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明細書 :非アルコール性脂肪肝治療用組成物、非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法及びDNAチップ

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 公開特許公報(A)
公開番号 特開2017-074077 (P2017-074077A)
公開日 平成29年4月20日(2017.4.20)
発明の名称または考案の名称 非アルコール性脂肪肝治療用組成物、非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法及びDNAチップ
国際特許分類 C12Q   1/02        (2006.01)
C12Q   1/68        (2006.01)
C12N  15/09        (2006.01)
C12M   1/00        (2006.01)
FI C12Q 1/02 ZNA
C12Q 1/68 A
C12N 15/00 F
C12M 1/00 A
請求項の数または発明の数 5
出願形態 OL
全頁数 10
出願番号 特願2017-019946 (P2017-019946)
分割の表示 特願2012-275059 (P2012-275059)の分割、【原出願日】平成24年12月17日(2012.12.17)
出願日 平成29年2月6日(2017.2.6)
発明者または考案者 【氏名】小堀 真珠子
【氏名】杉浦 実
【氏名】小川 一紀
【氏名】太田 嗣人
出願人 【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
個別代理人の代理人 【識別番号】100106002、【弁理士】、【氏名又は名称】正林 真之
審査請求
テーマコード 4B029
4B063
Fターム 4B029AA07
4B029BB01
4B029BB11
4B029BB20
4B029CC02
4B029CC03
4B029FA15
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR41
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS32
4B063QS36
4B063QX01
4B063QX02
要約 【課題】非アルコール性脂肪肝を治療するための治療用組成物、非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法において用いられるDNAチップを提供すること。
【解決手段】本発明は、β-クリプトキサンチンを含む、非アルコール性脂肪肝治療用組成物を提供する。また、本発明は、少なくとも1つの候補物質と、培養肝細胞とを接触させる接触工程と、上記接触工程の後に、β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を検出する検出工程と、β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を抑制した候補物質を選択する選択工程と、を含む非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【選択図】図1
特許請求の範囲 【請求項1】
少なくとも1つの候補物質と、培養肝細胞とを接触させる接触工程と、
前記接触工程の後に、β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を検出する検出工程と、
β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を抑制した候補物質を選択する選択工程と、を含む非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法。
【請求項2】
前記β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子がC1QB、CD52、CD68、CD74、COL1A1、CYBA、CD64、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、LYZのうちのいずれか1つ以上である請求項1に記載のスクリーニング方法。
【請求項3】
前記非アルコール性脂肪肝が非アルコール性脂肪肝炎である請求項2に記載のスクリーニング方法。
【請求項4】
C1QB、CD52、CD68、CD74、COL1A1、CYBA、CD64、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、LYZのうちのいずれか2つ以上のDNAを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを備えるDNAチップ。
【請求項5】
配列番号1~30記載の配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを2種以上備えるDNAチップ。
発明の詳細な説明 【技術分野】
【0001】
本発明は、非アルコール性脂肪肝治療用組成物、非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法及びDNAチップに関する。
【背景技術】
【0002】
日本における肝疾患の罹患者は急増している。罹患者が増加している肝疾患のうち、特に、食生活の欧米化に伴う、脂肪及びコレステロールの摂取量の増加を原因とする非アルコール性脂肪肝の増加が指摘されている。現在では、成人の4人に1人は非アルコール性脂肪肝に罹患しているものと推計されている。
【0003】
非アルコール性脂肪肝は、肝臓に脂肪が蓄積した状態である単純性脂肪肝、ならびに、肝臓に脂肪が蓄積した脂肪肝の状態からさらに炎症及び線維化が生じた非アルコール性脂肪肝炎に大別される。非アルコール性脂肪肝炎は、さらに肝硬変や肝癌へと進行し得るうえ、メタボリックシンドロームを高頻度に合併し得るので問題視されている。
【0004】
非アルコール性脂肪肝炎の予防及び治療に有効な化合物として、ビタミンE(非特許文献1)、ピルビン酸(特許文献1)クルクミン類(特許文献2)等が報告されている。
【先行技術文献】
【0005】

