TOP > 国内特許検索 > 昆虫由来のセルラーゼ遺伝子 > 明細書

明細書 :昆虫由来のセルラーゼ遺伝子

発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 特許公報(B2)
特許番号 特許第3030349号 (P3030349)
公開番号 特開平11-046764 (P1999-046764A)
登録日 平成12年2月10日(2000.2.10)
発行日 平成12年4月10日(2000.4.10)
公開日 平成11年2月23日(1999.2.23)
発明の名称または考案の名称 昆虫由来のセルラーゼ遺伝子
国際特許分類 C12N 15/09      
C12N 11/21      
C12N 19/42      
C12N  1/21      
C12R  1:19      
C12N  9/42      
C12R  1:91      
FI C12N 15/00 ZNAA
C12N 11/21
C12N 19/42
請求項の数または発明の数 6
全頁数 10
出願番号 特願平09-206740 (P1997-206740)
出願日 平成9年7月31日(1997.7.31)
新規性喪失の例外の表示 特許法第30条第1項適用申請有り Zoological Science,Vol.14,No.1,(February 1997),p.83-93
審査請求日 平成9年8月15日(1997.8.15)
特許権者または実用新案権者 【識別番号】391030284
【氏名又は名称】農林水産省蚕糸・昆虫農業技術研究所長
【識別番号】000195568
【氏名又は名称】生物系特定産業技術研究推進機構
発明者または考案者 【氏名】野田 博明
【氏名】渡辺 裕文
【氏名】徳田 岳
個別代理人の代理人 【識別番号】100091096、【弁理士】、【氏名又は名称】平木 祐輔 (外1名)
審査官 【審査官】斎藤 真由美
調査した分野 C12N 15/00 - 15/90
C12N 1/00 - 1/38
C12N 9/00 - 9/99
特許請求の範囲 【請求項1】
以下の(a)又は(b)のセルラーゼ活性を有する組換えタンパク質。
(a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)アミノ酸配列(a)において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ酵素活性を有するタンパク質。

【請求項2】
以下の(a)又は(b)のセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)アミノ酸配列(a)において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ酵素活性を有するタンパク質。

【請求項3】
DNAが配列番号1又は2で表されるものである請求項2記載のDNA。

【請求項4】
請求項2又は3記載のDNAを含む組換えベクター。

【請求項5】
請求項4記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。

【請求項6】
請求項5記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から請求項1記載のセルラーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取することを特徴とする該組換えタンパク質の製造方法。
発明の詳細な説明 【発明の詳細な説明】

【0001】

【発明の属する技術分野】本発明は昆虫が生産し、その体内でセルロースを消化するために働くセルラーゼ、その遺伝子及び前記セルラーゼの製造方法に関する。

【0002】

【従来の技術】木材などのセルロースを食べている昆虫は体内にセルロース消化酵素(セルラーゼ)を持っており、セルロースを消化してエネルギー源としている。これらのセルラーゼは消化管内に共生する微生物が生産していると考えられており、昆虫自身がセルラーゼを作っているという示唆はあったが、動物からセルラーゼの遺伝子は取り出されていなかった。一方、細菌や糸状菌などからはセルラーゼ遺伝子が取り出されているが、分子量が大きく、活性ドメインの他に吸着ドメインおよびそれらをつなぐドメインからなることが判明している。これまでセルラーゼを昆虫から単離した例は極めて少なく、その理化学的性状
についても、徘徊性のゴキブリ(Panesthia cribrata)のエンド-β-1,4-グルカナーゼなどについて調べられているだけで、遺伝子についてはまったく判っていない。

【0003】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、昆虫からのセルラーゼの精製法を確立し、その酵素学的特徴を明らかにし、さらにその遺伝子を取り出し、さらにその遺伝子を用いて遺伝子工学的手法により上記酵素を製造する方法を提供することにある。

【0004】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は下記の酵素化学的性質を有する昆虫由来のセルラーゼにある。
基質特異性:昆虫の唾腺または腸で作られ、餌として取り込まれたセルロースを分解する。
分子量:40,000-50,000
熱安定性: ~60℃
至適pH:5.0~6.0
カルボキシメチルセルロースに対する比活性:70~1300ユニット/mg
上記昆虫としてはヤマトシロアリ(Reticulitermes speratus)又はタカサゴシロアリ(Nasutitermes takasagoensis)などが挙げられる。

