNAが配置され、かつ、該(a)の下流に(b2)δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするcDNA配列が配置されている。また、(a)及び(b)が(c)RNAポリメラーゼII系のプロモーターの下流に配置されている。

【0042】
(d)その他の塩基配列
本発明のウイルスベクターは、SV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列の1部又は全部の配列を含むことができる。また、ウイルスベクターがSV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列の1部又は全部の配列を含む場合には、該配列は(a)及び(b)の下流に配置されていることが好ましい。SV40ウイルスDNAの複製開始点/プロモーター領域配列の一部としては、SV40複製開始点/プロモーター領域内の5’側の113塩基からなる断片が好適である。
SV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列(配列番号4)は、例えば、D.A. Dean, B.S. Dean, S. Muller, L.C. Smith, Sequence requirements for plasmid nuclear import, Exp. Cell. Res. 253 (1999) 713-722等に記載されている。

【0043】
本発明のウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、さらに、蛋白質の発現に有利である1又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター(例えばトランス作用因子)、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする1又は複数の核酸配列も含み得る。また、本発明のウイルスベクターは、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。

【0044】
本発明のウイルスベクターは、線状DNAであっても環状DNAであってもよいが、細胞に導入する際には環状であることが好ましい。環状のウイルスベクターとしては、例えば、本発明のウイルスベクターの必須の配列である上記(a)、(b)及び(c)のDNA、並びに必要に応じて含まれる上記(d)のDNAが、上述した所定の順番で、市販のプラスミドベクター中に配置されているもの等が挙げられる。市販のプラスミドベクターとしては、ウイルスベクターを導入する細胞内で自己複製可能なものであればよく、例えば、pBluescript SKII(-)、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。

【0045】
2.ウイルスベクターの作製方法
本発明のウイルスベクターの作製方法としては特に限定されず、自体公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。例えば、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法において、CAT遺伝子をBDVのゲノム配列に置き換え、さらにP遺伝子の下流に連結する非翻訳領域(P遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域)内に目的とする外来性遺伝子を挿入することによって、本発明の自己複製型(持続感染型)のウイルスベクターを作製することができる。上記方法により作製されるウイルスベクターは、(a)組換えウイルスRNAのcDNAとして、BDVゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNA(例えば、図3に模式的に示される構造を有する組換えウイルスのcDNA)を有するものである。

【0046】
G遺伝子欠損型ウイルスベクター、並びにG遺伝子及びM遺伝子欠損型ウイルスベクターは、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて、例えば、(a)組換えウイルスRNAのcDNAとして、BDVゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNA(例えば図3に模式的に示される構造を有する(a)組換えウイルスRNAのcDNA)を有する自己複製型ウイルスベクターを鋳型として、PCR等によりG遺伝子に欠損変異等を挿入することにより本発明におけるG遺伝子欠損型ウイルスベクターを作製することができる。G遺伝子欠損型ウイルスベクターの作製において、好ましくは、L遺伝子のイントロン部分も同様にPCRにより削りとり、本発明におけるより好ましいG遺伝子欠損型ウイルスベクターを作製することができる。G遺伝子及びM遺伝子欠損型ウイルスベクターも同様に、G遺伝子欠損型ウイルスベクターを鋳型にPCR等によりM遺伝子を欠損させることにより作製できる。

【0047】
ウイルスベクターが線状の場合には、上記環状のウイルスベクターを、(a)組換えBDVゲノムのcDNA領域、(c)プロモーター配列の領域、及びその他蛋白質発現に必要なシグナル配列領域以外の領域で1箇所切断する制限酵素を該ベクターの種類にあわせて適宜選択し、該制限酵素により環状のウイルスベクターを切断することにより線状のウイルスベクターを作製することができる。

【0048】
本発明のウイルスベクターに含まれる外来性遺伝子を目的細胞に導入する方法としては、該ウイルスベクターを後述するヘルパープラスミドと共に目的細胞に導入する方法、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを目的細胞に感染させる方法があるが、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを用いる方法が好ましい。本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、野生型BDVゲノムの代わりに上記ウイルスベクターにコードされるRNAを有する組換え型BDVである。

【0049】
3.組換えウイルス
上記ウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルスも、本発明の1つである。好ましくは、ウイルスベクターにコードされるRNA、並びにBDVのN蛋白質、BDVのP蛋白質及びBDVのL蛋白質を含む組換えウイルスである。本発明の組換えウイルスは、上記組換えBDVゲノムを含むことにより、細胞に感染後、持続的に外来性遺伝子を発現することができる持続感染型の組換えウイルスである。組換えウイルスは、所望によりBDVのG蛋白質又は他のウイルスの外殻蛋白質を有していてもよく、さらに、BDVのM蛋白質を有していてもよい。本発明における外殻遺伝子は、ウイルスの外殻蛋白質をコードする遺伝子である。BDVでは、外殻蛋白質をコードする遺伝子は、G遺伝子である。

【0050】
本発明の組換えウイルスは、例えば、上記ウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてBDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、及び該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含む方法により作製することができる。このような組換えウイルスの作製方法も、本発明の1つである。このような方法により、in vitroで組換えウイルスを産生することができる。ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入するin vitroの細胞は、通常、培養細胞である。

【0051】
本発明の方法において、G遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、ヘルパープラスミドとして、さらに、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入することが好ましい。ウイルスの外殻遺伝子は、外来性遺伝子を導入する目的細胞に応じて適宜選択すればよく、BDVのG遺伝子、BDV以外のウイルスの外殻遺伝子を用いることができる。G遺伝子及びM遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、ヘルパープラスミドとして、さらに、BDVウイルスのM遺伝子を発現するプラスミドを細胞に導入することが好ましい。すなわちG遺伝子及びM遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、上記BDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と共に、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミド及びBDVウイルスのM遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入することが好ましい。

【0052】
ヘルパープラスミドは、BDVのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及びM遺伝子、並びにウイルスの外殻遺伝子それぞれを発現することができるものであればよく、これらの遺伝子の2つ以上が1つのプラスミドに含まれていてもよく、これらの遺伝子がそれぞれ別のプラスミドに含まれていてもよい。例えば、BDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミドとして、下記(1)~(4)のいずれかのプラスミド又はプラスミド群等が好適に用いられる。
(1)BDVのN遺伝子を発現するプラスミド、BDVのP遺伝子を発現するプラスミド及びBDVのL遺伝子を発現するプラスミド
(2)BDVのN遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミド、並びにBDVのL遺伝子を発現するプラスミド
(3)BDVのN遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド、並びにBDVのP遺伝子を発現するプラスミド
(4)BDVのN遺伝子、L遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミド

【0053】
ヘルパープラスミドは、BDVゲノム複製に必要なウイルス蛋白質を提供するものであり、ウイルスベクターと共にヘルパープラスミドを細胞に導入することにより、感染性のある組換えウイルスを産生することができる。ヘルパープラスミドにおけるBDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現する上記(1)~(4)のいずれかのプラスミド(群)としては、(1)~(3)のいずれかのプラスミド群が好ましい。また、本発明の組換えウイルスの作製方法に用いられるウイルスベクター及びその好ましい態様としては、上述したのと同様である。

【0054】
本発明におけるヘルパープラスミドは、上記ウイルスベクターと共に細胞に導入された際に、該細胞内でBDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現することができるものであればよい。例えば、BDVのN遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVのN遺伝子のcDNAが配置されたプラスミドが好ましい。BDVのP遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVのP遺伝子のcDNAが配置されたプラスミドが好ましい。BDVのL遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVのL遺伝子のcDNAが配置されたプラスミドを用いることが好ましい。

【0055】
BDVのN遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVのN遺伝子のcDNA及びP遺伝子のcDNAがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。BDVのN遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVのN遺伝子のcDNA及びP遺伝子のcDNAがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。BDVのN遺伝子、L遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVのN遺伝子のcDNA、L遺伝子のcDNA及びP遺伝子のcDNAがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。

【0056】
ウイルスベクターがG遺伝子欠損型ウイルスベクターの場合には、ヘルパープラスミドは、該G遺伝子欠損型ウイルスベクターと共に細胞に導入された際に、該細胞内でBDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子並びにウイルスの外殻遺伝子を発現することができるものであればよい。ウイルスベクターがG遺伝子及びM遺伝子欠損型ウイルスベクターの場合には、ヘルパープラスミドは、細胞内でさらに、BDVのM遺伝子を発現することができるものであればよい。

【0057】
ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミド及びBDVのM遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、上記(1)~(4)のいずれかのプラスミド(群)と共に用いることができる。さらに、外殻遺伝子を発現するプラスミドとして、BDVのN遺伝子、L遺伝子及びP遺伝子からなる群より選択される1種以上の遺伝子、並びにウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いることもできる。外殻遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流に外殻遺伝子のcDNAが配置されたプラスミドが好ましい。

【0058】
BDVのG遺伝子等の外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質は、通常膜貫通型蛋白質であり、そのアミノ酸配列中に、細胞外に位置する領域(細胞外配列)、細胞膜貫通領域(細胞膜貫通配列)、及び細胞内に位置する領域(細胞内配列)を含む。ヘルパープラスミドにおける外殻遺伝子は、BDVのG遺伝子でもよく、例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス等の宿主細胞膜を外殻として利用する全てのエンベロープウイルスの外殻遺伝子を使用できるが、細胞内配列として、BDVのG蛋白質の細胞内配列をコードしていることが好ましい。すなわち本発明における外殻遺伝子は、細胞内配列としてBDVのG蛋白質の細胞内配列を有し、任意のウイルス(BDV又はBDV以外のウイルス)の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列を有する蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。細胞内配列としてBDVのG蛋白質の細胞内配列を有することにより、組換えウイルス産生効率が向上する。例えば、ヘルパープラスミドにおいてBDV以外のウイルスの外殻遺伝子を用いる場合には、該外殻遺伝子において、細胞内配列をコードする遺伝子配列を、公知の遺伝子工学的手法によりBDVのG蛋白質の細胞内配列をコードする配列に置換して用いることが好ましい。
BDV以外のウイルスの細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする外殻遺伝子をヘルパープラスミドに用いると、遺伝子が由来するウイルスの種類により、産生されるウイルスの細胞指向性を変化させることができる。例えば、上皮系、呼吸器系細胞等に組換えウイルスを感染させる場合には、上皮系、呼吸器系細胞等への指向性が高いウイルス(例えば麻疹ウイルス、センダイウイルス、水疱性口内炎ウイルス等)の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつBDVのG蛋白質の細胞内配列をコードする、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いることが好ましい。

【0059】
M遺伝子を発現するプラスミドとして、BDVのN遺伝子、L遺伝子、P遺伝子及びウイルスの外殻遺伝子からなる群より選択される1種以上の遺伝子、並びにBDVのM遺伝子を発現するプラスミドを用いることもできる。M遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVのM遺伝子のcDNAが配置されたプラスミドが好ましい。

【0060】
BDVのN遺伝子のcDNA、P遺伝子のcDNA及びL遺伝子のcDNAは、BDVのN遺伝子、P遺伝子、及びL遺伝子それぞれの配列情報に基づいて調製することができる。BDVのM遺伝子のcDNA及びG遺伝子のcDNAは、BDVのM遺伝子及びG遺伝子それぞれの配列情報に基づいて調製することができる。例えば、RNAから、配列逆転酵素を使用してcDNAを調製することができる。また、RNAの配列に基づき、DNA合成機を用いて化学合成することができる。

