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明細書 :セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第2995289号 (P2995289)
公開番号 特開平11-046773 (P1999-046773A)
登録日 平成11年10月29日(1999.10.29)
発行日 平成11年12月27日(1999.12.27)
公開日 平成11年2月23日(1999.2.23)
発明の名称または考案の名称 セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体
国際特許分類 C12N 15/09      
C12N 11/21      
C12N  1/21      
C12R  1:19      
FI C12N 15/00 ZNAA
C12N 11/21
請求項の数または発明の数 3
全頁数 11
出願番号 特願平09-221193 (P1997-221193)
出願日 平成9年8月4日(1997.8.4)
新規性喪失の例外の表示 特許法第30条第1項適用申請有り 平成9年2月17日 農林水産技術会議事務局研究開発課食品総合研究所発行の「糖質の構造改変による高機能性素材の開発に関する総合研究 研究成果検討会議資料」に発表
審査請求日 平成9年8月4日(1997.8.4)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】591031360
【氏名又は名称】農林水産省食品総合研究所長
発明者または考案者 【氏名】林 清
【氏名】リュウ アイミン
【氏名】リー ヘビアオ
【氏名】原口 和朋
【氏名】北村 義明
個別代理人の代理人 、【弁理士】、【氏名又は名称】久保田 藤郎
審査官 【審査官】斎藤 真由美
調査した分野 C12N 15/00 - 15/90
C12N 1/00 - 1/38
特許請求の範囲 【請求項1】
配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子。

【請求項2】
請求項1記載のセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子を含むプラスミドベクター。

【請求項3】
請求項2記載のプラスミドベクターで形質転換された形質転換体。
発明の詳細な説明 【発明の詳細な説明】

【01】

【発明の属する技術分野】本発明は、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換体に関する。セロビオースフォスフォリラーゼ(EC2.4.1.20)は、セロビオースを加リン酸分解する酵素であり、セロビオースとリン酸を原料としてグルコース-1-リン酸とグルコースが得られる。また、キトビオースを原料にしてグルコサミン-1-リン酸を、ラクトースを原料にしてガラクトース-1-リン酸を合成することができる。この酵素は、上記の反応の逆反応、すなわちグルコース-1-リン酸とグルコースからセロビオースを合成する反応なども進行させることができる。このように、リン酸糖や各種2糖類の合成に利用される酵素である。

【02】

【従来の技術】上記したように、セロビオースフォスフォリラーゼは、各種のリン酸糖の合成反応やその逆反応による2糖類の合成に関与する酵素である。逆反応では、グルコースの他に2-アミノ-2-デオキシ-D-グルコース、マンノース、2-アミノ-2-デオキシ-D-マンノース、2-デオキシ-D-グルコース、6-デオキシ-D-グルコース、D-キシロース等の糖類を使用して様々なヘテロ2糖類を合成することができる。これらのリン酸糖や2糖類は、食品用素材,医薬品用素材などとして、今後の開発が期待される有用な物質である。しかしながら、従来はセロビオースフォスフォリラーゼとしては、セルビブリオ(Cellvibrio)属及びクロストリジウム(Clostridium)属微生物菌体から抽出したものが粗酵素あるいは精製酵素として利用されているにすぎず、該酵素を安定的に生産して工業的利用の向上を図ることは行われていなかった。

【03】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、セロビオースフォスフォリラーゼの一層の活用を図るため、該酵素の遺伝子をクローニングすることによって、遺伝子の構造を解明し、遺伝子を発現させて該酵素の工業的な生産に寄与することである。

【04】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、セロビオースフォスフォリラーゼの構造遺伝子を解明するために研究を重ねた結果、該酵素の生産能を有するセルビブリオ属微生物からセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成した。

【05】
請求項1記載の本発明は、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子である。請求項2記載の本発明は、請求項1記載のセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子を含むプラスミドベクターである。請求項3記載の本発明は、請求項2記載のプラスミドベクターで形質転換された形質転換体である。

【06】

【発明の実施の形態】本発明者らは、セロビオースフォスフォリラーゼ生産能を有するセルビブリオ属由来の細菌から抽出したセロビオースフォスフォリラーゼを高度に精製し、そのN末端のアミノ酸配列を決定した。さらに、このセロビオースフォスフォリラーゼを酵素分解してペプチドフラグメントを調製し、それらのアミノ酸配列を決定した。次いで、それらのアミノ酸配列から確認できた塩基配列を基にしてプライマーを作製した(配列表の配列番号13及び14参照)。これを用いて、セルビブリオ属菌株から抽出したゲノムDNAを鋳型として行ったポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)により、DNA塩基配列を有する820bpの明瞭なバンドを得た。