【0005】
さらに、本発明は以下の(a)又は(b)のセルラーゼ活性を有する組換えタンパク質にある。
(a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)アミノ酸配列(a)において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ酵素活性を有するタンパク質。

【0006】
さらに、本発明は以下の(a)又は(b)のセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAにある。
(a)配列番号1又は2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)アミノ酸配列(a)において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ酵素活性を有するタンパク質。そして、上記DNAとしては、例えば配列番号1又は2で表されるものが挙げられる。

【0007】
さらに、本発明は、上記DNAを含む組換えベクターである。さらに、本発明は、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体である。さらに、本発明は、上記形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から請求項3記載のセルラーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取することを特徴とする該組換えタンパク質の製造方法である。

【0008】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
1)昆虫セルラーゼタンパク質の分離・精製
昆虫からの酵素タンパク質の分離には、一般のタンパク質の分離、精製に用いられる様々な方法が適用できる。本発明においては、シロアリを磨砕し、そのアセトン沈殿分画をクロマトグラフィーを用いて、単一のピークにまで精製できる。例えば、ゲル濾過とハイドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーを行いほぼ純粋なセルラーゼを得ることができる。このセルラーゼの酵素学的性状は、精製した酵素を用いて、後に述べる活性の測定法によって調査できる。そして、至適pH、至適温度、温度耐性、基質特性などが調べられる。なお、本発明で対象とした昆虫は下等シロアリであるヤマトシロアリおよび高等シロアリであるタカサゴシロアリである。

【0009】
2)昆虫セルラーゼ遺伝子のクローニング
昆虫セルラーゼ遺伝子のクローニングは、昆虫からクロマトグラフィーなどによって、効率的にセルラーゼ(エンド-β-1,4-グルカナーゼ)を精製し、その抗体を作成して、ファージに組み込んだcDNAを探し出すか、またはそのN末端のアミノ酸配列をエドマン法で解読し、PCR法によってcDNAを手に入れた後、プラスミドに組み込んで形質転換体を作成することによって達成できる。

【0010】
この酵素蛋白質の遺伝子(cDNA)塩基配列を決定する方法は、種種の分子生物学的な手法を適用できる。例えば、この精製酵素を電気泳動に掛け、ナイロンメンブレンなどに移し取り、そのメンブレンをプロテインシーケンサーにかけて、酵素のN末端のアミノ酸配列を決定する。そして、そのアミノ酸配列からPCR用のプライマーを作り、mRNAを鋳型としてcDNAの5’末端と3’末端を含む複数のPCR断片を手に入れ、公知のプラスミド(例えば、Stratagene社製のpBluescript II、pUC18 等)にクローニングして、DNAシーケンサー(例えば、ABI社製の373A、373S等)でcDNAの全長の塩基配列を決定できる。

【0011】
このようにして決定されるセルラーゼの遺伝子およびこの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を配列番号1と2に示すが、本質的に本発明の遺伝子がセルラーゼを発現しセルロース分解活性を有する限り、また、本発明のタンパク質がセルラーゼ活性を有する限り、当該タンパク質に含まれるアミノ酸配列、又は当該遺伝子の塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じてもよいことを意味する。

【0012】
従って、例えば配列番号1と2で表されるアミノ酸配列に含まれる第1番目のメチオニン(Met)が欠失しているものなども、このアミノ酸配列の変化によるタンパク質に含まれる。また、本発明のタンパク質に含まれるアミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体も本発明の遺伝子に含まれる。

【0013】
なお、上記変異は、公知の突然変異誘発キット(Takara社製など)を用いることにより容易に導入することができる。また、上記塩基配列が一旦確定されると、その後は、化学合成、PCR、又は該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。一方、上記遺伝子DNA断片を保持するためのベクターについては公知のプラスミドベクター(例えばStratagene社製のpBluescript II、pUC18 等) を用いることができる。

【0014】
3)形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組み換えベクターを、適合する宿主中に導入することにより得られる。宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、大腸菌(Escherichia coli) 、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) 等の酵母、SF9、SF21等の昆虫細胞、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞などが挙げられる。

【0015】
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の組換え体DNAが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、本発明のDNA、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、例えばpET3、pET11(Stratagene社製) 、pMAL(New England Biolabs社) 等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、lac プロモーター、PL プロモーター、PR プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換え体DNAの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

【0016】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば pYEUra3、YEp13 、YCp50 等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばgal 1 プロモーター、gal 10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。

【0017】
昆虫細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えば pBacPAK8(Clontec 社) 、pBlueBac(Invitrogen 社製) 等が用いられる。昆虫細胞への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等が挙げられる。動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えば pMAM(Clontec 社製) 、pcDNA(Invitrogen社製) 等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。

【0018】
4)昆虫セルラーゼ遺伝子の発現タンパク質の精製
本発明のタンパク質は、本発明の形質転換体を培地で培養し、培養物中および形質転換体中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物および形質転換体から該ポリペプチドを採取することにより製造することができる。本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。

【0019】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

【0020】
培養は、通常振盪培養などの好気的条件下、25~37℃で行う。培養中は、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG) 、インドールアクリル酸(IAA) 等を培地に添加することができる。

【0021】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としてはグレース培地又はこの培地にウシ胎児血清を添加した培地が用いられる。動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばRPMI-1640 、DMEM培地又はこれらの培地にウシ胎児血清を添加した培地が用いられる。培養中はカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【0022】
本発明のタンパク質の精製は昆虫からの分離・精製と同様に行うことができる。例えば本発明の遺伝子を保有する大腸菌等のクローンについて、アンピシリンなどの抗生物質を含むLB培地などの振盪培養を行う。得られる培養物を遠心して細胞を回収し、ソニケーターにて細胞を破砕した後、ゲル濾過等を単独で又は適宜組み合わせることによって精製が行われる。得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等の他に、セルラーゼ活性の測定によっても行える。

【0023】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕
1)タカサゴシロアリのセルラーゼの調製と活性の測定
約20頭のシロアリから消化管と唾腺を解剖により取り出し、消化管の場合は前腸、中腸、後腸などにわけて、10マイクロリットルの緩衝液(0.1M酢酸ナトリウム、pH5.5)で磨砕し、約20,000gで20分遠心した。上清を600マイクロリットルの緩衝液で希釈し、酵素液とした。エンド-β-1,4-グルカナーゼの活性は、2.0%ソディウム・カルボキシメチルセルロース(CMC)200 マイクロリットル(緩衝液に溶かす)に、酵素液25マイクロリットルを加え、37℃で30分インキュベートした後、テトラゾリウム・ブルー(Sigma)で、発色程度を測定した。そのときの蛋白量は、紫外線の280と260nmの吸収を利用して、牛胎児血清を用いて標準線を作成しておき、標準線から決定した。これにより、活性の高い部位を知ることができ、次の精製操作の参考になる。

【0024】
2)カラムクロマトグラフィーによる酵素の分離・精製
約15gのシロアリを蒸留水 150ミリリットルで磨砕し、24,000gで30分遠心して上清を回収した。硫酸アンモニウムを加えて35~70%濃度での沈殿物を遠心して回収した。この沈殿物を30ミリリットルの0.3M酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)に溶かし、カラムクロマトグラフィーにかけた。サンプルの濃縮は限外濾過膜(アミコン製モデル8010,8050など)を用いて行った。

【0025】
Sephacryl S-200HR(Pharmacia)をつめたカラム(26×900mm)にサンプルをのせ、0.3M酢酸アンモニウム緩衝液を流した(1分当たり1.0ミリリットル)。活性のあった分画は濃縮して、次に HiLoad 16/60 Superdex-75(Pharmacia)のカラムで精製した(1分あたり 0.6ミリリットル)。さらに、同様に、hydroxyapatite(Bio-Rad) のカラム(10×50mm)を用いて、20mMから1Mリン酸緩衝液(pH5.5)へ勾配をかえて流して(1分当たり 0.2ミリリットル)活性分画を回収した。もう一度 hydroxyapatite カラムで精製を繰り返せばさらに純度を上げることができた。精製した酵素は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行って、良く精製されていることを確認した。