【0061】
BDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子、並びにM遺伝子及びG遺伝子としては、例えば、上述したCubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)に記載されている配列の遺伝子を用いることができる。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したRNAを使用することもできる。さらに、BDVのN、P、L、M及びG蛋白質間それぞれで保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション、PCR法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のBDVのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、M遺伝子及びG遺伝子それぞれの配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートRT-PCRによって断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法により塩基配列を決定することができる。さらに、本発明におけるBDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子、並びにM遺伝子及びG遺伝子は、該遺伝子にコードされる蛋白質がそれぞれBDVのN蛋白質、P蛋白質及びL蛋白質、並びにM遺伝子及びG蛋白質の機能を保持している限り、塩基配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、1乃至数個(1~5個、好ましくは1~3個、さらに好ましくは1~2個)であってよい。

【0062】
このようなN遺伝子として、例えば、BDVのN遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつN蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるBDVのN遺伝子として使用できる。また、BDVのP遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつP蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるBDVのP遺伝子として使用できる。BDVのL遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつL蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるBDVのL遺伝子として使用できる。BDVのG遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつG蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるBDVのG遺伝子として使用できる。BDVのM遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつM蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるBDVのM遺伝子として使用できる。配列同一性は、CLUSTAL W ,GCG program, GENETYX,BLAST searchにより決定される。

【0063】
水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス等のBDV以外のウイルスの外殻遺伝子として、例えば、水疱性口内炎ウイルスはGeneBank,No:J02428.1、狂犬病ウイルスはGeneBank,No:AB044824.1に記載されている配列の遺伝子等を用いることができる。好ましくは、これらの外殻遺伝子中の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする配列を用いる。外殻遺伝子中の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする配列は、Garry RF. Proteomics computational analyses suggest that the bornavirus glycoprotein is a class III viral fusion protein (γ penetrene). Virol J. 145(6),Sep-18(2009)等に記載されている。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したRNAを使用することもできる。さらに、このような外殻遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつ外殻蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるウイルスの外殻遺伝子として使用できる。

【0064】
ヘルパープラスミドは、細胞に導入する際には線状であっても問題はないが、環状であることが好ましい。環状のヘルパープラスミドは、例えば、本発明におけるヘルパープラスミドの必須の配列であるプロモーター配列及び蛋白質のcDNAが配置された形態で、蛋白質の発現に有利である1又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター(例えばトランス作用因子)、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする1又は複数の核酸配列も含み得る。また、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。ヘルパープラスミドは、該ヘルパープラスミドを導入する細胞内で自己複製可能な市販のプラスミドベクターを使用して構築するのが好ましく、市販のプラスミドベクターとしては、例えば、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。ヘルパープラスミドにおけるプロモーター配列は、RNAポリメラーゼII系のプロモーターが好ましい。

【0065】
これらのヘルパープラスミドは、自体公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、BDVのN遺伝子を発現するプラスミド、BDVのP遺伝子を発現するプラスミド及びBDVのL遺伝子を発現するプラスミドは、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法により作製することができる。

【0066】
BDVのN遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、BDVのN遺伝子を発現するプラスミドのN遺伝子のcDNAの下流のユニークな制限酵素配列領域から、N遺伝子のcDNAやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにBDVのP遺伝子のcDNAを挿入することで作製することができる。BDVのN遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、BDVのN遺伝子を発現するプラスミドのN遺伝子のcDNAの下流のユニークな制限酵素配列領域から、N遺伝子のcDNAやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにBDVのL遺伝子のcDNAを挿入することで作製することができる。ただし、N遺伝子のcDNA領域とL遺伝子又はP遺伝子のcDNAが挿入された領域との間の領域にL遺伝子又はP遺伝子の発現を促進するようなプロモーター配列や配列内部リボソーム進入部位などの配列を挿入することも可能である。

【0067】
BDVのG遺伝子を発現するプラスミドは、BDVのN遺伝子、L遺伝子又はP遺伝子を発現するヘルパープラスミドの作製において、BDVのN遺伝子のcDNAの代わりにBDVのG遺伝子のcDNAを用いることによって作製することができる。例えば、一例として、実施例7及び図21に示される方法に従っても作製することができる。BDVのM遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、pEF4/myc-His A、B,and C(Invitrogen)に添付の説明書に記載されている方法に従って作製することができる。

【0068】
BDV以外のウイルスの外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつBDVのG蛋白質の細胞内配列をコードする外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドは、例えば、BDV以外のウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを鋳型に、適当なプライマーを用いてPCRを行なって、任意のウイルス外殻遺伝子の細胞内配列をコードする配列をBDVのG蛋白質の細胞内配列をコードする配列で置換することにより作製することができる。このようなヘルパープラスミドは、例えば、一例として実施例8及び図25に記載されている方法に従っても調製することができる。BDVのG蛋白質の細胞内配列をコードする遺伝子配列は、例えば配列番号1にそのcDNA配列が示されるBDVゲノムでは3712~3747番目の配列(配列番号1の3712~3747番目の塩基)である。

【0069】
上記のウイルスベクターを細胞に導入する際は、例えば、該ウイルスベクターを含むベクター組成物を用いることができる。ベクター組成物は、ウイルスベクター以外にヘルパープラスミドを含んでいてもよい。ベクター組成物は、ウイルスベクター及びヘルパープラスミド以外にも、導入方法及び導入対象等に応じて、その他の成分、例えば、適当な緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養標準液等を含んでいてもよい。

【0070】
ベクター組成物中の上記ウイルスベクターの含有量としては、感染方法及び感染対象等に応じて適宜選択すればよいが、例えば、DNA濃度として約0.25~2.0μg/μLのウイルスベクターを含むことが好ましい。

【0071】
ベクター組成物中の例えば、各ヘルパープラスミドの含有量としては、上記ウイルスベクター1μgに対して約0.0125~0.125μgとすることが好ましい。

【0072】
上記ウイルスベクター及びヘルパープラスミドをin vitroで細胞に導入する方法としては特に限定されず、例えば、市販のトランスフェクション試薬を用いる自体公知の方法を採用することができる。市販のトランスフェクション試薬としては、例えば、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics(登録商標)、Pleasanton、CA)等が挙げられるが特に限定されない。具体的には、例えば、上記量のウイルスベクター及びヘルパープラスミド、並びに緩衝液等を含むベクター組成物に、市販のトランスフェクション試薬を適量加え、これをウイルスベクター1μgに対して通常約10~10個、好ましくは約10~10個の細胞に加えることによりウイルスベクター及びヘルパープラスミドを該細胞に導入することができる。なお、ウイルスベクター及びヘルパープラスミドは、同時に細胞に導入してもよく、別々に導入してもよい。別々に導入する際の導入順序は、特に限定されない。

【0073】
ウイルスベクターを導入する細胞としては、ウイルスベクターの導入により本発明における組換えウイルスを産生することができる哺乳類の培養細胞等であればよいが、例えば、ヒト腎臓由来の293T細胞、BHK細胞が挙げられる。

【0074】
G遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドに用いた外殻遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、293T細胞、BHK細胞等の細胞に、外殻遺伝子を発現する各種プラスミドを用いて、該外殻遺伝子を導入することにより作製することができる。外殻遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に記載された方法に従って、該プラスミド内に該外殻遺伝子を導入することにより製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミドとして、上述した外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドも好適に用いることができる。G遺伝子及びM遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、BDVのM遺伝子及び外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドに用いた外殻遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、293T細胞、BHK細胞等の細胞に同様の方法でBDVのM遺伝子及び該外殻遺伝子を導入することにより製造される。外殻遺伝子を発現するプラスミド及びBDVのM遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に従って、該プラスミド内に外殻遺伝子及びBDVのM遺伝子をそれぞれ導入することにより容易に製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミド及びBDVのM遺伝子を発現するプラスミドとして、上述した外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミド、BDVのM遺伝子を発現するヘルパープラスミド等も好適に用いることができる。

【0075】
次いで、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる。組換えウイルスを産生させるための培地、培養温度及び培養時間等の培養条件は、細胞の種類により適宜設定すればよい。培養温度は、293T細胞又はBHK細胞を用いる場合は、通常約36~37℃とする。培地は、ダルベッコ変法イーグルMEM培地を用いることが好ましい。培養時間は、通常約24~96時間、好ましくは約36~48時間とする。

【0076】
上記培養により、ウイルスベクターを導入した細胞においてウイルスベクターにコードされるRNA、並びにBDVのN蛋白質、P蛋白質及びL蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。ウイルスベクターの導入において、さらにウイルスの外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた場合には、ウイルスベクターにコードされるRNA、並びにBDVのN蛋白質、P蛋白質及びL蛋白質に加えて、該外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。ウイルスベクターの導入において、さらにウイルスの外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミド及びBDVのM遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた場合には、ウイルスベクターにコードされるRNA、並びにBDVのN蛋白質、P蛋白質及びL蛋白質に加えて、該外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質及びBDVのM蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。

【0077】
ウイルスベクターを導入した細胞において組換えウイルスが産生されたことは、例えば、細胞を培養した培地の上澄みを遠心分離などにより回収し、該上澄みを用いてBDVが感染性を有する細胞、例えば、サル腎由来Vero細胞、ラットグリア由来C6細胞、ヒトグリア由来OL細胞などに感染をさせることで確認される。組換えウイルスが産生されたことの確認は、後述する組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なった後行ってもよい。
例えば、組換えウイルスであることは、感染した細胞内での外来性遺伝子(例えばGFPなど)の発現を定量解析することで確認できる。産生されたウイルスが持続性感染型であることは、感染した細胞内での外来性遺伝子(例えばGFPなど)の発現を定量解析すると共に、その培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることを調べることにより確認される。培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることは、例えば、その上清を遠心分離などにより回収し、これをさらに他の細胞へ感染させ、該細胞において組換えウイルスに由来する外来性遺伝子が発現することを調べることで確認できる。

【0078】
本発明の作製方法においては、上記のように細胞にウイルスベクター等を導入して組換えウイルスを産生させた後、効率よく組換えウイルスを増殖させるために、該組換えウイルスを産生した細胞(例えば、293T細胞、BHK細胞)を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なうことが好ましい。組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養することにより、感染性を持つ組換えウイルスは増殖速度が速い細胞に感染する。該増殖速度が速い細胞を培養すると、細胞の増殖と共に感染したウイルスも増殖するため、組換えウイルスを効率よく増殖させることができる。増殖速度が速い細胞としては、例えば、Vero細胞等が好適である。組換えウイルスを産生した細胞と、増殖速度の速い細胞との混合比率としては、例えば、組換えウイルスを産生した細胞1個に対して増殖速度の速い細胞を通常0.1~10個程度、好ましくは0.2~2個程度とする。混合培養後、増殖速度が速い細胞を培養させる条件としては特に限定されず、例えば、Vero細胞を用いる場合には、培養温度を通常約36~37℃とし、ダルベッコ変法イーグルMEM培地で通常3日~5週間程度、好ましくは3日~3週間程度培養を行なう。

【0079】
G遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いた場合には、増殖速度が速い細胞として、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドに用いた外殻遺伝子を、恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、Vero細胞等の細胞に、外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いて、該遺伝子を導入することにより作製することができる。さらに、G遺伝子及びM遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いた場合には、増殖速度が速い細胞として、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた外殻遺伝子及びBDVのM遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、Vero細胞等に、外殻遺伝子を発現するプラスミドおよびBDVのM遺伝子を発現するプラスミドを用いて、該遺伝子を導入することにより作製することができる。外殻遺伝子を発現するプラスミド及びBDVのM遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に従って、該プラスミド内に外殻遺伝子及びBDVのM遺伝子をそれぞれ導入することにより容易に製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミド及びBDVのM遺伝子を発現するプラスミドとして、上述した外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミド、BDVのM遺伝子を発現するヘルパープラスミド等も好適に用いることができる。