【特許文献1】特許公開2011-236160号公報
【特許文献2】特許公開2007-320864号公報
【0006】

【非特許文献1】N.Engl.J.Med,2010:362:1675-1685
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかし、非アルコール性脂肪肝について確立された治療方法は未だ存在せず、非アルコール性脂肪肝の症状を治療できる医薬品の開発が求められている。
【0008】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、非アルコール性脂肪肝を治療するための治療用組成物、非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法において用いられるDNAチップの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、β-クリプトキサンチンを組成物によれば上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は下記のものを提供する。
【0010】
(1) β-クリプトキサンチンを含む、非アルコール性脂肪肝治療用組成物。
【0011】
(2) 上記非アルコール性脂肪肝が非アルコール性脂肪肝炎である(1)に記載の治療用組成物。
【0012】
(3) 少なくとも1つの候補物質と、培養肝細胞とを接触させる接触工程と、
上記接触工程の後に、β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を検出する検出工程と、
β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を抑制した候補物質を選択する選択工程と、を含む非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法。
【0013】
(4) 上記β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子がC1QB、CD52、CD68、CD74、COL1A1、CYBA、CD64、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、LYZのうちのいずれか1つ以上である(3)に記載のスクリーニング方法。
【0014】
(5) 上記非アルコール性脂肪肝が非アルコール性脂肪肝炎である(4)に記載のスクリーニング方法。
【0015】
(6) C1QB、CD52、CD68、CD74、COL1A1、CYBA、CD64、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、LYZのうちのいずれか2つ以上のDNAを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを備えるDNAチップ。
【0016】
(7) 配列番号1~30記載の配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを2種以上備えるDNAチップ。
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、非アルコール性脂肪肝を治療するための治療用組成物、非アルコール性脂肪肝の治療剤の候補物質のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法において用いられるDNAチップが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】β-クリプトキサンチンによる非アルコール性脂肪肝炎の治療効果を示す、マウス肝臓組織の染色結果を示す図である。
【図2】β-クリプトキサンチンによるマウスの脂肪肝炎の治療効果を示す、DNAチップを用いた評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。

【0020】
<非アルコール性脂肪肝を治療するための治療用組成物>
本発明の治療用組成物は、β-クリプトキサンチンを含む。β-クリプトキサンチンは、ウンシュウミカン等の柑橘類等に多く含まれるカロテノイドであり、プロビタミンAとしての特性を備えており、抗酸化性、抗癌作用、歯周病の予防及び改善等の作用を有することが知られている(例えば、Biol,Pharm.Bull,1995:18(2):227、特許公開2007-246448号公報等を参照)。

【0021】
また、β-クリプトキサンチンの血中濃度と、肝障害マーカーの1つである血中γ-GTP濃度との間に負の相関があることが報告されている(Journal of Epidemiology,Vol.15,No.5 September 2005)。また、喫煙者における血中β-クリプトキサンチンが酸化ストレスに対する保護効果を有し、メタボリックシンドロームの発症を抑制し得ることが報告されている(British Journal of Nutrition(2008),100,1297-1306)。

【0022】
しかし、本発明者らの検討による結果、β-クリプトキサンチンは、特定の遺伝子の発現を制御することにより、非アルコール性脂肪肝の治療効果をも有することが実証された。このような治療効果は、β-クリプトキサンチンの血中濃度と、特定の肝障害マーカー及び酸化ストレスとの関連を示唆しているに過ぎない従来の知見からは予測しがたいことである。

【0023】
なお、本発明において「非アルコール性脂肪肝」とは、単純性脂肪肝又は非アルコール性脂肪肝炎を指す。また、本発明において「治療」とは、非アルコール性脂肪肝の完治や根治だけではなく、非アルコール性脂肪肝の症状の軽減をも指す。

【0024】
本発明の治療用組成物の形態は特に限定されない。本発明の治療用組成物は、公知の製剤化技術によって所望の剤形(液剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、錠剤等)に調製できる。

【0025】
本発明の治療用組成物の使用量は特に限定されず、得ようとする治療効果に応じて適宜調整できる。例えば、β-クリプトキサンチンの血中濃度が、1時間~数日間(例えば、1~14日間)にわたって、0.2μg/mL~2.0μg/mLとなるように、単回又は複数回投与してもよい。また、本発明の治療用組成物は経口投与、静脈内投与、腹腔内投与等の投与方法で使用できる。また、本発明の治療用組成物の投与対象は、哺乳類(ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ等)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等であってもよい。