【0026】
3)酵素の酵素化学的性質の調査
精製された酵素を用いて、至適温度を調べるには、酢酸ナトリウム緩衝液などに溶かした2%CMC溶液の中に酵素をいれ、20℃から70℃くらいまで5℃間隔でそれぞれのサンプルを5分間保持したのち、37℃で5分間テトラゾリウムで発色させ、活性を測った。至適pHは、pH域によって用いる緩衝液を変え、同様に37℃で活性を測った。

【0027】
酵素の基質特異性(cellopentaose, cellotetraose, cellotriose, cellobiose)を調査するには、60mMの基質溶液10マイクロリットルに酵素液を10マイクロリットル加え、37℃でインキュベートした。分解産物を薄層クロマトグラフィー(TLC)で展開して、発色剤(アニリン、ディフェニルアミン、アセトン、H3PO4)を吹き付け、熱して検出した。その結果、本酵素は cellopentaose やcellotetraose をより良く分解することが判った。

【0028】
本酵素の比活性は基質としてカルボキシメチルセルロースを用いて測定した結果、70~1300ユニット/mg(ユニット:1分あたりにグルコース相当の還元糖を1マイクロモル生成する酵素量)であった。分子量はポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)の泳動度から推定した。ヤマトシロアリ及びタカサゴシロアリのセルラーゼ(エンド-β-1,4-グルカナーゼ)についての酵素化学的性質は表1に示す通りである。

【0029】

【表1】
JP0003030349B2_000002t.gif【0030】〔実施例2〕 遺伝子のクローニングと塩基配列の解析(タカサゴシロアリのセルラーゼの例)
精製した酵素をポリアクリルアミドゲル電気泳動で泳動し、PVDF膜にブロティング装置(TransBlott SD,Bio-Rad)で写し取った後、クマジーブルーで染色し、乾燥後染色部分を切り取り、アミノ酸シーケンサー(LF-3000, Beckman)で酵素蛋白質のN末端のアミノ酸配列を調べた。解読されたアミノ酸配列部分(約30アミノ酸)だけを増幅できるPCRプライマー対(縮合プライマー)を作成した。

【0031】
RT-PCRを行うために、mRNA抽出キット(Pharmacia Bioteck)を用いてシロアリのメッセンジャーRNAを中腸から抽出した。逆転写酵素をもちいてオリゴdTのプライマーでcDNAを合成し(42℃1時間)、次にこの反応液をPCRに用いた。PCRの条件は94℃30秒、51℃1分、72℃2分で30サイクルとした。PCR産物はアガロースゲル電気泳動で確認後、ベクター(pBluescript II)につなぎ、大腸菌を用いてクローニングを行った。ベクターのインサートの塩基配列を解読し、まずN末端の塩基配列の一部(両プライマーに挟まれた部分の数十塩基)を明らかにした。さらに、この塩基配列に基づき、cDNAのその部分から5’側と3’側をそれぞれ増幅するためのプライマーを作成して Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH) を用いて、2種類のPCR産物を得た。このPCR産物をそれぞれプラスミドにクローニングし、数本づつ塩基配列を解読した。

【0032】
得られた塩基配列および推定されるアミノ酸配列について、ヤマトシロアリ (YEG2) は配列番号1に、タカサゴシロアリは配列番号2にそれぞれ示す。これら塩基配列および推定されるアミノ酸配列から相同なものを、インターネットを利用してデータベースの中から探し出した。

【0033】
〔実施例3〕形質転換体の作製及びセルラーゼ遺伝子の発現
得られたcDNAのタンパク質をコードしている部分のうち,シグナルペプチドに相当する部分を除いたDNA部分をPCRによって増幅した。このDNAをpBluescript IIのマルチクローニングサイトに,タンパク質への翻訳の読み枠が合うように結合した。大腸菌にこのプラスミドを入れ,IPTGを加えたLB培地で大腸菌を培養し,セルラーゼ遺伝子を発現させた。

【0034】
大腸菌の中で作られたタンパク質がセルラーゼ活性を持つことは,アクリルアミドゲルで泳動したタンパク質の活性を見ることによって確かめた。すなわち,大腸菌を37℃でOD 660=1.0 まで培養し(約5時間),菌体をリゾチームを含む緩衝液中で消化し,得られたタンパク質をCMC(カルボキシメチルセルロース)を含むポリアクリルアミドゲルで泳動し,コンゴレッドで染色した。目的のタンパク質が泳動されている部分は,セルラーゼ活性によってCMCが分解されたため,周囲よりも薄く染まった。