【07】
得られたバンド(PCR産物)をクローニングし、DNAシークエンサーで分析してDNA塩基配列を解読した(配列表の配列番号15参照)。このDNA塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られたペプチドフラグメント(配列表の配列番号3~7参照)に相当するアミノ酸配列が認められたことから、これらのペプチドフラグメントが、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子の一部であることが判明した。

【08】
そこで、このPCR産物をプローブとして、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子のクローニングを実施した。まず、セルビブリオ属の細菌から抽出したゲノムDNAを酵素分解後、ラムダファージに in vitro パッケージングし、ファージライブラリーを作成した。このファージライブラリーの中から、前記のPCR産物をプローブとして、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子をもつファージをスクリーニングし、得られた陽性ファージから該遺伝子を抽出した。さらに、このファージから遺伝子を抽出し、制限酵素で分解し、得られたDNA断片についてサザンハイプリダイゼーションを行った。その結果、この3.1KbpのDNA断片に、目的とするアミノベプチダーゼ遺伝子の存在を確認した。上記のセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子を有するフラグメントをサブクローニングして、プラスミドを作製した。このプラスミドを用いて、常法により大腸菌に形質転換し、形質転換体を得た。

【09】
以下に、本発明を詳しく説明する。前記したように、本発明のセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子は、セロビオースフォスフォリラーゼ生産能を有するセルビブリオ属微生物に由来するものである。このようなセロビオースフォスフォリラーゼ生産能を有するセルビブリオ属微生物の菌株としては、セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) ATCC 13127 株等がある。

【10】
セロビオースフォスフォリラーゼは、上記微生物菌体から得ることができる。具体的には、上記の菌株を常法に従い栄養培地で培養後、培養物から菌体を分離した後、該菌体を常法により破砕、遠心分離してセロビオースフォスフォリラーゼ画分を得る。次に、カラムクロマトグラフィー、FPLC、HPLC等の精製手段を用いることにより、高度に精製したセロビオースフォスフォリラーゼを得ることができる。

【11】
次に、この精製したセロビオースフォスフォリラーゼのN末端のアミノ酸配列を決定した。配列の決定には、プロテインシーケンサー477A型(パーキンエルマー社製)を用いた。決定したN末端のアミノ酸配列は、配列表の配列番号2に示す通りである。さらに、このセロビオースフォスフォリラーゼを酵素分解して、ペプチドフラグメントを調製し、それらのアミノ酸配列を決定した(配列表の配列番号3~12参照)。

【12】
解読できたアミノ酸配列から塩基配列を解読し、これをもとに作製したプライマー(配列番号13および配列番号14参照)を用いて、セルビブリオ属菌株から抽出したゲノムDNAを鋳型としてPCR反応を行った。その結果、DNA塩基配列を有する820bpの明瞭なバンドを得た。得られたバンド(PCR産物)をクローニングし、DNAシークエンサーで分析してDNA塩基配列を解読した(配列表の配列番号15参照)。このDNA塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られたペプチドフラグメント(配列表の配列番号3~7参照)に相当するアミノ酸配列が認められたことから、これらのペプチドフラグメントが、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子の一部であることが判明した。

【13】
そこで、このPCR産物をプローブとして、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子のクローニングを実施した。まず、セルビブリオ属の細菌からDNAを抽出し、制限酵素で切断して得た画分を、ラムダファージに in vitro パッケージングし、ファージライブラリーを作成した。ファージライブラリーの中から、前記のPCR産物をプローブとして用いて、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子をもつファージをスクリーニングし、陽性ファージを得た。

【14】
この陽性ファージから該遺伝子を抽出し、制限酵素を作用させて得られた部分分解物を、アガロースゲル電気泳動で分離後、サザンハイブリダイゼーション(「クローニングとシークエンス」、渡辺監修、農村文化社、1989年、157頁)を行った。その結果、3.1KbpのDNA断片に目的とするセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子の存在を確認した。本発明のセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子は、配列表の配列番号1記載の塩基配列を有する。本発明に係るセロビオースフォスフォリラーゼは、新規なアミノ酸配列を有する酵素であり、これと65%以上の相同性が認められる蛋白質は見当たらなかった。