【0080】
本発明の作製方法においては、細胞に組換えウイルスを産生(及び増殖)させた後、該組換えウイルスを精製する工程を行うことが好ましい。精製方法としては特に限定されず、自体公知の方法によって行うことができ、組換えウイルスの感染対象に応じて精製方法を適宜選択すればよい。

【0081】
例えば、組換えウイルスを培養細胞に感染させる場合には、上記のように組換えウイルスを産生(及び増殖)させた後、該組換えウイルスを産生させた培養細胞上清を回収し、細胞を破砕する。細胞の破砕は、例えば、凍結及び融解、又は超音波破砕機を用いて行うことができる。次いで、細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く。細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く方法としては、遠心分離(例えば、4℃、800gで10分間程度)等が挙げられる。細胞の破砕成分を取り除いた後に、0.22又は0.45μmのポアサイズを有する濾過膜を通すことにより組換えウイルスを含む上澄みを得ることができる。培養細胞に組換えウイルスを感染させる際は、この上澄みを用いることができる。また、この組換えウイルスを含む上澄みを公知の手法により濃縮して用いることもできる。
生体細胞(動物個体中の細胞)に組換えウイルスを感染させる場合には、この組換えウイルスを含む上清を、超遠心機を用いて濃度勾配による超遠心を行なうことによりウイルス粒子へと高度の精製を行うことが好ましい。精製を行ったウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、希釈を行った後に適量を動物へ感染させる。

【0082】
4.外来性遺伝子の導入方法
上記組換えウイルスを細胞に感染させることにより、該ウイルスに組み込まれた外来性遺伝子を細胞や生体に導入することができる。このような、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスをin vitroの細胞又は動物に感染させる工程を含む外来性遺伝子の導入方法も本発明の1つである。

【0083】
組換えウイルスを感染させる動物としては特に限定されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類等が挙げられる。中でも、ヒト、サル、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、ネズミ、ウサギ、ウシ等の哺乳類が好ましく、ラット、マウス又はヒトがより好ましく、マウス又はヒトがさらに好ましい。組換えウイルスを感染させる細胞としては、このような動物の細胞が好ましい。また、BDVは神経系細胞に感染指向性があることから、哺乳類の神経系細胞がさらに好ましく、中でも、脳神経系細胞が特に好ましい。中でも、ラット、マウス又はヒトの神経系細胞が好ましい。細胞は、培養細胞であってもよく、生体細胞であってもよい。哺乳類の脳神経系細胞としては、グリア細胞、大脳皮質の神経細胞、海馬神経細胞、小脳神経細胞、中脳神経細胞胞等が挙げられる。哺乳類の脳神経細胞の培養細胞としては、OL、C6、U373、N2a、N18、PC12、SK-N-SH細胞等が好適である。

【0084】
G遺伝子欠損型ウイルスベクター及びヘルパープラスミドとしてウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いて産生された組換えウイルスは、外殻遺伝子が由来するウイルスの種類に応じた感染指向性を示す。例えば、ヘルパープラスミドにおいてBDVのG遺伝子を使用した場合、得られる組換えウイルスは、脳神経系細胞に感染指向性を示すため、脳神経細胞への外来性遺伝子導入に好適に使用される。ヘルパープラスミドにおいてBDV以外のウイルスの外殻遺伝子(好ましくは、BDV以外のウイルスの外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつBDVのG蛋白質の細胞内配列をコードする外殻遺伝子)を使用した場合、得られる組換えウイルスは、該ウイルスが感染指向性を示す細胞に好適に感染させることができるものである。

【0085】
組換えウイルスをin vitroで細胞に感染させる方法としては、例えば、培養細胞に感染させる場合には、上記精製方法により得られた組換えウイルスを含む上清をダルベッコ変法イーグル等の培養培地又はリン酸緩衝生理食塩水等により段階希釈して希釈液を作製することが好ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度としては、ウイルスを感染させる細胞の種類等により適宜選択すればよいが、例えば、哺乳類の神経細胞等であれば、通常MOI(multiplicity of infection、感染価)約0.01~10(細胞1個に対してウイルス粒子0.01から10個が感染する量)、好ましくはMOI約1~10となるようにする。この希釈液を用いて、組換えウイルスを細胞に感染させる。

【0086】
組換えウイルスを生体細胞(動物)に感染させる際には、上記のように高度に精製されたウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、該リン酸緩衝生理食塩水により希釈を行った後に適量を動物へ感染させることが好ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度は、感染対象により適宜選択すればよい。例えば、感染対象が哺乳類の神経細胞であれば、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価(focus-forming unit (FFU))を約10-1~10FFUとして個体に接種することが好ましい。また、組換えウイルスを含む希釈液は、マウス又はラットに接種する際には、ウイルス力価を通常約10-1~10FFUとすることが好ましい。イヌ又はネコ、ヒトに接種する際には、ウイルス力価を通常約10~10FFUとすることが好ましく、ウシ又はウマに接種する際には、ウイルス力価を通常10~1012FFUとすることが好ましい。ヒトに接種する際には、ウイルス力価を通常約10~10FFUとすることが好ましい。また、組換えウイルスを生体細胞に感染させる際には、後述する外来性遺伝子導入剤も好適に用いることができる。

【0087】
例えば、哺乳類の脳神経系細胞に組換えウイルスを感染させる場合には、上記組換えウイルスを含む希釈液を哺乳類の鼻腔に接種する方法が好適である。また、マウスやラット等に動物実験において脳神経系細胞に感染させる場合には、動物の脳内に組換えウイルスを含む希釈液を直接接種することもできる。
組換えウイルスの接種量としては、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液を、鼻腔内接種では1回につき通常約5μL~1mL、脳内接種では1回につき通常約1~50μL接種する。組換えウイルスの動物への接種量は、動物の体重等に応じて適宜選択すればよく、例えば、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液をマウス又はラットに鼻腔内接種する場合には、1回につき通常約5~200μL、好ましくは約10~100μL接種する。

【0088】
脳神経細胞以外の生体細胞に組換えウイルスを感染させる場合には、上記組換えウイルスを含む希釈液を非経口投与することが好ましい。例えば、哺乳類の腹腔内、血管内、筋肉内等に接種する方法等が好適である。
組換えウイルスの接種量としては、接種部位等により適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、通常、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価を約10-1~10FFUとして、この組換えウイルスを含む希釈液を、マウスであれば1回につき通常約5~500μL、好ましくは約20~200μL接種する。

【0089】
5.外来性遺伝子導入剤
(1)上記ウイルスベクター、又は、(2)上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤も、本発明の1つである。好ましい態様としては、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤である。このような外来性遺伝子導入剤は、上述した外来性遺伝子の導入方法において、組換えウイルスをin vitroの細胞又は生体細胞(動物)に感染させる際に好適に用いることができるものである。本発明は、動物の神経系細胞等に外来性遺伝子を導入するのに好適に用いることができる。中でも、脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するのにより好適に用いられる。

【0090】
本発明の外来性遺伝子導入剤の好ましい態様の1つは、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤である。脳神経系細胞としては、哺乳類の脳神経系細胞が好ましく、例えば、グリア細胞、大脳皮質の神経細胞、海馬神経細胞、小脳神経細胞、中脳神経細胞等が挙げられる。本発明の外来性遺伝子導入剤は、さらに、神経疾患治療剤等の他の薬剤等を含んでいてもよく、剤型に応じて医薬上許容される成分を含んでいてもよい。本発明の外来性遺伝子導入剤の剤型としては、非経口投与のための剤型が好ましく、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤、噴霧剤、スプレー剤等が挙げられるが、注射剤が好ましい。

【0091】
非経口投与のための注射剤としては、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒(注射用水、精製水等)に、医薬上許容される添加剤を適宜添加した溶液に、組換えウイルスを混合した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。医薬上許容される添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤;リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤;パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤;ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤;亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤;塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のpH調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール;プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール;ポリソルベート80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油50、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。また、例えば、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の蛋白質;アミノデキストラン等のポリサッカリド等を含有してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。

【0092】
本発明の外来性遺伝子導入剤に含まれる組換えウイルスの量は、外来性遺伝子導入剤の製剤形態又は投与経路によって異なるが、通常、最終製剤中に約0.0001~100%の範囲から適宜選択して決定することができる。外来性遺伝子導入剤の投与方法及び投与量は、上述した外来性遺伝子の導入方法における方法及び組換えウイルスの投与量と同様である。本発明の外来性遺伝子導入剤は、例えば、動物の脳神経系疾患治療、C型肝炎等の慢性肝疾患、抗腫瘍薬及びワクチン等のための遺伝子デリバリー用組成物として有用である。本発明の外来性遺伝子導入剤の投与対象は、上述した哺乳動物が好適である。

【0093】
6.ウイルスベクターの利用
本発明のウイルスベクター、組換えウイルス及び外来性遺伝子の導入方法、並びに外来性遺伝子導入剤は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野に応用することができるものである。
例えば、本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、ヒトを含む動物の脳神経系疾患治療のための遺伝子デリバリーベクターとして使用することができる。また、慢性肝疾患、腫瘍、感染症等に対するワクチン等にも好適に使用することができる。
脳神経系疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、統合失調症、自閉症、その他の機能性精神疾患等が挙げられる。本発明の組換えウイルスは、このような疾患の治療又は予防に有用である。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子として、脳神経系疾患の原因となる蛋白質を分解する酵素の遺伝子、該蛋白質の発現を抑制する機能を有する核酸配列等を使用すると、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該原因蛋白質を分解又は該原因蛋白質の発現を抑制して該疾患を予防又は治療することができる。また、脳内物質(例えば、セロトニン、ドーパミン、ソマトスタチン、ネプリライシン等)の分泌低下により発症する疾患においては、該脳内物質をコードする遺伝子をウイルスベクターに挿入し、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該脳内物質が産生されるため、該疾患を予防又は治療することができる。
なお、「治療」とは、病態を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び/又は悪化を抑制し、病態の進行をとどめること、又は病態の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを、「予防」とは病態の発症を防ぐこと、抑制すること又は遅延させることを、それぞれ意味するものとする。

【0094】
本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、日本脳炎等のウイルス性脳炎の治療又は予防にも使用できる。また、実験動物、伴侶動物又は生産動物の脳神経系疾患、例えば、BSE(牛海綿状脳症)、狂犬病等にも好適に使用できる。実験動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ等が挙げられる。伴侶動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ等が挙げられる。生産動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等が挙げられる。

【0095】
本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、脳神経科学領域における神経系細胞の可視化技術に使用することができる。さらに、本発明のウイルスベクターは、機能性RNA分子を発現できるRNAウイルスベクターとしても有用であり、siRNA、miRNA、RNAアプタマー等の機能性RNAの安定発現ベクター技術に応用することもできる。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子としてsiRNA、miRNA、RNAアプタマー等の機能性RNAをコードする配列を用いると、所望の細胞においてこれらの機能性RNA分子を発現させることができる。本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスを用いると、脳内において一本鎖抗体(scFv)を発現させることもできる。