【0035】

【発明の効果】本発明により新規な昆虫由来のセルラーゼ、その遺伝子が提供された。そして、この遺伝子を用いて遺伝子工学的手法により昆虫由来のセルラーゼを大量に製造することができる。また、本発明によるセルラーゼ単独またはすでに知られているセルラーゼと組み合わせることにより、セルロースの分解をより効率的に行うことができる。

【0036】

【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:1495
配列の形:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA to mRNA
起原
生物名:ヤマトシロアリ(Reticuliterme speratus
配列の特徴
特徴を表す記号:sig peptide
存在位置:16..63
特徴を決定した方法:E
特徴を表す記号:peptide
存在位置:64..1353
特徴を決定した方法:E
配列
CCACTACCAG CCACC ATG AAG GTC TTC GTT TGT CTT CTG TCT GCA CTC GCG 51
Met Lys Val Phe Val Cys Leu Leu Ser Ala Leu Ala
-15 -10 -5
CTT TGC CAA GCT GCT TAC GAC TAT AAG ACA GTA CTA AGC AAT TCG CTA 99
Leu Cys Gln Ala Ala Tyr Asp Tyr Lys Thr Val Leu Ser Asn Ser Leu
1 5 10
CTT TTC TAC GAG GCT CAG CGA TCG GGA AAA TTG CCG TCT GAT CAG AAG 147
Leu Phe Tyr Glu Ala Gln Arg Ser Gly Lys Leu Pro Ser Asp Gln Lys
15 20 25
GTC ACG TGG AGG ATT CCG CCC TTA ACG ACA AGG GCC AGA AGG CGA GGA 195
Val Thr Trp Arg Ile Pro Pro Leu Thr Thr Arg Ala Arg Arg Arg Gly
30 35 40
CTG ACA GGA GGA TAC TAT GAC GCT GGT GAT TTT GTG AAG TTC GGC TCC 243
Leu Thr Gly Gly Tyr Tyr Asp Ala Gly Asp Phe Val Lys Phe Gly Ser
45 50 55 60
CCT ATG GCG TAC ACA GTC ACC GTC CTG GCT TGG GGT GTT ATA GAC TAC 291
Pro Met Ala Tyr Thr Val Thr Val Leu Ala Trp Gly Val Ile Asp Tyr
65 70 75
GAA TCA GCG TAT TCT GCA GCA GGA GCT CTG GAT AGT GGT CGC AAG GCT 339
Glu Ser Ala Tyr Ser Ala Ala Gly Ala Leu Asp Ser Gly Arg Lys Ala
80 85 90
CTT AAA TAT GGC ACG GAC TAC TTC CTC AAG GCG CAC ACG GCC GCG AAC 387
Leu Lys Tyr Gly Thr Asp Tyr Phe Leu Lys Ala His Thr Ala Ala Asn
95 100 105
GAA TTC TAC GGA CAA GTG GGC CAG GGA GAT GTC GAC CAC GCC TAC TGG 435
Glu Phe Tyr Gly Gln Val Gly Gln Gly Asp Val Asp His Ala Tyr Trp
110 115 120
GGA CGT CCA GAA GAC ATG ACG ATG TCC AGA CCT GCC TAC AAG ATC GAC 483
Gly Arg Pro Glu Asp Met Thr Met Ser Arg Pro Ala Tyr Lys Ile Asp
125 130 135 140
ACG TCG AAA CCA GGG TCT GAC CTG GCC GCC GAG ACA GCC GCC GCC CTC 531
Thr Ser Lys Pro Gly Ser Asp Leu Ala Ala Glu Thr Ala Ala Ala Leu
145 150 155
GCT GCA ACT GCC ATC GCC TAC AAG AGT GCT GAC GCC ACT TAT TCC AAC 579
Ala Ala Thr Ala Ile Ala Tyr Lys Ser Ala Asp Ala Thr Tyr Ser Asn
160 165 170
AAC TTG ATC ACC CAC GCC AAG CAG CTT TTC GAC TTC GCC AAC AAT TAT 627