【15】
次に、この3.1KbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動で調製し、DNAライゲーションキット(宝酒造株式会社製)を用いて、予め脱リン酸処理しておいたプラスミドにサブクローニングし、プラスミドpUC-2 を調製した。さらに、このプラスミドを、大腸菌に形質転換した。形質転換された大腸菌(E.coli pUC-2)は、工業技術院生命工学工業技術研究析に寄託されており、その受託番号はFERM BP-6033である。なお、プラスミドpUC-2 にはセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子が含まれている。

【16】
セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子の発現は、以上のようにして得た形質転換体である大腸菌を培養し、その大腸菌及び培養上清中のセロビオースフォスフォリラーゼを測定して確認することができる(Journal of Biochemistry, 112巻, 40-44 頁, 1992年) 。また、この形質転換体を栄養培地に20~37℃で1~3日間培養し、得られた菌体を破砕したあと、固液分離して得た上清を常法により精製してセロビオースフォスフォリラーゼを得ることができる。

【17】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例1
セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) ATCC 13127 株を栄養培地に培養したのち、培養物から菌体を分離した。次いで、該菌体を常法により破砕した後、遠心分離を行い破砕液を得、疎水クロマトグラフィー,イオン交換クロマトグラフィーを活用し、高度に精製したセロビオースフォスフォリラーゼを得た。

【18】
この精製セロビオースフォスフォリラーゼについて、プロテインシーケンサー477A型(パーキンエルマー社製)により、そのN末端のアミノ酸配列を決定した。決定した配列を配列表の配列番号2に示す。さらに、このセロビオースフォスフォリラーゼをリシルエンドペプチダーゼ(メルク社製)で分解してペプチドフラグメントを調製し、10種類のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列を配列表の配列番号3~12に示す。

【19】
解読できたアミノ酸配列の中から、コドンの縮重の少ない領域を選び出し、その領域について6箇所のフォーワードプライマーおよび6箇所のリバースプライマーを作成した。これらを組み合わせ、セルビブリオ・ギルバス ATCC 13127 株のゲノムDNAを鋳型とし、PCR反応により増幅させた。その結果、これらのプライマーの組合せのうち、配列表の配列番号13に記載したフォーワードプライマーと、配列表の配列番号14に記載したリバースプライマーとを用いて行ったPCR反応により、820bpの明瞭なバンドが得られた。

【20】
得られたバンドをクローニングし、DNAシークエンサーで分析したところ、配列表15に記載のDNA塩基配列が得られた。このDNA塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られたペプチドフラグメントのうち、配列表の配列番号3~7に記載のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が認められた。このことから、これらのペプチドフラグメントは、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子の一部であることが判明した。そこで、このPCR産物をプローブとして、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子のクローニングを実施した。

【21】
一方、セルビブリオ・ギルバス ATCC 13127 株から、斉藤の方法(蛋自質核酸酵素、11巻、446頁)によりゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを制限酵素 Sau III AI で切断して部分分解し、超遠心分離することにより約20Kbpの画分を得た。この画分を、ギガパックIIゴールド(ストラタジーン社製)を用いて、ラムダファージに in vitro パッケージングし、ファージライブラリーを作成した。

【22】
ここで、前記のプローブを用いて、常法(「クローニングとシークエンス」、渡辺監修、農村文化社、1989年、134頁)によりファージライブラリーからセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子をもつファージをスクリーニングした。その結果、5個の陽性ファージを得た。さらに、このファージから遺伝子を抽出し、制限酵素 Sac I及びPst I で部分分解し、得られた制限酵素分解物をアガロースゲル電気泳動で分離後、サザンハイプリダイゼーション(「クローニングとシークエンス」、渡辺監修、農村文化社、1989年、157頁)を行った。その結果、3.1KbpのDNA断片に、目的とするセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子の存在を確認した。

【23】
次に、Sambrook,J.,Fritsch, E. F. and Maniatis, T."Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第2版”6.3章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、この3.1Kbpのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により調製した。一方、プラスミドpUC-18を制限酵素 Sac I及びPst I で分解し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸処理した。この脱リン酸処理プラスミドに、DNAライゲーションキット(宝酒造株式会社製)を用いて、先の3.1Kbpのフラグメントを常法(「クローニングとシークエンス」、渡辺監修、農村文化社、1989年、134頁記載の方法)によりサブクローニングして、プラスミドpUC-2 を調製した。

【24】
さらに、このプラスミドを用いてSambrook,J.,Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第2版”1.74章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌に形質転換した。形質転換された大腸菌は、工業技術院生命工学工業技術研究析に寄託されており、その受託番号はFERM BP-6033である。なお、プラスミドpUC-2にはセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子が含まれている。