【0096】
また外殻蛋白質を他のウイルス由来のものにすることで、腫瘍細胞に特異的に感染するウイルスベクター又は組換えウイルスに改良し、腫瘍細胞に薬剤遺伝子や過剰に発現した遺伝子を抑えるsiRNAを導入すること等で、抗腫瘍ウイルスベクターとしても利用可能である。さらに、外来性遺伝子としてHIV、インフルエンザウイルス等に対する中和活性をもつ遺伝子(例えば、HIVのenv、gag等;インフルエンザウイルスのHA、NA遺伝子等)等を導入することで、本発明のウイルスベクター又は組換えウイルスを組換えワクチンに利用することも可能である。そして、HCV等の慢性経過をたどる感染症に対しては、標的となるウイルスのゲノムに対するsiRNAを導入することで、機能性RNAを利用した感染症に対する新たな治療法の開発にも有効である。

【0097】
上記ウイルスベクターを含有する外来性遺伝子導入用キットも、本発明の1つである。
本発明のキットは、ウイルスベクター以外に、ヘルパープラスミド、外来性遺伝子を導入する細胞、緩衝液、培地等を適宜含んでもよい。ウイルスベクターの好ましい態様は、上述した通りである。外来性遺伝子を導入する細胞は、脳神経系細胞等の神経系細胞等が好ましい。本発明のキットは、これまで技術的に困難であった脳神経系細胞等への外来性遺伝子の導入に好適に用いることができるものである。
【実施例】
【0098】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【0099】
<実施例1>
1.プラスミドpCAG-Fctの作製
Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529に記載されているプラスミドpCAG-HR-SV3を基に、その中に挿入されているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子の領域をボルナ病ウイルスのHe/80株のゲノムの配列(配列番号1)に置き換えたプラスミドを以下のようにして作製した。
【実施例】
【0100】
サイトメガウイルス(CMV)由来のBDVミニゲノムベクター(pCMV-HR)を得るために、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)をコードする化学合成オリゴヌクレオチド(Briese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1992) 11486-11489、及びLe Mercier et al., J. Virol., 76 (2002) 2024-2027)及びBDVの5’非翻訳領域(UTR)配列をコードする化学合成オリゴヌクレオチド(Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C., Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994))をアニールし、ベクターpcDNA3(Invitrogen社、San Diego, CA)のKpnI及びXhoIサイトに連結した。得られたプラスミドをEco47III及びXbaIサイトで切断した。このプラスミドに、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HdRz)と融合させたBDVの3’UTRと、BDV He/80株のゲノムをコードするcDNAクローンを挿入してプラスミドpc-HRを得た。なお、HdRzと融合させたBDVの3’UTRは、プラスミドphuPol I-MG(Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104)から増幅した。最後に、pc-HRのBglII及びXbaI断片をpBluescript SKII(-)(Stratagene, La Jolla, CA)のBamHI及びXbaIサイトに挿入することによって、pCMV-HRを作製した。
【実施例】
【0101】
CAG(Chicken β-actin promoterとCMV enhancerとの複合体)由来のBDVミニゲノムベクターpCAG-HRは、CAGプロモーターをpBluescript SKII(-)(Stratagene, La Jolla, CA)にサブクローニングすることによって得た(pBS-CAG)。CAGプロモーターは、サイトメガロウイルスIEエンハンサーにニワトリβ-アクチンプロモーターが融合してなるハイブリッドプロモーターであり、Sawichi et al., Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。pCMV-HRのHamRzとHdRzの配列にまたがる領域をPCRによって増幅し、pBS-CAGのSalI及びEcoRIサイトの平滑末端に挿入した。
【実施例】
【0102】
次に、SV40開始点/プロモーター内の5’側の113塩基からなる断片(SV3領域)を、PCR(Clontech Laboratory, Inc., Palo Alto, CA)によってpEGFP-N1(Clontech社製)から増幅し、pCAG-HRのNotIサイトに挿入した。これにより、プラスミドpCAG-Fctを得た。
【実施例】
【0103】
2.P遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域にGFPを挿入したBDVゲノムプラスミド(pCAG-Fct-P/MGFP)の作製
P遺伝子とM遺伝子の間の非翻訳領域に外来遺伝子挿入カセットを挿入し、プラスミドpCAG-Fct-P/Mを作製した。
A)実施例1で作製したpCAG-Fct(ボルナウイルスのHe80株のcDNA(配列番号1)がクローニングされているプラスミド)を鋳型に、EcoT22IからBst1107Iサイトまでの領域をプライマー1及び4、並びにプライマー2及び3を用いてそれぞれPCRで増幅した。その後、両方のPCR産物を0.5μLずつ混合し、プライマー1及び2にて再度増幅し、P-M遺伝子間にBstBIサイト及びPacIサイトを有する外来遺伝子挿入カセットを作製した。
B)A)のPCR産物をEcoT22I及びBst1107Iを用いてpCAG-Fctへと組込み、pCAG-Fct-P/Mを完成させた。
C)BstBIとPacIを用いてGFPを挿入し、プラスミドpCAG-Fct-P/M-GFPを完成させた。
(プライマー)
プライマー1:5-GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC-3(配列番号5)
プライマー2:5-AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG-3(配列番号6)
プライマー3:5-ttcgaaGGTTGGttaattaaccataaaaaaatcgaatcacc-3(配列番号7)
プライマー4:5-ttaattaaCCAACCttcgaaGGTGATTCGATTTTTTTATGG-3(配列番号8)
【実施例】
【0104】
3.ヘルパープラスミドの作製
ヘルパープラスミド、すなわちBDVのN遺伝子発現プラスミド(pcN)、BDVのP遺伝子発現プラスミド(pCXN2-P)及びBDVのL遺伝子発現プラスミド(pcL)を以下の手順で作製した。
pcNは、pHA-p40Nプラスミド(Kobayashi T, Watanabe M, Kamitani W, Zhang G, Tomonaga K and Ikuta K. Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling. J. Virol. 75:3404-3412. (2001)からN遺伝子領域をPCRで増幅し、pBS-CAG(上述)へと挿入することで作製した。
プラスミドpCXN2-Pは、pcD-P(Zhang G, Kobayashi T, Kamitani W, Komoto S, Yamashita M, Baba S, Yanai H, Ikuta K and Tomonaga K. Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1. J. Virol. 77:12243-12251. (2003))からゲル抽出した断片をpCXN2(Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J 1991 Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-199)のEcoRI及びXhoIサイトに挿入することによって作製した。
pcLについては、Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104に記載されている方法で作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、DNAシークエンスによって確認した。
【実施例】
【0105】
<参考例1>
U. Schneider et al., Journal of Virology (2007) p.7293-7296に記載の方法に従って、BDVゲノムの5’末端側の非翻訳領域にGFP遺伝子を挿入した組換えウイルスベクターを作製した。この組換えウイルスベクター(rBDV-5’GFP)の構造を、図4に模式的に示す。
【実施例】
【0106】
<実施例2>
P-M遺伝子間プラスミドを用いたBDVベクターの作製と性状比較
pCAG-Fct-P/M-GFP及びヘルパープラスミド(N遺伝子発現プラスミド、P遺伝子発現プラスミド及びL遺伝子発現プラスミド;それぞれpcN、pCXN2-P及びpcL)を、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics(登録商標)、Pleasanton、CA)又Lipofectamine(登録商標)2000、Invitrogen)を用いて293T細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、10~10の細胞(293T細胞)に対して、pCAG-Fct-P/M-GFPを1~4μg使用し、pcN(0.125~0.5μg)、pCXN2-P(0.0125~0.05μg)、pcL(0.125~0.5μg)の割合でヘルパープラスミドを加えた。
【実施例】
【0107】
ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入後、293T細胞を37℃で48時間ダルベッコ変法イーグル培地で培養後に上清を回収して、800gで10分遠心後、0.22から0.45μmのフィルタで濾過してGFPを発現する組換えウイルス(以下、組換えウイルスp/mGFPともいう)を精製した。
【実施例】
【0108】
比較として、参考例1で作製したベクターrBDV-5’GFPについても、上記と同様にして該ベクターを293T細胞に導入して組換えウイルス(以下、組換えウイルス5’GFPともいう)を作製し、次いで組換えウイルスを精製した。コントロールとして、野生型のBDV(以下、wtともいう)を293T細胞に導入した。
【実施例】
【0109】
培養細胞への感染後、48時間以降における細胞間での感染の広がり、並びに感染細胞上清中へのウイルスの放出を、間接免疫蛍光抗体法又はウェスタンブロット法により調べたところ、組換えウイルスp/mGFP及び5’GFP、並びにwtのいずれについても、感染後24時間後よりウイルスの産生が観察され始めることが確認された。
【実施例】
【0110】
また、野生型のBDV(wt)、精製した組換えウイルスp/mGFP及び5’GFPをそれぞれ、M.O.I=0.01でVero細胞に感染させて、感染後0日から19日における細胞間での感染の広がりを、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法又は間接免疫蛍光抗体法により調べた。結果を図5~8に示す。
【実施例】
【0111】
間接免疫蛍光抗体法は、以下の方法により行った。
抗BDV N抗体及び抗BDV M抗体を、Watanabe M, Zhong Q, Kobayashi T, Kamitani W, Tomonaga K, Ikuta K. Molecular ratio between Borna disease viral-p40 and -p24 proteins in infected cells determined by quantitative antigen capture ELISA. Microbiol Immunol. 2000. 44:765-72、Chase G, Mayer D, Hildebrand A, Frank R, Hayashi Y, Tomonaga K, Schwemmle M. Borna disease virus matrix protein is an integral component of the viral ribonucleoprotein complex that does not interfere with polymerase activity. J Virol. 2007. 81:743-749に記載の方法に従って作製した。