Asn Leu Ile Thr His Ala Lys Gln Leu Phe Asp Phe Ala Asn Asn Tyr
175 180 185
CGC GGC AAA TAC AGT GAT TCA ATC ACC GAC GCG CAG AAT TTC TAC GCG 675
Arg Gly Lys Tyr Ser Asp Ser Ile Thr Asp Ala Gln Asn Phe Tyr Ala
190 195 200
TCC GGA GAC TAC AAG GAC GAG TTA GTA TGG GCA GCC GCA TGG CTC TAC 723
Ser Gly Asp Tyr Lys Asp Glu Leu Val Trp Ala Ala Ala Trp Leu Tyr
205 210 215 220
AGA GCG ACC AAC GAC AAC ACC TAT CTG ACC AAA GCT GAA TCG CTA TAC 771
Arg Ala Thr Asn Asp Asn Thr Tyr Leu Thr Lys Ala Glu Ser Leu Tyr
225 230 235
AAC GAA TTC GGC CTC GGA AAC TGG AAC GGT GCC TTC AAC TGG GAT AAC 819
Asn Glu Phe Gly Leu Gly Asn Trp Asn Gly Ala Phe Asn Trp Asp Asn
240 245 250
AAG ATC TCC GGT GTA CAG GTT CTA CTG GCC AAG CTC ACA AGC AAG CAG 867
Lys Ile Ser Gly Val Gln Val Leu Leu Ala Lys Leu Thr Ser Lys Gln
255 260 265
GCA TAC AAG GAC AAG GTA CAA GGC TAC GTC GAT TAC TTG ATT TCG TCT 915
Ala Tyr Lys Asp Lys Val Gln Gly Tyr Val Asp Tyr Leu Ile Ser Ser
270 275 280
CAG AAG AAG ACA CCC AAG GGT CTC GTA TAC ATC GAC CAG TGG GGT ACC 963
Gln Lys Lys Thr Pro Lys Gly Leu Val Tyr Ile Asp Gln Trp Gly Thr
285 290 295 300
CTG CGA CAT GCT GCC AAT TCT GCT CTC ATT GCT CTG CAG GCA GCC GAC 1011
Leu Arg His Ala Ala Asn Ser Ala Leu Ile Ala Leu Gln Ala Ala Asp
305 310 315
CTG GGT ATC AAT GCT GCT ACT TAT CGC GCG TAT GCC AAG AAG CAG ATC 1059
Leu Gly Ile Asn Ala Ala Thr Tyr Arg Ala Tyr Ala Lys Lys Gln Ile
320 325 330
GAT TAC GCA TTA GGT GAT GGA GGT CGC AGC TAC GTC ATA GGA TTT GGT 1107
Asp Tyr Ala Leu Gly Asp Gly Gly Arg Ser Tyr Val Ile Gly Phe Gly
335 340 345
ACT AAC CCA CCC GTA CGC CCT CAC CAC AGA TCC AGC TCG TGC CCT GAC 1155
Thr Asn Pro Pro Val Arg Pro His His Arg Ser Ser Ser Cys Pro Asp
350 355 360
GCA CCA GCC GTA TGT GAC TGG AAC ACG TAC AAC AGC GCC GGC CCC AAT 1203
Ala Pro Ala Val Cys Asp Trp Asn Thr Tyr Asn Ser Ala Gly Pro Asn
365 370 375 380
GCT CAC GTA CTC ACC GGA GCC TTG GTC GGT GGT CCA GAT AGC AAC GAT 1251
Ala His Val Leu Thr Gly Ala Leu Val Gly Gly Pro Asp Ser Asn Asp
385 390 395
AGC TAC ACG GAC GCT CGC AGC GAT TAC ATC TCC AAC GAA GTG GCC ACA 1299
Ser Tyr Thr Asp Ala Arg Ser Asp Tyr Ile Ser Asn Glu Val Ala Thr
400 405 410
GAT TAC AAC GCT GGC TTC CAA TCA GCT GTC GCT GGT CTC CTC AAG GCT 1347
Asp Tyr Asn Ala Gly Phe Gln Ser Ala Val Ala Gly Leu Leu Lys Ala
415 420 425
GGC GTG TAA CCGCACACAG CACTCAATGT CTCCTTGTCC ACTGGACATG TGTACAATT 1405
Gly Val
430
TGACAACGAA AATGTAATAT TCTTCAGAAA AGTTCAATAA AAGTTTAAAT TTCAACACAA 1465
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1495