【25】
以上のようにして得た形質転換体から、プラスミドpUC-2 を多量に調製し、dローダミン・ターミネーター・サイクルシークエンシング・キット(パーキンエルマー社製)を用いて塩基配列を解読した。解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせることにより、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子を構成した。該遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は、配列表の配列番号1に示す通りである。

【26】
この配列表の配列番号1に示したアミノ酸配列からなるセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子を、先に判明しているアミノ酸配列と比較した。その結果、セロビオースフォスフォリラーゼのN末瑞のアミノ酸配列(配列表の配列番号2参照)は、配列番号1に示したアミノ酸配列中の1~42番目の配列と一致した。さらに、セロビオースフォスフォリラーゼ由来のペプチドフラグメントの配列(配列表の配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12参照)は、それぞれ配列番号1に示したアミノ酸配列中の90~114番目、115~131番目、132~142番目、189~219番目、235~252番目、278~288番目、289~319番目、411~424番目、551~557番目及び590~618番目の配列と一致した。

【27】
また、活性型セロビオースフォスフォリラーゼの分子量を、島津製作所、レーザーイオン化 TOF-MS KOMPACT MALDI III 型で測定したところ、91,000ダルトンであり、本遺伝子でコードされる蛋白の分子量90,813と良く一致していた。

【28】
以上の結果より、塩基配列中にセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子を見出した。すなわち、セロビオースフォスフォリラーゼの構造遺伝子は塩基配列中の359番目以降2827番目までの間に存在することが確認された。

【29】

【発明の効果】本発明によれば、セロビオースフォスフォリラーゼの遺伝子が提供される。これを発現させることにより得られる酵素は、加リン酸反応あるいはその逆反応を進行させて、食品加工及び医薬品工業の分野において有用な各種リン酸糖やヘテロ2糖類を効率よく製造することができる。