野生型BDV並びに各組換えウイルスをそれぞれ感染させたVero細胞を、感染後の一定の日数培養した後回収し、ガラスプレートに固定した後、これと、抗BDV N抗体(リン酸緩衝液で、抗BDV N抗体濃度0.2~5μg/mLに希釈したもの)又は抗BDV M抗体(リン酸緩衝液で、抗BDV M抗体濃度0.2~5μg/mLに希釈したもの)を37℃で1時間程度反応させた。洗浄後、2次抗体として蛍光標識された抗IgG抗体(モリキュラープローブ社製、リン酸緩衝液で、抗体濃度0.01~0.1μg/mLに希釈したもの)と同様に反応させた後に、細胞の蛍光(抗N抗体又はM抗体:赤、GFP:緑)を蛍光顕微鏡で観察した。
ノーザンブロット法及びウェスタンブロット法は、Watanabe Y, Ibrahim MS, Hagiwara K, Okamoto M, Kamitani W, Yanai H, Ohtaki N, Hayashi Y, Taniyama H, Ikuta K, Tomonaga K. Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility. Microbes Infect. 2007. 9:417-427.に記載の方法に従って行った。
【実施例】
【0112】
図5は、感染後0日~19日の間の、野生型又は組換えBDVを感染させたVero細胞の、感染率の経時変化を調べた結果を示す図である。図5に示す感染率は、野生型BDVについては、抗BDV N抗体に対する蛍光標識抗体の蛍光を指標とする間接免疫蛍光抗体法により、組換えBDVについては、GFPの蛍光及び抗BDV N抗体に対する蛍光標識抗体の蛍光を指標とする間接免疫蛍光抗体法により、それぞれ求めた。図5において、wt(ひし形:◆)は野生型BDVを、p/mGFP(四角:■)は組換えウイルスp/mGFPを、5’GFP(三角:▲)は、参考例1で作製した組換えウイルス5’GFPを、それぞれ示す。図5より、感染から約15日後には、組換えウイルスp/mGFP及び5’GFPのいずれも、野生型BDVと同様に、Vero細胞にほぼ100%感染した。このことから、組換えウイルスp/mGFP及び5’GFPのいずれも、野生型BDVと同様のウイルス産生能を有することが分かった。
【実施例】
【0113】
図6は、ノーザンブロットの結果である。図6中、wtは野生型BDVを、p/mは、組換えウイルスp/mGFPを、5’は、組換えウイルス5’GFPを、それぞれ示す。u.i.は、非感染細胞を示す。
図6(a)は、感染後19日後のVero細胞におけるBDVのN遺伝子(上の図)及びGFP遺伝子(中の図)の発現量をノーザンブロットによって調べた結果を示す図である。図6(a)より、ウイルス蛋白質(N蛋白質)の遺伝子は、いずれのBDVを感染させた細胞においても同程度に発現していることが分かる。一方、組換えウイルスp/mGFPを感染させた細胞における、感染したウイルスに対する外来性遺伝子(GFP遺伝子)の発現率は、GFP遺伝子/N遺伝子=0.78であり、組換えウイルス5’GFPを感染させた細胞においては、GFP遺伝子/N遺伝子=0.45であった。感染したウイルスに対するGFP遺伝子の発現率は、組換えウイルスp/mGFPにおいて組換えウイルス5’GFPと比較して約2倍も多いことが分かる。図6(a)の下図は、解析に使用したRNA量を定量するために、サンプル中に含まれるリボゾームRNAを電気泳動後、可視化したものである。
【実施例】
【0114】
図6(b)は、感染後19日後のVero細胞におけるBDVのN蛋白質(最上段)、P蛋白質(上から2段目)、M蛋白質(上から3段目)及びGFP(最下段)の発現量をウェスタンブロットによって調べた結果を示す図である。図6(b)より、ウイルス蛋白質(N蛋白質、P蛋白質、及びM蛋白質)は、いずれのBDVを感染させた細胞おいても同程度に発現していることが分かる。一方、組換えウイルスp/mGFPを感染させた細胞における、感染したウイルスに対する外来性遺伝子(GFP遺伝子)の発現率は、GFP/N蛋白質=0.85であり、組換えウイルス5’GFPを感染させた細胞においては、GFP/N蛋白質=0.58であった。感染したウイルスに対するGFP遺伝子の発現率は、組換えウイルスp/mGFPにおいて組換えウイルス5’GFPと比較して多いことが分かる。
【実施例】
【0115】
図7a~fは、野生型BDV、組換えウイルスp/mGFP及び組換えウイルス5’GFPそれぞれを感染させた細胞の、顕微鏡写真である。図7a及びbは、野生型BDVを感染させた細胞、c及びdは、組換えウイルスp/mGFPを感染させた細胞、e及びfは、組換えウイルス5’GFPを感染させた細胞である。図7a、c及びeは、細胞へのウイルスの感染を、N蛋白質抗体(抗BDV N抗体)及び蛍光標識抗体(モリキュラープローブ社製)を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べた結果である。図7a、c及びeにおいて、発光部分(赤色)がN蛋白質である。図7b、d及びfは、該ウイルスによる外来性遺伝子(GFP)の発現を、該蛋白質の蛍光(緑色の蛍光)によって調べた結果である。図7b、d及びfでは、GFPは緑色の蛍光によって検出される。
図7a~fより、いずれのBDVウイルスを感染させた細胞でもN蛋白質は同程度発現していることから、ウイルスの複製能力は同程度であることがわかる。しかし、GFPの蛍光強度は、組換えウイルス5’GFPよりも組換えウイルスp/mGFPを感染させた細胞で顕著に大きいことから、組換えウイルスp/mGFPは、外来性遺伝子(GFP)の発現効率が組換えウイルス5’GFPより顕著に高いことが分かる。
【実施例】
【0116】
図8a~fは、野生型BDV、組換えウイルスp/mGFP及び組換えウイルス5’GFPそれぞれを感染させた細胞の、顕微鏡写真である。図8a及びbは、野生型BDVを感染させた細胞、c及びdは、組換えウイルスp/mGFPを感染させた細胞、e及びfは、組換えウイルス5’GFPを感染させた細胞である。図8a、c及びeは、細胞へのウイルスの感染を、M蛋白質抗体(抗BDV M抗体)及び蛍光標識抗体(モリキュラープローブ社製)を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べた結果である。図8b、d及びfは、該ウイルスによる外来性遺伝子(GFP)の発現を、該蛋白質の蛍光(緑色の蛍光)によって調べた結果である。図8a、c及びeにおいて、発光部分(赤色)がM蛋白質である。図8b、d及びfでは、GFPは緑色の蛍光によって検出される。
図8a~fより、いずれのBDVウイルスを感染させた細胞でもM蛋白質は同程度発現していることから、ウイルスの複製能力は同程度であることがわかる。しかし、GFPの蛍光強度は、組換えウイルス5’GFPよりも組換えウイルスp/mGFPを感染させた細胞で顕著に大きいことから、組換えウイルスp/mGFPは、外来性遺伝子の発現効率が組換えウイルス5’GFPより顕著に高いことが分かる。
【実施例】
【0117】
<実施例3>
実施例2で作製した組換えウイルスp/mGFP及び参考例1で作製した組換えウイルス5’GFPをそれぞれ、ラットの脳へ感染させた。
精製された各組換えウイルスを、PBS又は培養メディウムで10FFUに希釈後、生後24時間以内の新生仔ラットの頭蓋内に、左側頭部より10~20μL接種した(図9)。接種後、7、14及び21日後に採材を行って、図10に示すように脳を各領域に分割し、各領域についてDNAを抽出し(キアゲン社のDNA抽出キットを用いた)、個別に組換えウイルスの感染をPCRとGFPの発現によりチェックした。PCRは、BDVに特異的なプライマーを用いた。これらのプライマーの配列を以下に示す。
BDV特異的なFowardプライマーの配列;
5- GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC -3 (配列番号9)
BDV特異的なReverseプライマー配列;
5- AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG -3 (配列番号10)
【実施例】
【0118】
PCR産物を1%のアガロース電気泳動法で確認した。この結果、左脳中部にウイルスを接種後7日後のラットにおいて、接種部位に加えて、大脳皮質(図10の右脳の前部)及び小脳部位(図10の右脳の後部)でも組換えウイルスが検出された。図11に、PCR産物を電気泳動した結果を示す。p/mGFPで示されるレーンは、組換えウイルスp/mGFPを感染させたラットの脳のPCR産物である。5’GFPで示されるレーンは、組換えウイルス5’GFPを感染させたラットの脳のPCR産物である。p/mGFP及び5’GFPの各レーンにおいて、aは、大脳皮質、bは、小脳部位のDNAのPCR産物である。なお、図11において検出されるバンドは、いずれも上記PCRで増幅されたBDVゲノム断片のバンドであるが、上記PCRを行なうと、BDVのP遺伝子とM遺伝子との間の領域が増幅される。組換えウイルスp/mGFPにおいては、P遺伝子とM遺伝子との間にGFP遺伝子を含むため、組換えウイルス5’GFPのPCR産物よりも高分子量側にバンドが検出される。なお、図11中のIとは、野生型BDV感染Vero細胞であり、Uは、非感染細胞である。この結果より、接種した組換えウイルスが脳の他の箇所に感染伝播したことが示された。
【実施例】
【0119】
図12に、接種後14日後のラット脳を切開して裏返したマクロ写真(a及びb)、及び該脳のマクロ蛍光写真(c及びd)をそれぞれ示す。図12c及びdにおいて、蛍光部分が発現したGFPである。図12c及びdより、GFPの蛍光強度は、組換えウイルス5’GFPよりも組換えウイルスp/mGFPを感染させた脳の大脳皮質で顕著に大きいことから、組換えウイルスp/mGFPを用いると、外来性遺伝子の発現効率が組換えウイルス5’GFPより顕著に高いことが分かる。
【実施例】
【0120】
図13a~dは、大脳皮質の切片(図13a~dの上部に示す、写真中の四角で示す部分)の顕微鏡写真である。図13a及びcに、接種後7日目のラットの大脳皮質におけるN遺伝子の発現を、実施例2と同様のN蛋白質に対する抗体(抗BDV N抗体)及び蛍光標識抗体(モリキュラープローブ社製)を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べた結果を示す。N蛋白質は、赤色の蛍光によって検出され、組換えウイルスp/mGFP及び組換えウイルス5’GFPのいずれを感染させた場合も、同程度のN蛋白質が発現している(ウイルス感染量は同程度である)ことが分かった。図13b及びdに、図13a及びcとそれぞれ同様の切片について、GFPの発現を蛍光により検出した結果を示す。GFPの蛍光強度は、組換えウイルスp/mGFPを感染させた脳の大脳皮質(図13b)において、組換えウイルス5’GFPを感染させた脳の大脳皮質(図13d)と比較して顕著に大きかった。
【実施例】
【0121】
<実施例4>
実施例1において、GFP遺伝子の代わりにDsRed遺伝子(クローンテック社製)を用いて、P遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域にDsRed遺伝子を挿入した組換えベクター(rBDV-p/mDsRedベクター)を作製し、実施例2と同様にして組換えウイルスを作製した。比較として、参考例1においてGFP遺伝子の代わりにDsRed遺伝子を用いて、BDVゲノムの5’末端にDsRed遺伝子を挿入した組換えベクター(rBDV-5’DsRedベクター)を作製し、実施例2と同様にして組換えウイルスを作製した。培養細胞に各組換えウイルスをそれぞれ感染させた後、10日目における細胞への組換えウイルスの感染及びDsRed遺伝子の発現を、実施例2と同様のN蛋白質に対する抗体(抗BDV N抗体)及び蛍光標識抗体(モリキュラープローブ社製)を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べたところ、rBDV-p/mDsRedベクターから産生された組換えウイルスを感染させた細胞においては、図14に示すようにN蛋白質の発現(図14(a))及びDsRedの発現(図14(b))が観察された(N蛋白質は二次抗体によって緑色の蛍光及びDsRedは赤色の蛍光によって検出された)。一方、rBDV-5’DsRedベクターは、感染細胞において組換えウイルスを産生することができなかった。
【実施例】
【0122】
<実施例5>
