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明細書 :低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なDNA断片、プライマー及び品種識別方法

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第3569746号 (P3569746)
公開番号 特開2002-369688 (P2002-369688A)
登録日 平成16年7月2日(2004.7.2)
発行日 平成16年9月29日(2004.9.29)
公開日 平成14年12月24日(2002.12.24)
発明の名称または考案の名称 低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なDNA断片、プライマー及び品種識別方法
国際特許分類 C12N 15/09      
C12Q  1/68      
G01N 33/10      
FI C12N 15/00 ZNAA
C12Q 1/68 A
G01N 33/10
請求項の数または発明の数 5
全頁数 30
出願番号 特願2001-154200 (P2001-154200)
出願日 平成13年5月23日(2001.5.23)
審査請求日 平成13年5月23日(2001.5.23)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】501203344
【氏名又は名称】独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構
発明者または考案者 【氏名】佐藤 宏之
【氏名】鈴木 保宏
【氏名】井辺 時雄
【氏名】坂井 真
個別代理人の代理人 【識別番号】100091096、【弁理士】、【氏名又は名称】平木 祐輔
【識別番号】100096183、【弁理士】、【氏名又は名称】石井 貞次
審査官 【審査官】高堀 栄二
参考文献・文献 特開平04-104791(JP,A)
特開平05-153981(JP,A)
特開2000-201679(JP,A)
関東東海農業の新技術,No.17(2001.Mar.)p.19-23
調査した分野 BIOSIS/WPI(DIALOG)
CA(STN)
REGISTRY(STN)
JSTPlus(JOIS)
SwissProt/PIR/GeneSeq
GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq
特許請求の範囲 【請求項1】
配列番号1に示す塩基配列のうち、少なくとも27番目の塩基を含み、かつ連続する少なくとも20塩基からなる塩基配列を有するDNA断片。
【請求項2】
請求項1記載のDNA断片を含むプライマー。
【請求項3】
請求項1記載のDNA断片を含むプライマーを用い、識別対象の米のDNAに対してPCRを行い、得られる反応産物を分析することによって、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種であるか否かを識別する方法。
【請求項4】
配列番号2に示す塩基配列を有するDNA断片を含むプライマーをさらに用いる、請求項3記載の方法。
【請求項5】
配列番号3に示す塩基配列のうち連続する少なくとも20塩基からなる塩基配列を有するDNA断片を含むプライマー、及び配列番号4に示す塩基配列のうち連続する少なくとも20塩基からなる塩基配列を有するDNA断片を含むプライマーをさらに用いる、請求項3又は4記載の方法。
発明の詳細な説明
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なDNA断片、プライマー及び品種識別方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
米は胚乳デンプンを構成するアミロースとアミロペクチンの含有割合によって「もち米」と「うるち米」に大別される。「もち米」ではデンプンがアミロペクチンのみで構成されているが、「うるち米」のデンプンは約20%のアミロースと約80%のアミロペクチンから構成されており、米の胚乳デンプンに占めるアミロース成分の割合、すなわちアミロース含量は、デンプン粒結合型のアミロース合成酵素をコードする構造遺伝子であるwx座の対立遺伝子によって決定される。wx座は、胚乳デンプンのもち性及びうるち性を支配し、うるち性遺伝子(Wx)がもち性遺伝子(wx)遺伝子に対して優性である。この米のアミロース含量は、炊飯米の食味の良否に影響を与える重要な形質である。
【0003】
粘りの強い良食味米は、胚乳のアミロース含量を低減させることによって得ることができるので、近年、各種研究機関において、種々の低アミロース米品種が育成され、その作付面積は現在増加傾向にある。低アミロース米品種とは、通常のうるち米品種よりもアミロース含量が低い品種のことであり、具体的には、アミロース含量が0以上~15%未満の品種である。低アミロース品種としては、例えば、「コシヒカリ」に受精卵メチルニトロソウレア(MNU)処理を行い、アミロース含量に着目して選抜、育成された品種「ミルキークイーン」、低アミロース系統「74WX2N-1」に「レイメイ」を交配して育成された品種「スノーパール」、低アミロース由来系統「永系84271」に「キタアケ」を交配し、葯培養によって得られた植物体から選抜して育成された品種「彩」、低アミロース系統「探系2021」に「ニシホマレ」を交配して育成された「柔小町」、「研系2078」に「北陸127号」を交配して育成された品種「ソフト158」などがある。