【30】

【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:3157
配列の型:核酸
鎖の数:2本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
プラスミド名:pUC-2
配列の特徴
特徴を表す記号:mat peptide
存在位置:359..2824
特徴を決定した方法:E
配列
GAGCTCGGCC CTGATGTCAC GGTCGGAGAG CAGCACGGGC CCACGGTAGT GCCCCGGACG 60
GGTGTCCGGG GCCGTCCGCC CACGCCCGTC CACGCTCCTC CCACACCGTT CCCACACCCC 120
TGTGCGAGCG TCGCGCAGCC CGCCCGGGGC GCCCGGCCGG AGGGTGCGCA CGGACGTGCG 180
ACCTGCGCCC GTTCTCGTCG GGACCCGCGG CGGCTATGAT CCCTCTCGTG AGGCGCGTGG 240
GAGCGCTCTC GCACCGACCA TGAGCCGCGT CAGAGCCTCG ACGCCGACCC GCACGGACGC 300
GGACGGCCGA CCGGGGGGCC GGGCGCGACA CAACCCGAGC ACCCGAGGGG CACCACCG 358
ATG CGG TAC GGC CAT TTC GAC GAC GCG GCG CGC GAG TAC GTC ATC ACG 406
Met Arg Tyr Gly His Phe Asp Asp Ala Ala Arg Glu Tyr Val Ile Thr
1 5 10 15
ACG CCT CAC ACC CCC TAC CCG TGG ATC AAC TAC CTC GGG TCG GAG CAG 454
Thr Pro His Thr Pro Tyr Pro Trp Ile Asn Tyr Leu Gly Ser Glu Gln
20 25 30
TTC TTC TCG CTG CTC TCC CAC CAG GCC GGC GGC TAC TCG TTC TAC CGC 502
Phe Phe Ser Leu Leu Ser His Gln Ala Gly Gly Tyr Ser Phe Tyr Arg
35 40 45
GAC GCC AAG ATG CGG CGG CTC ACG CGC TAC CGC TAC AAC AAC ATC CCC 550
Asp Ala Lys Met Arg Arg Leu Thr Arg Tyr Arg Tyr Asn Asn Ile Pro
50 55 60
GCG GAC GCG GGC GGC CGG TAC CTG TAC GTC AAC GAC GGC GGC GAC GTG 598
Ala Asp Ala Gly Gly Arg Tyr Leu Tyr Val Asn Asp Gly Gly Asp Val
65 70 75 80
TGG ACC CCG TCG TGG CTG CCG GTC AAG GCG GAC CTG GAC CAC TTC GAG 646
Trp Thr Pro Ser Trp Leu Pro Val Lys Ala Asp Leu Asp His Phe Glu
85 90 95
GCG CGC CAC GGC CTC GGC TAC TCG CGC ATC ACG GGC GAG CGC AAC GGC 694
Ala Arg His Gly Leu Gly Tyr Ser Arg Ile Thr Gly Glu Arg Asn Gly
100 105 110
CTG AAG GTC GAG ACG CTC TTC TTC GTC CCG CTC GGC GAG AAC GCC GAG 742
Leu Lys Val Glu Thr Leu Phe Phe Val Pro Leu Gly Glu Asn Ala Glu
115 120 125
GTG CAG AAG GTC ACC GTC ACC AAC ACG TCC GAC GCC CCG AAG ACG GCG 790
Val Gln Lys Val Thr Val Thr Asn Thr Ser Asp Ala Pro Lys Thr Ala
130 135 140
ACG CTG TTC TCG TTC GTC GAG TTC TGC CTG TGG AAC GCG CAG GAC GAC 838
Thr Leu Phe Ser Phe Val Glu Phe Cys Leu Trp Asn Ala Gln Asp Asp
145 150 155 160
CAG ACG AAC TAC CAG CGC AAC CTG TCG ATC GGC GAG GTC GAG GTC GAG 886
Gln Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Leu Ser Ile Gly Glu Val Glu Val Glu
165 170 175
CAG GAC GGC CCG CAC GGC TCG GCG ATC TAC CAC AAG ACC GAG TAC CGC 934
Gln Asp Gly Pro His Gly Ser Ala Ile Tyr His Lys Thr Glu Tyr Arg
180 185 190
GAG CGC CGC GAC CAC TAC GCC GTG TTC GGC GTG AAC ACC CGC GCG GAC 982
Glu Arg Arg Asp His Tyr Ala Val Phe Gly Val Asn Thr Arg Ala Asp
195 200 205
GGC TTC GAC ACG GAC CGC GAC ACG TTC GTG GGC GCG TAC AAC TCG CTG 1030
Gly Phe Asp Thr Asp Arg Asp Thr Phe Val Gly Ala Tyr Asn Ser Leu
210 215 220
GGC GAG GCG TCC GTC CCG CGC GCC GGG AAG TCC GCG GAC TCG GTC GCG 1078
Gly Glu Ala Ser Val Pro Arg Ala Gly Lys Ser Ala Asp Ser Val Ala
225 230 235 240