実施例1において、GFP遺伝子の代わりにホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子(1.6kb)(クローンテック社製)を用いて、P遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域にルシフェラーゼ遺伝子を挿入した組換えベクター(rBDV-p/mLuciベクター)を作製し、実施例2と同様にして組換えウイルスを作製した。比較として、参考例1においてGFP遺伝子の代わりにルシフェラーゼ遺伝子を用いて、BDVゲノムの5’末端にルシフェラーゼ遺伝子を挿入した組換えベクター(rBDV-5’Luciベクター)を作製した。培養細胞に各組換えウイルスをそれぞれ感染させた後、10日目における細胞への組換えウイルスの感染及びルシフェラーゼ遺伝子の発現を、実施例2と同様のN蛋白質に対する抗体(抗BDV N抗体)を用いる間接免疫蛍光抗体法により調べたところ、rBDV-p/mLuciベクターから産生された組換えウイルスを感染させた細胞においては、図15aに示すようにN蛋白質が観察されたが、rBDV-5’Luciベクターは、感染細胞において組換えウイルスを産生することができなかった。また、組換えウイルスrBDV-p/mLuci感染Vero細胞(図15b中、rBDV・p/mLuci)におけるルシフェラーゼの活性をルシフェラーゼアッセイキット(Promega社)を用いて、添付の説明書に従って測定したところ、非感染細胞に比べ有為に高いルシフェラーゼ活性を示した(図15b)。このことから、組換えウイルスrBDV-p/mLuciから産生されるルシフェラーゼが機能していることが確認された。
【実施例】
【0123】
<実施例6>
実施例3と同様にして、実施例1で作製したP-M遺伝子間にGFPが挿入されたプラスミド(プラスミドpCAG-Fct-P/M-GFP、以下、「p/mGFP」という)から産生された組換えウイルスp/mGFPを新生仔マウスの頭蓋内に接種した。組換えウイルス接種2ヶ月後及び8ヶ月後に、マウスの大脳皮質及び小脳から採材を行ない(それぞれn=2)、実施例3と同様にして細胞へのウイルスの感染を、(1)N蛋白質抗体(抗BDV N抗体)及び蛍光標識抗体(モリキュラープローブ社製)を使用する間接免疫蛍光抗体法、並びに(2)GFPの蛍光により調べた。その結果、BDVウイルスは、接種から2ヶ月~8カ月間、感染細胞(マウスの大脳皮質及び小脳)で持続発現することが分かった。
【実施例】
【0124】
図18a及びbは、組換えウイルス接種8カ月後のマウスの脳切断面の蛍光顕微鏡写真である。図18aは、マクロ写真であり、図18bは、図18aの四角で囲った部分を顕微鏡で拡大した写真である。図18a及びbにおいて、GFPは緑色の蛍光によって検出された。図18a及びb中では、灰色に見える部分がGFPにより緑色に蛍光を発する部分である。
【実施例】
【0125】
<実施例7>
G欠損ウイルスの回収
(1)プラスミドの構築
A) p/mGFP deltaG L linear (p/mGFP ΔG LL)の作製
実施例1で作製したp/mGFPを元に、ウイルス膜糖蛋白質であるG遺伝子をPCRを用いた点変異導入により欠損させた。具体的な方法として、G遺伝子に存在する2つのメチオニンをコードする配列(ゲノム番号(すなわち配列番号1の塩基)2236-2238、及び2248-2250)をスレオニン(ATG→ACG)へと置換した。図19に、G遺伝子欠損型ウイルスをコードするプラスミドであるp/mGFP ΔGの作製手順の概略を示す。先ずp/mGFPを鋳型に表1に示す配列のプライマーA1及びB1、並びにプライマーC1及びD1を用いてPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5又は1分を25サイクル)を行った(図19(a))。
【実施例】
【0126】
次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型に、上記のプライマーA1及びD1を用いて再びPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1.5分を25サイクル)を行った(図19(b))。増幅産物(2ndPCR産物)はG遺伝子のメチオニンがスレオニンへと変異しており、これを制限酵素Bst1107I及びNheIを用いて、ベクターであるp/mGFPと組換えて(図19(c))、p/mGFP ΔGを得た。
【実施例】
【0127】
さらに、不要になったL遺伝子イントロン領域(本来この部分はG遺伝子の領域)を削りL遺伝子を直結した(L linearize)。具体的な方法として、制限酵素サイトBst1107I(配列番号1の2166~2171番目の塩基配列)からL遺伝子のエクソン前半部までとL遺伝子のエクソン後半部(NheIサイト(配列番号1の6158~6163番目の塩基配列)まで)をそれぞれ増幅し両者を結合させてp/mGFP ΔGに組込んだ。この手順の概略を、図20に示す。先ず、表1に示すプライマーA1及びE1、並びに及びプライマーF1及びD1を用いてp/mGFP ΔGを鋳型にPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5分を25サイクル)を行った(図20(a))。次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーA1及びD1を用いてPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1を25サイクル)を行った(図20(b))。増幅産物(2ndPCR産物)は、L遺伝子のイントロン部分が削除されており、これを制限酵素Bst1107I及びNheIを用いて、ベクターであるp/mGFP ΔGと組換えて、p/mGFP ΔG LLを得た(図20(c))。
【実施例】
【0128】
B)BDV G遺伝子発現プラスミド
G欠損ウイルスを回収するために、ヘルパープラスミドとしてBDVのG蛋白質を哺乳類細胞で発現させるプラスミドを作製した。この手順の概略を、図21に示す。具体的な方法として、p/mGFPを鋳型にPCRでG遺伝子領域を増幅し、ニワトリベータアクチンプロモーターの下流に挿入した(上述した他のN、P及びL遺伝子のヘルパープラスミドと同様の方法)。先ず、表1に示すプライマーG1及びH1、並びにプライマーI1及びJ1を用いてp/mGFPを鋳型にPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5又は1.0分を25サイクル)を行った(図21(a))。次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーG1及びJ1を用いてPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1.5分を25サイクル)を行った(図21(b))。増幅産物(2ndPCR産物)はG遺伝子をコードしているが、BDVが本来有するスプライシングサイト(SD = 2409-2415、SA = 2437-2442)に、PCRの際に変異を導入し、機能しないようにしている(アミノ酸変異は無い)。具体的には、野生型BDV(WT)のゲノムの2409-2415番目のGGTTATGを、agtctccとし(ΔSA)、さらに野生型BDV(WT)のゲノムの2437-2442番目のGGTTATGを、agtctccとした(ΔSD)。この2ndPCR産物(ΔSDSA G遺伝子)を、制限酵素KpnI及びSmaIを用いて発現プラスミド(実施例1のヘルパープラスミドの作製で使用したpCXN2)に挿入し(図21(c))、BDV G遺伝子発現プラスミドを作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、DNAシークエンスによって確認した。なお、本実験ではG遺伝子発現プラスミドの作製にpCXN2を使用したが、哺乳類細胞で遺伝子を発現できる他のプラスミドも使用可能である。
上記で使用したプライマーの配列を、表1に示す。
【実施例】
【0129】
【表1】
JP0005299879B2_000002t.gif
【実施例】
【0130】
(2)BDV G遺伝子発現細胞の作製
上記(1)A)で作製したG蛋白質発現プラスミドを用いてBDVのG遺伝子安定発現細胞を作製した。具体的な方法として、回収に用いる哺乳類培養細胞株、すなわち293T細胞及びVero細胞それぞれ1~5×105個を9.4 cm2の培養シャーレに撒き、翌日市販の遺伝子導入試薬(Fugen6、Lipofectamine2000)を用いて、上記(1)で作製したプラスミドDNAを2~5μg導入した。細胞の培養は、37℃でダルベッコ変法イーグルMEM培地を用いて行った。プラスミド添加から3日後細胞を継代し、新しい培養プレートに1/3量撒いた。その際、選択薬剤としてジェネティシン(G418)(Invitrogen:GIBCO)を1μg/mlの濃度でダルベッコ変法イーグルMEM培地に加えた。薬剤選択によって目的遺伝子が安定的に導入された細胞のみ生存するため、この方法によりG遺伝子安定発現細胞株(G遺伝子安定発現293T細胞及びG遺伝子安定発現Vero細胞)を単離した。
【実施例】
【0131】
(3)G遺伝子欠損ウイルスの回収
A) G遺伝子欠損ウイルス感染Vero細胞の回収
293T細胞にヘルパープラスミドとしてN、P、L及びG遺伝子を導入した。さらに上記で作製したp/mGFP ΔG又はp/mGFP ΔG LLを導入した(遺伝子導入方法は上記(2)と同じ)。各プラスミドを、N遺伝子=0.25μg、P遺伝子=0.025μg、L遺伝子=0.25μg、G遺伝子=0.01μg、p/mGFP ΔG又はp/mGFP ΔG LL=2.0μgという量比で細胞に導入した。遺伝子導入後、37℃で293T細胞を培養した。遺伝子導入3日後に細胞を継代し、その際上記で作製したG遺伝子安定発現Vero細胞と共培養を行った後、該Vero細胞を、G遺伝子欠損ウイルス感染Vero細胞として回収した。
【実施例】
【0132】
B)粒子状のG遺伝子欠損ウイルスの回収
上記(3)A)で作製した感染Vero細胞をトリプシン溶液(トリプシン0.03% w/v、EDTA/2Na 0.02% w/v in PBS-)を用いて培養プレートから回収し、室温にて100~150g、5分間遠心分離し細胞沈殿物を回収した。回収した細胞沈殿物をもう一度イーグルMEM培養液を用いて懸濁した。作製した懸濁液を、超音波細胞破砕機を用いて処理した。破砕処理後の懸濁液は4℃にて1000~1200g、25分間遠心分離し上清をウイルス液として回収した。p/mGFP ΔG及びp/mGFP ΔG LLのいずれを導入した細胞からも、組換えBDVが回収された。
【実施例】
【0133】
C)ウイルスの濃縮
ウイルス液は、必要に応じ超遠心機を用いて濃縮した。具体的な方法として、超遠心用のチューブに20%ショ糖液を加え、その上に上記(3)B)で回収したウイルス液を加えた。4℃にて50000~100000g、2時間遠心分離し、沈殿物をPBS-で再懸濁して濃縮液として回収した。
【実施例】
【0134】
<実施例8>
p/mGFP ΔG LL感染細胞の作製とシュードタイプウイルスの作製
(1)p/mGFP ΔG LL感染細胞の作製と持続感染性の確認
A)p/mGFP ΔG LL感染細胞の作製
実施例7の(3)B)又はC)で回収したウイルスをVero細胞に接種し、p/mGFP ΔG LL感染細胞を作製した。ウイルス液の希釈にはOpti-MEM(Invitrogen:GIBCO)を用い、24wellプレートに撒いた単層のVero細胞にウイルス希釈Opti-MEMを100μl接種し(Vero細胞1個につき、ウイルスを約0.1~0.01粒子)、37℃で1時間感作させた。その後PBS-を用いて細胞を洗浄しダルベッコ変法イーグルMEM培地にて37℃で培養を続けた。接種した感染細胞はウイルスが伝播しない為、細胞のクローニング法(限界希釈法)により100%感染細胞を分離した。感染細胞かどうかの判断は蛍光顕微鏡によりGFPの発現を観察し判断した。ここで分離した感染細胞は、後述するシュードタイプウイルスの作製にも用いた。
【実施例】
【0135】
実施例7で作製したp/mGFP ΔG及びG遺伝子欠損ウイルス感染Vero細胞、並びにp/mGFP ΔG LL及び上記A)で作製したp/mGFP ΔG LL感染細胞をそれぞれ用いて、プラスミドp/mGFPΔG及びp/mGFP ΔG LLそれぞれによる組換えBDV産生能力を比較した。p/mGFP ΔG及びp/mGFP ΔG LLの各細胞への感染は、実施例7と同様の方法により行った。
図22は、G遺伝子安定発現細胞への共培養後12日目の各細胞のウイルス陽性率をGFPを指標に測定したものである。図22から、細胞10万個当たりのGFP陽性細胞の数は、p/mGFP ΔGを用いた場合を1としたとき、p/mGFP ΔG LLはその約8倍の陽性率を示した。
このことから、p/mGFP ΔG LLは、p/mGFPΔGと比較して、組換えBDV産生能力が高いことが分かった。
【実施例】
【0136】
B)p/mGFP ΔG-LLウイルスの持続感染性と伝播能
実施例7の(3)B)又はC)で回収したウイルス(G欠損型組換えウイルス)をVero細胞又はG遺伝子安定発現Vero細胞にウイルス:細胞=1:100で接種し、増殖性及び持続性を観察した。感染率は、24wellプレートに撒いた細胞10万個あたりの感染細胞数をカウントすることにより測定した。その結果、図23に示すように、Vero細胞に接種した場合、感染率は約1%程度で推移したが、G遺伝子安定発現Vero細胞に接種した場合、経過とともに感染率は上昇した。このことから、BDVはG遺伝子なしでも持続感染するが(少なくても100日以上は観察)、感染を拡大するのにG遺伝子が必要であることが確認された。図23中、◆は、BDVのG遺伝子安定発現Vero細胞であり、■は、Vero細胞(G遺伝子を発現しない細胞)である。