【0004】
これら低アミロース米品種を通常のうるち米品種と識別する方法としては、1)低アミロース米品種の種子胚乳が白濁することに基づいた肉眼による識別法と、2)胚乳のアミロース含量を測定する方法の2つがある。しかしながら、胚乳の白濁度及びアミロース含量は、産地、生産年、栽培法及び収穫物の乾燥方法等によって変動するため、前記した2方法で低アミロース米品種と通常のうるち米品種の仕分けを確実に行うのは困難である。
【0005】
一方、遺伝子に着目した低アミロース米品種の識別方法が開発され、特定品種奥羽344号(現在の品種名はスノーパール)及び同品種と系譜が同じ品種をDNA配列に基づいて識別する方法が知られている(特開平12-201679号公報)。しかしながら、この方法は、奥羽344号を含む同系統における特異的な塩基配列に基づいた品種判別方法であるため、奥羽344号及び同系統品種と他品種とを識別することは可能であっても、奥羽344号以外の他系統の低アミロース米を識別することはできない。
【0006】
現在、米の品種等の農産物検査において、各品種に対する確実な検査方法の確立が望まれているが、未だ、低アミロース米品種のうち、ミルキークイーン及び同系統品種を他の低アミロース米及び通常のうるち米品種と識別する方法は報告されていない。このため、ミルキークイーン及び同系統品種の識別方法を確立するためには、前記の遺伝子に着目した低アミロース米品種の識別方法と同様に、ミルキークイーンに特異的な遺伝子を特定し、それに基づいた識別方法を開発する必要がある。しかしながら、ミルキークイーンはコシヒカリにMNU処理して育成された品種であるため、両者が非常に類似した特性及び遺伝子を有しており、ミルキークイーンとコシヒカリとの遺伝上の差異を明確にしなければ、ミルキークイーン及び同系統品種のみを特異的かつ効率的に他品種と識別することが困難であるため、コシヒカリと同品種の差別化が求められている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なDNA断片、プライマー及び品種識別方法を提供することを目的とする。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、低アミロース米品種ミルキークイーンが保有するDNA塩基配列に着目し、ミルキークイーン及び同系統品種に特異的なDNA配列を見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、うるち米他品種に存在しない特異的塩基を含むDNA断片である。
【0009】
また、本発明は、低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、うるち米他品種に存在しない特異的塩基を含むDNA断片をPCRにより特異的に増幅することが可能な、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーである。
【0010】
さらに、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーを用い、識別対象の米のDNAに対してPCRを行い、得られる反応産物を分析することによって、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種であるか否かを識別する方法である。
【0011】
【本発明の実施形態】
本発明の低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種の識別方法についてさらに詳細に説明する。
本発明において識別の対象となる低アミロース米品種は、ミルキークイーン及び同系統品種である。本発明における低アミロース米品種ミルキークイーンは、1998年5月に第6385号として品種登録されている、コシヒカリに受精卵メチルニトロソウレア処理を行い、変異第2代でアミロース含量に着目した個体選抜を行って育成されたアミロース含量が通常のうるち米よりも低い品種である。具体的には、アミロース含量がコシヒカリの3/5程度の約10%である品種である。ここで、品種とは、重要な形質に係る特性の全部又は一部によって他の植物体の集合と区別することができ、かつ、その特性の全部を保持しつつ繁殖させることができる一の植物体の集合を意味する。
【0012】
また、同系統品種とは、ミルキークイーンを交配親に用いて育成され得る品種のことを意味する。例えば、ミルキークイーンの食味をそのままに栽培特性を改良した新系統「越南d190号」、「上育436号」等がある。
一方、うるち米他品種とは、上記のミルキークイーン及び同系統品種以外の品種を意味し、通常のコシヒカリ等のうるち米、並びに、ミルキークイーン及び同系統品種以外の低アミロース米を含む。
【0013】
品種識別対象となる米のDNAの採取源としては特に限定されるものではなく、植物体のいずれの組織からも抽出できるが、例えば、穂、葉、根、種子、精米、玄米、さらに炊飯米等からも抽出することができる。遺伝子を調製する方法としては、当業者に利用可能なものであればいずれの方法(例えば、CTAB法)をも利用できる。