TCG GGC TGG TAC CCG ATC GGC TCG CAC TCC GTC GCC GTG ACG CTG CAG 1126
Ser Gly Trp Tyr Pro Ile Gly Ser His Ser Val Ala Val Thr Leu Gln
245 250 255
CCC GGC GAG TCC CGC GAC CTC GTC TAC GTG CTG GGC TAC CTG GAG AAC 1174
Pro Gly Glu Ser Arg Asp Leu Val Tyr Val Leu Gly Tyr Leu Glu Asn
260 265 270
CCC GAC GAG GAG AAG TGG GCC GAC GAC GCC CAC CAG GTC GTC AAC AAG 1222
Pro Asp Glu Glu Lys Trp Ala Asp Asp Ala His Gln Val Val Asn Lys
275 280 285
GCG CCC GCG CAC GCG CTG CTG GGC CGG TTC GCG ACG AGC GAG CAG GTC 1270
Ala Pro Ala His Ala Leu Leu Gly Arg Phe Ala Thr Ser Glu Gln Val
290 295 300
GAC GCC GCC CTG GAG GCG CTG AAC TCC TAC TGG ACG AAC CTG CTC TCG 1318
Asp Ala Ala Leu Glu Ala Leu Asn Ser Tyr Trp Thr Asn Leu Leu Ser
305 310 315 320
ACG TAC TCG GTG TCG AGC ACC GAC GAG AAG CTC GAC CGG ATG GTC AAC 1366
Thr Tyr Ser Val Ser Ser Thr Asp Glu Lys Leu Asp Arg Met Val Asn
325 330 335
ATC TGG AAC CAG TAC CAG TGC ATG GTC ACG TTC AAC ATG TCG CGC TCG 1414
Ile Trp Asn Gln Tyr Gln Cys Met Val Thr Phe Asn Met Ser Arg Ser
340 345 350
GCG TCG TTC TTC GAG ACG GGC ATC GGC CGC GGG ATG GGC TTC CGC GAC 1462
Ala Ser Phe Phe Glu Thr Gly Ile Gly Arg Gly Met Gly Phe Arg Asp
355 360 365
TCC AAC CAG GAC CTC CTG GGC TTC GTG CAC CTG ATC CCG GAG CGC GCG 1510
Ser Asn Gln Asp Leu Leu Gly Phe Val His Leu Ile Pro Glu Arg Ala
370 375 380
CGC GAG CGG ATC ATC GAC ATC GCC TCG ACG CAG TTC GCG GAC GGC TCG 1558
Arg Glu Arg Ile Ile Asp Ile Ala Ser Thr Gln Phe Ala Asp Gly Ser
385 390 395 400
GCG TAC CAC CAG TAC CAG CCG CTC ACG AAG CGC GGG AAC AAC GAC ATC 1606
Ala Tyr His Gln Tyr Gln Pro Leu Thr Lys Arg Gly Asn Asn Asp Ile
405 410 415
GGC TCG GGC TTC AAC GAC GAC CCG CTG TGG CTC ATC GCG GGC GTG GCG 1654
Gly Ser Gly Phe Asn Asp Asp Pro Leu Trp Leu Ile Ala Gly Val Ala
420 425 430
GCG TAC ATC AAG GAG TCC GGC GAC TGG GGC ATC CTC GAC GAG CCC GTG 1702
Ala Tyr Ile Lys Glu Ser Gly Asp Trp Gly Ile Leu Asp Glu Pro Val
435 440 445
CCG TTC GAC AAC GAG CCC GGC TCC GAG GTC CCG CTG TTC GAG CAC CTG 1750
Pro Phe Asp Asn Glu Pro Gly Ser Glu Val Pro Leu Phe Glu His Leu
450 455 460
ACG CGC TCC TTC CAG TTC ACG GTG CAG AAC CGC GGC CCG CAC GGC CTG 1798
Thr Arg Ser Phe Gln Phe Thr Val Gln Asn Arg Gly Pro His Gly Leu
465 470 475 480
CCG CTC ATC GGC CGT GCC GAC TGG AAC GAC TGC CTC AAC CTC AAC TGC 1846
Pro Leu Ile Gly Arg Ala Asp Trp Asn Asp Cys Leu Asn Leu Asn Cys
485 490 495
TTC TCG ACG ACC CCG GGC GAG TCG TTC CAG ACG ACC GAG AAC CAG GCG 1894
Phe Ser Thr Thr Pro Gly Glu Ser Phe Gln Thr Thr Glu Asn Gln Ala
500 505 510
GGC GGC GTC GCG GAG TCC GTG TTC ATC GCG GCG CAG TTC GTG CTC TAC 1942
Gly Gly Val Ala Glu Ser Val Phe Ile Ala Ala Gln Phe Val Leu Tyr
515 520 525
GGC GCG GAG TAC GCC ACG CTC GCG GAG CGT CGC GGC CTC GCG GAC GTC 1990
Gly Ala Glu Tyr Ala Thr Leu Ala Glu Arg Arg Gly Leu Ala Asp Val
530 535 540
GCC ACC GAG GCG CGC AAG TAC GTC GAC GAG GTG CGT GCC GCG GTG CTC 2038