【0037】
配列番号:2
配列の長さ:
配列の形:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA to mRNA
起原
生物名:タカサゴシロアリ(Nasutitermes takasagoensis
配列の特徴
特徴を表す記号:sig peptide
存在位置:103..150
特徴を決定した方法:E
特徴を表す記号:peptide
存在位置:151..1446
特徴を決定した方法:E
配列
ATCAGATTGA GAGTCTCTCT CCTGTTGTGC AGCCGATCAG TATAAATCGG CGGGACGGTC 60
CTACCAAAAC AACTTCACGG CCTGCAACCA ATACCAGCCA GC ATG AGG GTC TTC 114
Met Arg Val Phe
-15
CTT TGT CTT CTG TCT GCG CTA GCG CTT TGC CAA GCT GCT TAC GAC TAC 162
Leu Cys Leu Leu Ser Ala Leu Ala Leu Cys Gln Ala Ala Tyr Asp Tyr
-10 -5 1
AAG CAA GTA CTG CGC GAT TCC CTA CTG TTC TAC GAG GCT CAA CGA TCG 210
Lys Gln Val Leu Arg Asp Ser Leu Leu Phe Tyr Glu Ala Gln Arg Ser
5 10 15 20
GGA AGG TTG CCC GCT GAT CAG AAA GTC ACA TGG AGA AAG GAT TCC GCC 258
Gly Arg Leu Pro Ala Asp Gln Lys Val Thr Trp Arg Lys Asp Ser Ala
25 30 35
CTA AAC GAC CAA GGA GAC CAG GGC CAG GAC CTA ACA GGA GGA TAC TTT 306
Leu Asn Asp Gln Gly Asp Gln Gly Gln Asp Leu Thr Gly Gly Tyr Phe
40 45 50
GAC GCT GGT GAT TTT GTG AAA TTC GGC TTT CCA ATG GCG TAC ACA GCC 354