本発明の品種識別には、低アミロース米品種ミルキークイーンにおけるアミロース合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列と、通常のうるち米のアミロース合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列の相違を利用する。
【0014】
コシヒカリ等の通常のうるち米品種は、wx座に優性のうるち遺伝子Wxを保有していることが知られている(文献:奥野(1995)「米の科学」竹生新治郎編 朝倉書店P61-76)。一方、ミルキークイーンの低アミロース性は、wx座の劣性遺伝子wx-1(t)によって支配されていることがわかった。この低アミロース米品種ミルキークイーンのwx-1(t)の全塩基配列は、配列番号5に示すとおりである。wx-1(t)とWxのDNA配列を比較すると相違する特異的塩基はわずかに2塩基である。第1相違塩基は、Wxの第4エクソン中のコドン158部位のGがミルキークイーンのwx-1(t)ではAであり、そのアミノ酸はアルギニンがヒスチジンに変化している。また、第2相違DNAは、Wxの第5エクソン中のコドン191部位のTがwx-1(t)ではCであり、そのアミノ酸はチロシンがヒスチジンに変化している。
【0015】
本発明では、前記の低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーを用い、識別対象の米のDNAに対してPCRを行い、得られる反応産物を分析することによって、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種であるか否かを識別することができる。
【0016】
本発明のPCRに用いるプライマーは、低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、通常のうるち米品種に存在しない特異的塩基を含むDNA断片をPCRにより増幅することが可能な、低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種とうるち米他品種を識別し得るプライマーであれば任意に設計することができる。具体的には、前記DNA断片を増幅し得るプライマーを用いることができ、1)第1相違塩基のみを含むDNA配列を増幅し得るプライマー、2)第2相違塩基のみを含むDNA配列を増幅し得るプライマー、3)第1相違塩基及び第2相違塩基の両方を含むDNA配列を増幅し得るプライマー等が含まれる。これらプライマーは、通常の化学合成により得ることができ、その位置は適宜設定可能であるが、相違塩基を含むプライマーが好ましく、そのうち、変異遺伝子の検出感度を増すために、3’末端を識別目的の前記相違塩基となるように設計するのがさらに好ましい。また、そのサイズは20~30mer程度が適当である。なお、これらのプライマーのうち、1)のプライマーは、第1相違塩基部位と第2相違塩基部位が近接しているため、後述する電気泳動を行う際に支障をきたす可能性があり、また、2)のプライマーは、第2相違塩基部位付近のGC含量及びTm値の関係から、3’末端を識別目的にあわせて設計するのが難しいことから、3)のプライマーを利用するのが好適である。なお、3)の第1相違塩基及び第2相違塩基の両方を含むDNA配列を増幅し得るプライマーとしては次のプライマーセットがある。
【0017】
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【0018】
また、プライマーは、上記の低アミロース米品種ミルキークイーンのwx-1(t)に特異的なDNAマーカーを増幅し得るプライマーだけでなく、うるち米他品種と低アミロース米品種ミルキークイーンのwx-1(t)とに共通なDNA領域を増幅し得るプライマーとを組み合わせて用いることができる。一例として、次のプライマーセットを上記W1及びW2と組みあわせて用いることができる。
【0019】
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【0020】
低アミロース米品種ミルキークイーンに存在し、うるち米他品種に存在しない特異的塩基を含むDNAの検出は、基本的に前述のW1及びW2のプライマーセットのみの使用でも可能であるが、PCRの機種や反応条件によっては、うるち米他品種においてもW1及びW2のプライマーセットによる薄いバンドが得られることもあるので、うるち米他品種と低アミロース米品種ミルキークイーンのwx-1(t)とに共通なDNA領域を増幅し得るW3及びW4などのプライマーセットを用いて対照区を設定することによって、PCR反応の成否を更に精度よく確認することができる。
【0021】
PCRの反応工程は、熱変性:93~95℃で30~60秒、アニーリング:60~70℃で30~60秒、伸長反応:72℃で60~300秒で行う。好ましくは、熱変性:94℃で60秒、アニーリング:69℃で60秒、伸長反応:72℃で120秒を1サイクルとし、これを25~35回、好ましくは 28~30回行う。
【0022】