Ala Thr Glu Ala Arg Lys Tyr Val Asp Glu Val Arg Ala Ala Val Leu
545 550 555 560
GAG CAC GGC TGG GAC GGC CAG TGG TTC CTG CGT GCC TAC GAC TAC TAC 2086
Glu His Gly Trp Asp Gly Gln Trp Phe Leu Arg Ala Tyr Asp Tyr Tyr
565 570 575
GGC AAC CCG GTC GGC ACG GAC GCC AAG CCC GAG GGC AAG ATC TGG ATC 2134
Gly Asn Pro Val Gly Thr Asp Ala Lys Pro Glu Gly Lys Ile Trp Ile
580 585 590
GAG CCG CAG GGC TTC GCC GTC ATG GCG GGC ATC GGC GTC GGC GAG GGC 2182
Glu Pro Gln Gly Phe Ala Val Met Ala Gly Ile Gly Val Gly Glu Gly
595 600 605
CCG GAC GAC GCG GAC GCG CCG GCC GTC AAG GCG CTC GAC TCC GTG AAC 2230
Pro Asp Asp Ala Asp Ala Pro Ala Val Lys Ala Leu Asp Ser Val Asn
610 615 620
GAG ATG CTC GGC ACG CCG CAC GGC CTG GTG CTG CAG TAC CCG GCG TAC 2278
Glu Met Leu Gly Thr Pro His Gly Leu Val Leu Gln Tyr Pro Ala Tyr
625 630 635 640
ACG ACG TAC CAG ATC GAG CTC GGC GAG GTC TCC ACG TAC CCG CCC GGC 2326
Thr Thr Tyr Gln Ile Glu Leu Gly Glu Val Ser Thr Tyr Pro Pro Gly
645 650 655
TAC AAG GAG AAC GGC GGC ATC TTC TGC CAC AAC AAC CCC TGG GTG ATC 2374
Tyr Lys Glu Asn Gly Gly Ile Phe Cys His Asn Asn Pro Trp Val Ile
660 665 670
ATC GCC GAG ACG GTC GTG GGG CGC GGT GCG CAG GCG TTC GAC TAC TAC 2422
Ile Ala Glu Thr Val Val Gly Arg Gly Ala Gln Ala Phe Asp Tyr Tyr
675 680 685
AAG CGG ATC ACC CCC GCG TAC CGC GAG GAC ATC TCC GAC ACG CAC AAG 2470
Lys Arg Ile Thr Pro Ala Tyr Arg Glu Asp Ile Ser Asp Thr His Lys
690 695 700
CTC GAG CCG TAC GTG TAC GCG CAG ATG ATC GCG GGC AAG GAG GCG GTG 2518
Leu Glu Pro Tyr Val Tyr Ala Gln Met Ile Ala Gly Lys Glu Ala Val
705 710 715 720
CGC GCC GGC GAG GCG AAG AAC TCG TGG CTC ACC GGA ACG GCG GCG TGG 2566
Arg Ala Gly Glu Ala Lys Asn Ser Trp Leu Thr Gly Thr Ala Ala Trp
725 730 735
AAC TTC GTC GCG GTG TCC CAG TAC CTG CTG GGC GTG CGG CCC GAC TAC 2614
Asn Phe Val Ala Val Ser Gln Tyr Leu Leu Gly Val Arg Pro Asp Tyr
740 745 750
GAC GGC CTC GTG GTC GAC CCG CAG ATC GGT CCG GAC GTC CCC TCG TAC 2662
Asp Gly Leu Val Val Asp Pro Gln Ile Gly Pro Asp Val Pro Ser Tyr
755 760 765
ACG GTC ACC CGC GTG GCC CGC GGC GCG ACG TAC GAG ATC ACG GTG ACC 2710
Thr Val Thr Arg Val Ala Arg Gly Ala Thr Tyr Glu Ile Thr Val Thr
770 775 780
AAC TCG GGC GCC CCG GGC GCG CGT GCG TCG CTC ACG GTC GAC GGC GCG 2758
Asn Ser Gly Ala Pro Gly Ala Arg Ala Ser Leu Thr Val Asp Gly Ala
785 790 795 800
CCC GTC GAC GGC CGC ACG GTC CCC TAC GCC CCG GCC GGC TCG ACC GTC 2806
Pro Val Asp Gly Arg Thr Val Pro Tyr Ala Pro Ala Gly Ser Thr Val
805 810 815
CGC GTC GAG GTG ACC GTC TGACCCGCGG GTCCGACGGC TGACGTCATG 2854
Arg Val Glu Val Thr Val
820
ACGATGGTCC AGGAGATCGA GACGCCCGCG CCGGCGGCCC CTGCCGGCGC GGGGGTCGCG 2914
CCCGAGCGCG TCGTGACGCT GCGCTCCGGT GCGTGGGAGC TCGACGTGCT CCCGCGCACC 2974
GGGGCGGCCC TCGGCGGTGG CCGCATCCGC ACCTCGGACG GCGTGTGGCG CGACCTGCTG 3034
CGCCCGACGC GCCCGACCGT CCTGGGCGAC CCGGAGAAGT GCTCGTCGTT CCCGATGGTG 3094
CCGTGGTCCA ACCGCATCCG CGACGGCGTG CTCGCCTTCG GCGGGCGCTC GTGGCAGCTG 3154
CAG 3157