【0026】
本発明の治療用組成物は、脂肪の蓄積を抑制できるだけではなく、線維化や炎症をも抑制できるため、非アルコール性脂肪肝のうち、非アルコール性脂肪肝炎を好ましく治療できる。

【0027】
非アルコール性脂肪肝の治療効果は、非アルコール性脂肪肝や、該脂肪肝から生じる炎症、線維化において特徴的に発現する遺伝子(後述する)の発現の有無、その発現量、ALT(GPT)及びAST(GOT)等の測定結果を確認することで判断できる。また、肝臓組織の染色により、脂肪の蓄積量や、線維化及び/又は炎症の有無を確認することでも判断できる。炎症の有無は、組織中のクッパー細胞及び/又は星細胞等の活性化の有無を確認することで判断できる。

【0028】
<スクリーニング方法>
本発明者は、非アルコール性脂肪肝(高脂肪食や高コレステロール食の摂取によって生じた脂肪肝及び脂肪肝炎等)、及び、本発明の治療用組成物によって非アルコール性脂肪肝が治療された後の肝臓等における遺伝子発現プロファイルを、DNAマイクロアレイを用いて解析した。その結果、非アルコール性脂肪肝において特徴的に発現する遺伝子を特定した(表1参照)。従って、候補物質による、該遺伝子の発現の有無や発現量を検討し、所望の効果を奏する候補物質を選択することにより、本発明の治療用組成物と同様に非アルコール性脂肪肝を治療できる治療剤の候補物質をスクリーニングできる。

【0029】
具体的には、本発明のスクリーニング方法は、少なくとも1つの候補物質と、培養肝細胞とを接触させる接触工程と、上記接触工程の後に、β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を検出する検出工程と、β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現を抑制した候補物質を選択する選択工程と、を含む。なお、本発明において、「遺伝子」とは、DNA又はmRNAを指すが、DNAの発現は、PCRやサザンブロッティング等によって直接的に検出することができる。また、mRNAの発現は、逆転写PCRやノーザンブロッティング等によって直接的に検出することができる。また、ウエスタンブロッティング等によって、DNAやmRNAの発現に伴って合成されるタンパク質を検出することで、DNAやmRNAの発現を間接的に検出することもできる。また、本発明において遺伝子の発現が「抑制される」とは、β-クリプトキサンチンの投与の有無以外は同一の条件下で遺伝子の発現を比較した場合に、β-クリプトキサンチンを投与した場合における遺伝子の発現量が、β-クリプトキサンチンを投与しない場合における遺伝子の発現量よりも低いことを指す。

【0030】
接触工程において使用される培養肝細胞は、肝由来の細胞であれば特に限定されないが、マウス初代肝細胞、正常ヒト肝細胞、HepG2肝細胞、H4IIE肝細胞等が挙げられる。

【0031】
検出工程における、β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子の発現の有無や発現量は、DNAマイクロアレイ、リアルタイムPCR、ウエスタンブロッティング、免疫組織染色法等公知の方法で特定できる。「β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子」とは、β-クリプトキサンチンと接触した肝細胞内において発現が抑制される遺伝子を指す。具体的に、「β-クリプトキサンチンの投与により発現が抑制される遺伝子」としては、表1に記載されたヒトDNAが挙げられる。表1に記載されたヒトDNAのうち、C1QB、CD52、CD68、CD74、COL1A1、CYBA、CD64、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、LYZのうちのいずれか1つ以上は、非アルコール性脂肪肝において特徴的に誘導される遺伝子であり、該遺伝子の発現を抑制する候補物質を探索することにより、本発明の治療用組成物と同様の効果を奏する治療剤の候補物質を効率的にスクリーニングできる点で好ましい。

【0032】
【表1】
JP2017074077A_000003t.gif

【0033】
また、本発明の治療用組成物と同様に非アルコール性脂肪肝を治療できる候補物質のスクリーニングにおいては、C1QB、CD52、CD68、CD74、COL1A1、CYBA、CD64、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、LYZのうちのいずれか2つ以上の遺伝子を検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを備えるDNAチップを使用できる。また、本発明の治療用組成物と同様に非アルコール性脂肪肝を治療できる候補物質のスクリーニングにおいては、配列番号1~30記載の配列又はその相補配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを2種以上備えるDNAチップを使用できる。さらに、C1QB、CD52、CD68、CD74、COL1A1、CYBA、CD64、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、LYZのうちのいずれか2つ以上の遺伝子や、配列番号1~30記載の配列又はその相補配列に対応するタンパク質を検出可能なプロテインチップも使用できる。