図24aは、野生型BDV及びG欠損型組換えウイルスそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現をウェスタンブロット法により調べた結果を示す。図24a中、G、N及びGFPは、それぞれG蛋白質、N蛋白質及びGFPである。図24bは、G欠損型組換えウイルスを感染させたVero細胞の蛍光顕微鏡写真である。図24bの写真で灰色見える部分はGFPによる緑色蛍光部分である。図24a及びbより、G遺伝子欠損ウイルスを感染させた細胞において、該ウイルスにより導入されたGFPが発現していることが確認された。
【実施例】
【0137】
(2)p/mGFP ΔG LL感染細胞を用いたシュードタイプウイルスの作製
A)BDVG遺伝子細胞内領域と水疱性口内炎ウイルス(VSV)又は狂犬病ウイルス(RabV)のG遺伝子細胞外及び膜貫通領域を有するキメラ蛋白質発現プラスミドの作製
シュードタイプウイルスを作製するために、他のウイルスの膜蛋白質遺伝子を発現するプラスミドを作製した。図25に、手順の概略を示す。具体的な方法として、VSV(Indiana株)のG遺伝子発現プラスミド(GeneBank ID:J02428.1)を鋳型に、表2に示すプライマーA2及びB2を用いてPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1.5分を25サイクル)を行った(図25(a))。増幅産物(PCR産物)は細胞内領域はBDV由来、細胞外及び膜貫通領域はVSV由来のキメラ膜蛋白(以下、キメラVSV-G蛋白質ともいう)をコードするDNA配列となっている。このPCR産物を制限酵素EcoRI及びEcoRVを用いて哺乳類細胞発現プラスミドであるpCXN2(実施例7の(1)B)参照)に組込み(図25(b))、VSV-G発現プラスミドを得た。
【実施例】
【0138】
BDVとRabVとのキメラ膜蛋白質を発現するプラスミド(キメラRab-G発現プラスミド)の作製は、鋳型としてRabV:Nishigahara株のG遺伝子発現プラスミド(GeneBank ID:AB044824.1)を用い、プライマーとして、プライマーA2及びB2の代わりに表2に示すプライマーC2及びD2を用い、制限酵素としてKpnI及びEcoRVを用いた以外は、上記と同様の方法で行った。Rab-G発現プラスミドは、細胞内領域はBDV由来、細胞外及び膜貫通領域はRabV由来のキメラ膜蛋白(以下、キメラRab-G蛋白質ともいう)を発現する。
【実施例】
【0139】
【表2】
JP0005299879B2_000003t.gif
【実施例】
【0140】
B)キメラ膜蛋白質安定発現細胞の作製
VSV及びRabVのG遺伝子の安定発現細胞株(VSV-G蛋白質安定発現株及びRab-G蛋白質安定発現株)を作製した。上記(2)A)で作製したプラスミド又は同様の方法で作製したTetシステム発現プラスミドに導入したプラスミドを用いてキメラ膜蛋白質安定発現細胞を作製した。具体的には実施例7の(2)に記載されている方法において、G蛋白質発現プラスミドの代わりに上記(2)A)で作製したキメラG蛋白質を発現するプラスミド又は同様の方法で作製したTetシステム発現プラスミドに導入したプラスミドを使用し、293T細胞及びVero細胞、並びに上記(1)で作製したp/mGFP ΔG LL感染細胞に導入した。Tetシステムの薬剤耐性濃度等は添付の説明書に記載の通りに行った。なお、今回用いたのはInvitrogen社のT-RExシステムである。
【実施例】
【0141】
C)シュードタイプウイルスの回収
上記(1)A)で作製したp/mGFP ΔG LL感染細胞クローンを用いて、シュードタイプウイルスの回収を行った。具体的な方法として、p/mGFP ΔG LL感染細胞にキメラ膜蛋白質発現プラスミドを遺伝子導入し、ダルベッコ変法イーグルMEM培地またはNutrient Mixture F-12 HAM培地(SIGMA)中で37℃で培養後48-96時間後に上清をシュードタイプウイルス含有液として回収した。p/mGFP ΔG LLにコードされる組換えBDVゲノムを有し、VSV又はRabのウイルス膜蛋白質を被ったシュードウイルスが回収された。G遺伝子としてBDVのG遺伝子、並びにVSV及びRabの外殻遺伝子を用いた場合の、三者の間におけるウイルスの回収効率(粒子形成効率)の違いを、図26に示した。図26では、ウイルスの回収効率は、BDV のG遺伝子を使用したときを1とする相対値で表わされている。
さらに、実施例7(3)B)及びC)で示した方法と同様にして、キメラ蛋白質発現細胞を用いてVSV又はRabの膜蛋白質を被ったシュードタイプウイルスを回収した。これらのシュードタイプウイルスは、VSV又はRab由来の外殻を有し、かつp/mGFP ΔG LLにコードされる組換えBDVゲノムを発現できるシュードタイプウイルスである。
【実施例】
【0142】
<実施例9>
M及びG遺伝子欠損ウイルス
(1)p/mGFP ΔG LLをもとにM遺伝子を欠損させたプラスミドp/mGFP ΔM-G LLを作製した。
A)p/mGFP ΔM-G LLプラスミドの構築
さらなる安全性の向上と外来遺伝子挿入箇所の拡大を目的にBDVの膜裏打ち蛋白質をコードするM遺伝子を欠損させた。図27に、M遺伝子を欠損させたp/mGFP ΔM-G LLプラスミドの作製手順の概略を示す。具体的な方法として、p/mGFP ΔG LLを鋳型に、表3に示すプライマーA3及びプライマーB3を用いてPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1.5分を25サイクル)を行った(図27(a))。得られたPCR産物(1stPCR産物)をPacIとNheIを用いてp/mGFP ΔG LLに挿入し、p/mGFP ΔM-G LLを作製した(図27(b))。
【実施例】
【0143】
B)p/mGFP ΔM-G LLウイルスの回収
実施例7においてp/mGFP ΔG‐LLウイルスを回収したときと同様に、M蛋白質及びG蛋白質を両方共安定的に発現する培養細胞株を作製し(M遺伝子の選択薬剤にはゼオシンを使用した)、p/mGFP ΔM-G LLウイルスの回収を行った。
【実施例】
【0144】
C)p/mGFP ΔM-G LLウイルスの性状解析
得られたp/mGFP ΔM-G LLウイルスをVero培養細胞に感染させたところ、野生株と同様に感染性を有することが確認された。
【実施例】
【0145】
(2)p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorの作製
p/mGFP ΔM-G LL のp/m遺伝子間にもう一つ外来遺伝子挿入したカセットを作製した。
さらなる外来遺伝子を挿入する目的で、新たな外来遺伝子挿入カセットをp/m遺伝子間に挿入した。図28に、p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorの作製手順の概略を示す。具体的な方法として、p/mGFP ΔM-G LLを鋳型に表3に示すプライマーC3及びD3を用いてPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5分を25サイクル)を行った(図28(a))。さらに、得られたPCR産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーC3及びE3(表3)を用いてPCR(98℃ 10秒、98℃ 5秒、72℃ 0.5分を25サイクル)を行った(図28(b))。得られたPCR産物(2ndPCR産物)を、EcoT22IとBstBIを用いてp/mGFP ΔM-G LLに挿入した。これにより新たな外来遺伝子挿入カセットSse8381I-SwaIをp/mGFP ΔM-G LLに挿入でき、p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorが得られた。
このカセットは、P遺伝子のORFとM遺伝子のORFの間にBstBI-PacIサイトを有する他のp/mベクターにEcoT22IとBstBIを用いて組込みことが可能である。
【実施例】
【0146】
【表3】
JP0005299879B2_000004t.gif
【実施例】
【0147】
<実施例10>
p/mベクターの利用
(1)アルツハイマー病の治療を目的としたp/mNEPベクターの作製
A)p/mNEPベクターの作製
アルツハイマー病の遺伝子治療法開発を目的にp/m遺伝子間にアミロイドベータ蛋白質(Aβ)分解酵素であるNeprilysin(NEP : Gene ID = 4311)を挿入したp/mNEPベクターを作製した。具体的な方法として、ヒト由来培養細胞からRNAを抽出し、oligodTをプライマーに逆転写酵素(Invitrogen、Super script III)によりmRNAの逆転写反応を行った。得られたcDNAを鋳型に、表6に示すプライマーA4及びB4を用いてNEPをPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 2.5分を25サイクル)により増幅した。得られたPCR産物をBstBI-PacIを用いてp/mGFPベクターと組換え、p/mNEPベクターを作製した。p/mNEPベクターは、実施例1で作製したBDVのP-M遺伝子間にGFPが挿入されたプラスミド(p/mGFP)において、GFPのcDNAがNEPのcDNAで置換されている。さらに、比較のため、NEP酵素活性部位に変異を加えたものをp/mベクターに挿入した組換えベクター(以下、比較ベクター1という)を作製した。方法としては、表6に示すプライマーA4及びC4、並びにB4及びD4を用いてp/mNEPを鋳型にPCR(98℃10秒、55℃5秒、72℃2分又は0.5分を25サイクル)を行った。次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーA4及びB4を用いてPCR(98℃10秒、55℃5秒、72℃2.5分を25サイクル)を行った。増幅産物(2ndPCR産物)はNEPのアミノ酸配列585番目がグルタミン酸(GAA)からバリン(GtA)に置換されており、これをBstBI-PacIを用いてp/mNEPベクターと組換え、比較ベクター1を作製した。
【実施例】
【0148】
作製したp/mNEPベクター及び比較ベクター1それぞれから、組換えウイルスを、実施例2と同様の方法にて回収し、性状の解析を行った。また、回収したウイルスはアルツハイマー病モデルマウスに投与した。
B)Vero細胞におけるp/mNEPの発現及び活性測定
上記で作製したp/mNEPベクターを用いて、実施例2と同様の方法により、p/mNEP感染Vero細胞を得た。
得られたp/mNEP感染Vero細胞が実際にNEPを発現しているかをWestern Blotting及び間接蛍光抗体法にて確認した。今回用いた一次抗体は抗CD10[56C6]マウスモノクローナル抗体(abcam社:ab951)である。図29に、p/mNEP感染細胞のWestern Blottingの結果を示す。図29中、NEPは、p/mNEPベクターから産生された組換えウイルスp/mNEP感染細胞であり、d.nは、比較ベクター1から産生されたウイルスが感染した比較細胞であり、n.cは、非感染細胞である。α-Nは、BDVのN蛋白質である。図29から、p/mNEPベクター及び比較ベクター1から産生された組換えウイルスが感染した細胞(比較細胞1)では、NEPが発現したことが確認された。
【実施例】
【0149】
NEPの活性測定には反応領域を疑似的に合成したものであるDAGNPG(Sigma社)を用いた。先ずp/mNEPが感染した細胞をトリプシンで培養シャーレから剥がし、遠心分離にて回収した。回収した細胞は、DAGNPG入りの溶液(50mM Tris-HCl、1μM カプトプリル、50μM DAGNPG)で再懸濁し、37℃で2時間反応させた。反応後100℃で5分間熱して酵素を失活させた。その後4℃にて15000g程度で5分間遠心分離し、上清を回収した。回収した液を96wellプレートに1well あたり200μl注入し、マイクロプレートリーダーにて波長342 nmの励起光で励起し、波長580nmの発光を測定した。NEP活性が強いほど、検出される発光量が多くなる。図30に、切断酵素活性を測定した結果を示す。p/mNEP感染細胞では、非感染細胞及び比較細胞1と比較してNEP活性が顕著に高かった。
【実施例】
【0150】
C)p/mNEPをアルツハイマー病モデルマウスへ接種
治療法開発に向け、先ずアルツハイマー病モデルマウスにp/mNEPを接種した。数多く存在するアルツハイマー病のモデルマウスの中で、今回はB6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/J(Jackson研究所No6554)とB6.Cg-Tg(APPSwe,PSEN1dE9)85Dbo/J(Jackson研究所No5864)を使用した。これらのモデルマウスはいずれも、ヒトのAβ前駆蛋白質とその分解酵素プレセニリンの変異体を神経細胞に発現させたもので、出生後早期にアルツハイマー病様の症状を示すことが報告されている。