次に、このPCRによって得られた反応産物は、電気泳動及び分光光度計によって分析することができるが、このうち、電気泳動が好ましい。電気泳動分析は常法によって行えばよい。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドのゲル中で電圧をかけて電気泳動し、分離したDNAパターンを分析する。前記W1及びW2のプライマーを用いてPCRを行った場合、電気泳動分析により、wx-1(t)を保有するミルキークイーン及び同系統品種では741bpのバンドが出現するが、同遺伝子を保有しないコシヒカリ等の通常のうるち米品種ではバンドは出現しない。また、前記W1~W4のプライマーを用いてPCRを行った場合、wx-1(t)を保有するミルキークイーン及び同系統品種では741bpと469bpの2本のバンドが出現するが、同遺伝子を保有しないコシヒカリ等の通常のうるち米品種では741bpのバンドは出現せず、469bpの1本のバンドのみが出現する。
【0023】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例1] wx-l(t)遺伝子及びWx遺伝子のDNA配列の決定
ミルキークイーン及び比較品種であるコシヒカリの出穂14日後の穂からそれぞれRNAを抽出した。抽出にはQiagen社のRneasy plant mini kitを使用した。得られたRNAは、タカラ(株)のHigh fidelity RT-PCRキットを用いた逆転写反応に供し、wx-1(t)及びWx遺伝子の全長cDNAをそれぞれ得た。
【0024】
逆転写反応に必要な機材には,タカラ(株)のPCR Thermal cycler MPを用いた。次に、得られたcDNAをそれぞれNovagen社のプラスミドベクターpT-7 blue-T vectorに組み込み、シークエンスプライマーを用いた塩基配列の決定操作を行った。塩基配列の決定にはABI社の377オートシークエンサーを用いて解析を行った。その結果、塩基配列wx-1(t)(配列番号5)及び対応するアミノ酸配列(配列番号6)、並びに塩基配列Wx(配列番号7)及び対応するアミノ酸配列(配列番号8)が得られた。
これらのDNA配列を比較したところ、両配列の相違はわずか2塩基であることが判明した。すなわち、wx-1(t)はこの相違部位にAとCを保有し、一方、WxはGとTを保有することが分かった(図1)。
【0025】
[実施例2]wx-1(t)遺伝子に特異的なDNA配列を利用した品種識別法
(1)プライマー
PCRを用いた品種識別を行うため、以下の4つのプライマーを設計した。
すなわち、W1及びW2は、ミルキークイーン及び同系統品種が保有するwx-1(t)遺伝子に特異的な部位を増幅可能なプライマーであり、PCRにより741bpの増幅産物が得られる。なお、W1はWx-1(t)に特異的な第1相違塩基「A」を末端に含んでいるプライマーである。
また、W3及びW4は、ミルキークイーン及び同系統品種とコシヒカリ等の通常のうるち米品種に共通の部位を増幅可能なプライマーであり、PCRにより469bpの増幅産物が得られる。
【0026】
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【0027】
(2)PCR
パーキンエルマー社のAmplitaq 2.5U、Amplitaq に付属の10×Buffer 5μl、2mM dNTP 5μl、50ng DNA、W1、W2、W3及びW4プライマー各20pmolを含む最終容量50μlの反応液を調製した。PCR反応に必要な機材には前記したタカラ(株)のPCR Thermal cycler MPを用い、94℃で1分間反応後、94℃で1分間、69℃で1分間及び72℃で2分間の一連の反応を28回行い、最後に72℃で4分間反応させた。
【0028】
(3)電気泳動分析
反応液を5μl採り、0.8%アガロースゲルにローディングし、100Vで40分間電気泳動を行った。DNA分子量マーカーとしては、φx174/HaeIIIを用いた。得られた結果を図2に示す。
【0029】
ミルキークイーンにおいては、W1、W2、W3及びW4の4つのプライマーの配列が全てwx-1(t)遺伝子の塩基配列に含まれるため、PCRにより741bpと469bpの2つのバンドが増幅した。一方、コシヒカリ等の通常のうるち米品種においては、W1プライマーのみ配列がWx遺伝子の塩基配列と異なり、PCRにより741bpのバンドは増幅せず469bpのバンドのみが増幅した。
【0030】
【発明の効果】
以上のことから、本発明の低アミロース米品種ミルキークイーン及び同系統品種と通常のうるち米品種を識別し得るプライマーを用いてPCRにより増幅したバンドを確認することによって、ミルキークイーン及び同系統品種とコシヒカリ等の通常のうるち米品種とを識別することが可能である。
【0031】
【配列表】
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【0032】
【配列表フリーテキスト】
配列番号1:合成DNA
配列番号2:合成DNA
配列番号3:合成DNA
配列番号4:合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図1】wx-1(t)遺伝子に特異的なDNA配列を検出し得るプライマー、W1~W4の配置図及び品種識別の原理を示す図である。
【図2】wx-l(t)遺伝子に特異的なDNA配列を検出し得るプライマーの一例を用いたPCR反応結果を示す図である。図中、Kはコシヒカリ、Mはミルキークイーンを示す。また、マーカーはφx174/HaeIIIである。
図面
【図1】
0
【図2】
1