Asp Ala Gly Asp Phe Val Lys Phe Gly Phe Pro Met Ala Tyr Thr Ala
55 60 65
ACC GTC CTG GCT TGG GGC CTG ATC GAC TTT GAA GCG GGC TAC TCT TCA 402
Thr Val Leu Ala Trp Gly Leu Ile Asp Phe Glu Ala Gly Tyr Ser Ser
70 75 80
GCA GGA GCT CTG GAT GAT GGT CGC AAA GCT GTT AAA TGG GCC ACA GAC 450
Ala Gly Ala Leu Asp Asp Gly Arg Lys Ala Val Lys Trp Ala Thr Asp
85 90 95 100
TAT TTC ATC AAG GCG CAC ACG TCC CAA AAT GAA TTC TAC GGA CAA GTG 498
Tyr Phe Ile Lys Ala His Thr Ser Gln Asn Glu Phe Tyr Gly Gln Val
105 110 115
GGC CAG GGA GAT GCG GAC CAC GCC TTC TGG GGA CGT CCA GAA GAC ATG 546
Gly Gln Gly Asp Ala Asp His Ala Phe Trp Gly Arg Pro Glu Asp Met
120 125 130
ACA ATG GCA AGA CCT GCC TAC AAG ATC GAC ACG TCT AGA CCA GGG TCG 594
Thr Met Ala Arg Pro Ala Tyr Lys Ile Asp Thr Ser Arg Pro Gly Ser
135 140 145
GAT CTG GCC GGC GAA ACA GCC GCC GCC CTC GCT GCA GCT TCC ATC GTG 642
Asp Leu Ala Gly Glu Thr Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Ile Val
150 155 160
TTC AGG AAT GTC GAC GGC ACT TAT TCC AAC AAC CTG CTC ACA CAC GCC 690
Phe Arg Asn Val Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Asn Leu Leu Thr His Ala
165 170 175 180
AGG CAG CTT TTC GAC TTC GCC AAC AAT TAT CGC GGC AAA TAC AGT GAC 738
Arg Gln Leu Phe Asp Phe Ala Asn Asn Tyr Arg Gly Lys Tyr Ser Asp
185 190 195
TCA ATC ACC GAC GCC AGG AAT TTC TAC GCG TCC GCG GAC TAC AGG GAT 786
Ser Ile Thr Asp Ala Arg Asn Phe Tyr Ala Ser Ala Asp Tyr Arg Asp
200 205 210
GAA TTA GTA TGG GCA GCC GCA TGG CTC TAC AGG GCA ACC AAC GAC AAC 834
Glu Leu Val Trp Ala Ala Ala Trp Leu Tyr Arg Ala Thr Asn Asp Asn
215 220 225
ACC TAC CTC AAC ACC GCT GAA TCG CTA TAT GAT GAA TTC GGT CTC CAG 882
Thr Tyr Leu Asn Thr Ala Glu Ser Leu Tyr Asp Glu Phe Gly Leu Gln
230 235 240
AAC TGG GGT GGT GGC CTT AAC TGG GAT AGC AAA GTG TCC GGT GTA CAG 930
Asn Trp Gly Gly Gly Leu Asn Trp Asp Ser Lys Val Ser Gly Val Gln
245 250 255 260
GTT CTA CTG GCC AAA CTC ACA AAC AAG CAA GCG TAC AAG GAC ACG GTA 978
Val Leu Leu Ala Lys Leu Thr Asn Lys Gln Ala Tyr Lys Asp Thr Val
265 270 275
CAA TCA TAC GTG AAT TAC CTA ATT AAC AAC CAG CAG AAG ACA CCC AAG 1026
Gln Ser Tyr Val Asn Tyr Leu Ile Asn Asn Gln Gln Lys Thr Pro Lys
280 285 290
GGT CTT CTT TAC ATC GGA CAT GTG GGG AAC CTG CGA CAT GCT GCA AAC 1074
Gly Leu Leu Tyr Ile Gly His Val Gly Asn Leu Arg His Ala Ala Asn
295 300 305
GCT GCC TTC ATT ATG CTT GAG GCT GCG GAG CTG GGT TTG AGT GCT TCT 1122
Ala Ala Phe Ile Met Leu Glu Ala Ala Glu Leu Gly Leu Ser Ala Ser
310 315 320
AGT TAT CGC CAG TTT GCC CAG ACG CAG ATC GAT TAC GCA TTG GGT GAC 1170
Ser Tyr Arg Gln Phe Ala Gln Thr Gln Ile Asp Tyr Ala Leu Gly Asp
325 330 335 340
GGT GGG CGC AGC TTC GTG TGT GGA TTT GGC AGT AAC CCA CCT ACC CGC 1218
Gly Gly Arg Ser Phe Val Cys Gly Phe Gly Ser Asn Pro Pro Thr Arg
345 350 355
CCT CAC CAT AGA TCT AGT TCG TGC CCA CCC GCG CCG GCC ACA TGT GAC 1266
Pro His His Arg Ser Ser Ser Cys Pro Pro Ala Pro Ala Thr Cys Asp
360 365 370
TGG AAC ACA TTC AAC AGT CCA GAT CCA AAC TAC CAC GTA CTC AGT GGA 1314
Trp Asn Thr Phe Asn Ser Pro Asp Pro Asn Tyr His Val Leu Ser Gly
375 380 385
GCT TTG GTG GGC GGT CCA GAT CAG AAC GAC AAC TAC GTG GAC GAT CGC 1362
Ala Leu Val Gly Gly Pro Asp Gln Asn Asp Asn Tyr Val Asp Asp Arg
390 395 400
AGC GAT TAC GTC CAC AAC GAA GTT GCC ACA GAT TAC AAC GCA GGC TTC 1410
Ser Asp Tyr Val His Asn Glu Val Ala Thr Asp Tyr Asn Ala Gly Phe
405 410 415 420
CAA TCA GCT CTC GCC GCT CTC GTC GCG TTG GGT TAT TAA ACTCACAAAA CA 1461
Gln Ser Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala Leu Gly Tyr
425 430
TTCAAATTGT CCGTCTGCTG TGAGTGTGTA CAAAATAATA TAAACAATGT AACATTGTCC 1521
TTAGCAGTGA AAATAAAATC TTTGTATGCA GATACGTTTG TAGACGACGT TCAGTACTGC 1581
ATACAGGGCT GAAATTGCAA TGTATAATCC TAGAAATCGA AATGGATGTT GAAATAAACT 1641
ACAATATTAC AACTGAGTAC ACAGTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1695
図面
【図1】
0
【図2】
1