【31】
配列番号:2
配列の長さ:40
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:N末端フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
配列
Met Arg Tyr Gly His Phe Asp Asp Ala Ala Arg Glu Tyr Val Ile Thr
1 5 10 15
Thr Pro His Thr Pro Tyr Pro Trp Ile Asn Tyr Leu Gly Ser Glu Gln
20 25 30
Phe Phe Ser Leu Leu Ser His Gln
35 40

【32】
配列番号:3
配列の長さ:25
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
配列
Ala Asp Leu Asp His Phe Glu Ala Arg His Gly Leu Gly Tyr Ser Arg
1 5 10 15
Ile Thr Gly Glu Arg Asn Gly Leu Lys
20 25

【33】
配列番号:4
配列の長さ:17
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
配列
Val Glu Thr Leu Phe Phe Val Pro Leu Gly Glu Asn Ala Glu Val Gln
1 5 10 15
Lys

【34】
配列番号:5
配列の長さ:11
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
JP0002995289B2_000002t.gif【0035】配列番号:6
配列の長さ:31
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス(Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
配列
Thr Glu Tyr Arg Glu Arg Arg Asp His Tyr Ala Val Phe Gly Val Asn
1 5 10 15
Thr Arg Ala Asp Gly Phe Asp Thr Asp Arg Asp Thr Phe Val Gly
20 25 30

【36】
配列番号:7
配列の長さ:18
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
配列
Ser Ala Asp Ser Val Ala Ser Gly Trp Tyr Pro Ile Gly Ser His Ser
1 5 10 15
Val Ala

【37】
配列番号:8
配列の長さ:11
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
JP0002995289B2_000003t.gif【0038】配列番号:9
配列の長さ:31
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス(Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
配列
Ala Pro Ala His Ala Leu Leu Gly Arg Phe Ala Thr Ser Glu Gln Val
1 5 10 15
Asp Ala Ala Leu Glu Ala Leu Asn Ser Tyr Trp Thr Asn Leu Leu
20 25 30

【39】
配列番号:10
配列の長さ:14
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
配列
Arg Gly Asn Asn Asp Ile Gly Ser Gly Phe Asn Asp Asp Pro
1 5 10

【40】
配列番号:11
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
JP0002995289B2_000004t.gif【0041】配列番号:12
配列の長さ:29
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
フラグメント型:中間部フラグメント
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物配列
Ile Trp Ile Glu Pro Gln Gly Phe Ala Val Met Ala Gly Ile Gly Val
1 5 10 15
Gly Glu Gly Pro Asp Asp Ala Asp Ala Pro Ala Val Lys
20 25

【42】
配列番号:13
配列の長さ:17
配列の型:核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(アミノ酸配列から作成)
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
配列
GARTAYGTSA TYACSAC 17

【43】
配列番号:14
配列の長さ:17
配列の型:核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(アミノ酸配列から作成)
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
配列
ACCTGRTGBG CRTCRTC 17

【44】
配列番号:15
配列の長さ:821
配列の型:核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸
起源
生物名:セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus)
株名:ATCC 13127
直接の起源
PCR反応物
配列
GAGTACGTCA TCACGACGCC TCACACCCCC TACCCGTGGA TCAACTACCT CGGGTCGGAG 60
CAGTTCTTCT CGCTGCTCTC CCACCAGGCC GGCGGCTACT CGTTCTACCG CGACGCCAAG 120
ATGCGGCGGC TCACGCGCTA CCGCTACAAC AACATCCCCG CGGACGCGGG CGGCCGGTAC 180
CTGTACGTCA ACGACGGCGG CGACGTGTGG ACCCCGTCGT GGCTGCCGGT CAAGGCGGAC 240
CTGGACCACT TCGAGGCGCG CCACGGCCTC GGCTACTCGC GCATCACGGG CGAGCGCAAC 300
GGCCTGAAGG TCGAGACGCT CTTCTTCGTC CCGCTCGGCG AGAACGCCGA GGTGCAGAAG 360
GTCACCGTCA CCAACACGTC CGACGCCCCG AAGACGGCGA CGCTGTTCTC GTTCGTCGAG 420
TTCTGCCTGT GGAACGCGCA GGACGACCAG ACGAACTACC AGCGCAACCT GTCGATCGGC 480
GAGGTCGAGG TCGAGCAGGA CGGCCCGCAC GGCTCGGCGA TCTACCACAA GACCGAGTAC 540
CGCGAGCGCC GCGACCACTA CGCCGTGTTC GGCGTGAACA CCCGCGCGGA CGGCTTCGAC 600
ACGGACCGCG ACACGTTCGT GGGCGCGTAC AACTCGCTGG GCGAGGCGTC CGTCCCGCGC 660
GCCGGGAAGT CCGCGGACTC GGTCGCGTCG GGCTGGTACC CGATCGGCTC GCACTCCGTC 720
GCCGTGACGC TGCAGCCCGG CGAGTCCCGC GACCTCGTCT ACGTGCTGGG CTACCTGGAG 780
AACCCCGACG AGGAGAAGTG GGCCGACGAC GCCCACCAGG T 821