【0034】
本発明のDNAチップやプロテインチップは公知の製造方法によって、基板にオリゴヌクレオチドプローブやタンパク質を配置することで得られ、該DNAチップ又はプロテインチップによって、候補物質の非アルコール性脂肪肝に対する治療効果を簡便に検討することができる。
【実施例】
【0035】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【0036】
<実施例1:β-クリプトキサンチンによる非アルコール性脂肪肝炎の治療効果-1>
(1)高脂肪高コレステロール食によって脂肪肝炎を誘導したマウス(図1中「CL」)、(2)高脂肪高コレステロール食によって脂肪肝炎を誘導した後に、β-クリプトキサンチンを摂取させたマウス(図1中「CL+CX」)のそれぞれの肝臓組織の染色を行った。なお、(2)のマウスには、β-クリプトキサンチン量が0.003質量%である試料を84日間にわたって摂食させた。
【実施例】
【0037】
なお、本試験において行った染色は下記の通りである。
(A)Hematoxylin Eosin染色(図1中「H&E」):該染色により、細胞核、細胞質等が染色される。脂肪は染色されず、白い部分として残る。
(B)Azan染色(図1中「Azan」):該染色により、線維化された部分が染色される。
(C)Sirius Red染色(図1中「Sirius Red」):該染色により、線維化された部分が染色される。
(D)αSMA染色(図1中「αSMA」):該染色により、活性化された星細胞を染色する。星細胞の活性化は、肝臓中に炎症反応が生じさせ、コラーゲンの過剰産生をもたらして肝臓中に沈着させる。
(E)F4/80染色(図1中「F4/80」):該染色により、活性化されたクッパー細胞を染色する。クッパー細胞の活性化は、肝臓中に炎症反応が生じていることを示す。
【実施例】
【0038】
図1に示される通り、β-クリプトキサンチンは、肝臓の脂肪化を抑制した(A)。また、β-クリプトキサンチンは、線維化を抑制した(B、C)。また、β-クリプトキサンチンは、炎症を抑制した(D、E)。
【実施例】
【0039】
<実施例2:β-クリプトキサンチンによる非アルコール性脂肪肝炎の治療効果-2>
(1)正常肝を有するマウス(図2中「コントロール」)、(2)高脂肪高コレステロール食によって脂肪肝炎を誘導したマウス(図2中「脂肪肝炎」)、(3)高脂肪高コレステロール食によって脂肪肝炎を誘導した後に、β-クリプトキサンチンを摂取させたマウス(図2中「脂肪肝炎+β-クリプトキサンチン」)のそれぞれの肝臓組織中の遺伝子発現を、DNAチップを用いて検討した。なお、(3)のマウスには、β-クリプトキサンチン量が0.003質量%である試料を84日間にわたって摂食させた。
【実施例】
【0040】
各遺伝子の発言量を蛍光強度の相対値として示した結果を図2に示す。なお、本試験で用いたDNAチップによって検出した遺伝子は図2の横軸に示される。
【実施例】
【0041】
なお、図2中のマウス遺伝子記号について、「Ccl6」、「H2-aa」、「H2-ab1」、「H2-eb1」、「Lyz2」は、それぞれ、表1中のヒト遺伝子記号「CCL15又はCCL23」、「HLA-DQA1又はHLA-DQA2」、「HLA-DQB1又はHLA-DQB2」、「HLA-DRB1又はHLA-DRB5」、「LYZ」に対応する。
【実施例】
【0042】
図2に示される通り、脂肪肝炎において特徴的に誘導される遺伝子の発現が、β-クリプトキサンチンの摂取によって低減されていた。脂肪肝炎において特徴的に誘導される遺伝子のうち、特に、C1qb、Cd52、Cd68、Cd74、Col1a1、Cyba、Cd64、H2-aa(HLA-DQA1又はHLA-DQA2)、H2-ab1(HLA-DQB1又はHLA-DQB2)、H2-eb1(HLA-DRB1又はHLA-DRB5)、Lyz2(LYZ)の発現が、β-クリプトキサンチンの摂取によって低減されていた。
図面
【図1】
0
【図2】
1