【実施例】
【0151】
上記モデルマウスの新生仔の脳内に、p/mNEPベクターから産生された組換えウイルスを接種する。
【実施例】
【0152】
D) p/mGFPベクターから産生された組換えウイルスの脳内での持続性
現時点で、p/mGFPベクターから産生された組換えウイルスを接種したマウスでは脳内に少なくとも8カ月間は導入したGFPの発現が確認された(実施例6及び図18)。このことからp/mベクターはアルツハイマー病のような長期経過を辿る神経疾患に適用できると考えられる。
【実施例】
【0153】
<実施例11>
(1)miRNA導入ベクターの開発
医療及び研究への応用に役立てるため、機能性RNAであるmiRNAを導入可能なp/mベクターを作製した。
A)p/m miR155導入用ベクター(pSIRIUS-B)の作製
pSIRIUS-Bの作製手順の概略を、図31に示す。まず、様々なmiRNA配列を導入するために必要となる導入用ベクターを作製した。初めにpBluescript SK-のマルチクローニングサイトにBstBIとPacIの制限酵素サイトを導入し(図31(b))、p/m miR155導入用ベクターpSIRIUS-Bを完成させた。次にその間にmiR 155をもとに設計したmiRNA発現に必要な制御配列を導入した。さらに、その中心にはBbsIによる制限酵素カセットを挿入し、様々なmiRNA配列を導入できるようにした(図31(a))。
図31(a)の模式図において、白い部分がmiRNA発現制御部位であり、黒い部分がオリゴ導入カセットである。図31(a)に模式的に示されるDNA断片の配列及び該配列内の制限酵素サイトを、下記表4に示す。
【実施例】
【0154】
【表4】
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【実施例】
【0155】
B)p/m miR155を用いた活性測定用ベクターの作製
A)で作製したベクターを利用して様々なmiRNA配列をBstBI、PacIを用いてp/mベクターに挿入することが可能である。今回は一例としてmiR155を用いた。miR155標的配列を合成し、これをpSIRIUS-BにBbsIを用いて導入し、pSirius-B miR-155を得た(図32(a))。表5に、今回合成したmiR155標的配列の配列を示す。上段が、miRNA155の配列(配列番号32)である。表5の下段の配列を配列番号33に示す。miR155標的配列(オリゴ)を、pSirius-B miR-155から、BstBI-PacIを用いてp/mベクターに導入し、p/m miR155を作製した(図32(b))。
【実施例】
【0156】
【表5】
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【実施例】
【0157】
さらに導入したmiR155が機能しているかを調べる目的で、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼの下流にmiR155のターゲット配列を導入したプラスミドを作製しmiR155の効果を判定できるようにした。
【実施例】
【0158】
C)p/m miR155の回収と活性測定
実施例2に示した方法と同様の方法によりp/m miR155のプラスミドから組換えウイルスを回収し、B)で作製したプラスミドを用いてその活性を測定した。方法として、p/m miR155感染細胞及びBDV野生株感染細胞(いずれもVero細胞にウイルスを感染させた)に遺伝子導入試薬(Lipofectamine2000など)を用いてレポータープラスミドを導入し、2~3日後Luciferase Assay System(Promega社)に添付のプロトコール通りに実験を行い、p/m miR155感染細胞とBDV野生株感染細胞とを比較した。図33に、組換えウイルスを感染させた細胞における標的遺伝子の転写阻害効率を示す(図33のwt: BDV野生株感染細胞、x1:p/m miR155感染細胞)。
【実施例】
【0159】
D)p/m miRx2、p/m miRx4の作製
さらに、a)を改良しmiRNAの配列をx2(2回繰り返した配列)、x4(4回繰り返した配列)で挿入することができるように新たなプラスミドを作製した。作製手順の概略を、図34に示す。まずpcDNA3のマルチクローニングサイトにBstBIとPacIを挿入した(pSIRIUS-D)。次にA)で作製したプラスミド(目的のmiRNA挿入済み)を鋳型に表6に示すプライマーE4及びF4を用いてPCRを行った(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5分を25サイクル)。得られたPCR産物をpSIRIUS-DにSalIとXhoIを用いて挿入した(図34(a))(このとき挿入される向きに注意した)。さらに、作製したプラスミドからSalIとXbaIでインサートを切り出し(図34(b))、得られた断片をもう一度同一のプラスミドに今度はXhoIとXbaIを使って挿入した(SalIとXbaIは同一の切断配列を有した)(図34(c))。これによりmiRNAx2のプラスミドが得られた。得られた、miRNAx2のプラスミドをBstBIとPacIで切り出してp/mベクターに挿入することにより、p/m miRNAx2が得られた。miRNA x4は上記工程を繰り返すことによって作製した。miRNA×2及びmiRNA×4のp/mベクターの模式図を、図35に示す。得られたmiRNA×2及びmiRNA×4のp/mベクターを、実施例2に示した方法と同様の方法により回収し、その効果を確認した。結果を、図33に示す。図33中、×1、×2、及び×4はそれぞれ、プラスミド中に挿入したmiR155の数である。図33から分かるように、miR155が導入された数が多いほど、標的遺伝子の発現が効率よく阻害された。また、細胞に導入されたmiR155は、細胞で持続的に発現することが確認され、本発明のベクターは、機能性RNAを発現できるRNAベクターとして有用であることが示された。
【実施例】
【0160】
【表6】
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【実施例】
【0161】
(2)miRNA導入ベクターの応用
A)p/m miRNA GAPDHを用いたマウス海馬初代培養細胞におけるmiRNAの効果
p/m miRNA155において、miRNA155の代わりに細胞内で恒常的に発現しているGAPDHに対するmiRNA(miR-GAPDH)を挿入したプラスミド(p/m miRNA-GAPDH)を作製し、その効果をより生体に近いマウス海馬初代培養細胞で確認した。p/m miRNA-GAPDHの作製方法は(1)で示したp/m miR155の作製方法とほぼ同様である(合成したmiR-GAPDHの配列を、配列番号40及び41に示した)。配列番号40のDNA及び配列番号41のDNAは、プラスミド内では二重鎖を形成している。実施例2に示した方法と同様の方法によりp/m miRNA-GAPDHから産生された組換えウイルスp/m miRNA-GAPDHを回収した。回収した組換えウイルスp/m miRNA-GAPDHを新生仔マウスの海馬から採取した初代培養細胞にMOI=0.01で接種した。7日後に固定後、抗BDV-N抗体、及び抗GAPDH抗体で染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、組換えウイルスp/m miR-GAPDHを感染させた細胞では野生型BDVを感染させた細胞に比べ有為にGAPDHの発現が抑制されていた(図36)。図36a及びbは、野生型BDVを感染させた細胞であり、図36c及びdは、組換えウイルスp/m miR-GAPDHを感染させた細胞である。図36a及びcは、抗BDV-N抗体で染色した細胞の蛍光顕微鏡写真であり、図36b及びdは、抗GAPDH抗体で染色した細胞の蛍光顕微鏡写真である。図36b及びdの四角内は、拡大写真であり、**を付した矢印は、非感染細胞を示す。**が付されていない矢印は、感染細胞(図36bでは野生型、図36dではp/m miR-GAPDH)を示す。図36bでは非感染細胞、感染細胞共にGAPDHの発現レベルは高い(GAPDHは抑制されていない)が、図36dでは感染細胞は非感染細胞に比べGAPDHの発現レベルが抑制されていることが観察された。
【実施例】
【0162】
B)p/m miRNA APPを用いた感染Vero細胞におけるmiRNA-APPの効果
p/m miRNA155において、miRNA155の代わりにアルツハイマー病の原因蛋白質であるAPPに対するmiRNA(miRNA-APP)を挿入したプラスミド(p/m miRNA-APP) を作製し、その効果をp/m miRNA-APP感染Vero細胞を用いて確認した。p/m miRNA-APPの作製方法は(1)で示したp/m miR155の作製方法とほぼ同様である(合成したmiRNA-APPを、配列番号42及び43に示した)。配列番号42のDNA及び配列番号43のDNAは、プラスミド内では二重鎖を形成している。実施例2に示した方法と同様の方法によりp/m miRNA-APPから産生された組換えウイルスp/m miRNA-APPを回収した。回収した組換えウイルスp/m miRNA-APPを感染させた細胞にLipofectamine2000を用いてAPP発現プラスミド(pcDNA3に添付の説明書に従って作製。APPのcDNA(Accession No=NM_000484)はヒト由来培養細胞からRNAを抽出し、oligo dTプライマー及び逆転写酵素を用いて調製した。)を添付の説明書に従って導入した。48時間後にRNAを回収し、上記表6に示すAPPに特異的なプライマーG4及びH4を用いた定量的RT-PCR(95℃10秒、60℃30秒、40サイクル)によりAPPのmRNAのレベルを確認した。コントロールとして、p/mGFPから産生された組換えウイルスを感染させた細胞を用いて同様の実験を行なった。その結果、組換えウイルスp/m miRNA-APPが感染したVero細胞ではp/mGFPが感染したVero細胞に比べ有為にAPPのmRNAの量が低下していた(図37)。
【産業上の利用可能性】
【0163】
本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、細胞核で非細胞障害的にかつ効率的に外来性遺伝子を発現できるものであり、また、ウイルスゲノムがRNAであることから宿主染色体に挿入されることがなく安全なベクターである。さらに、本発明のウイルスベクターはボルナ病ウイルスを利用するものであるが、ボルナ病ウイルスは神経細胞に感染指向性があることから外来性遺伝子を脳神経系に選択的に導入することができる特異性に優れたベクターである。このため、本発明は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野、例えば、脳神経系疾患治療及び予防、脳神経化学領域における神経系細胞の可視化技術等に使用することができるため有用である。さらに、siRNA、miRNA、RNAアプタマー等の機能性RNAの安定発現ベクター技術に応用することもできる。従って、本発明は、医療、動物医療、治験、研究等の分野において有用である。
図面
【図3】
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【図4】
1
【図5】
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【図10】
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【図1】
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【図2】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28】
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【図29】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【図33】
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【図34】
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【図35】
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【図36】
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【図37】
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