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METHOD FOR INDUCING PROLIFERATION OF BLOOD-DERIVED MONOCYTES UPDATE_EN

Patent code P170014561
File No. S2016-0369-N0
Posted date Aug 29, 2017
Application number P2016-012951
Publication number P2017-131136A
Date of filing Jan 27, 2016
Date of publication of application Aug 3, 2017
Inventor
  • (In Japanese)千住 覚
  • (In Japanese)今村 悠哉
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人 熊本大学
Title METHOD FOR INDUCING PROLIFERATION OF BLOOD-DERIVED MONOCYTES UPDATE_EN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an improved efficient method for inducing proliferation of monocytes derived from the peripheral blood, in particular, a method for inducing proliferation of monocytes derived from the peripheral blood with improved donor dependency, for example.
SOLUTION: According to the present invention, a method comprises: introducing at least three genes, cMYC, BMI1, and BCL2 or LYL1 genes, into monocytes and expressing the genes in the monocytes to form monocytes having proliferative abilities. In a method for inducing proliferation of monocytes, the monocytes derived from the peripheral blood are fresh monocytes that are not cryopreserved, and more preferably monocytes derived from cancer patients. According to the present invention, a method for producing dendritic cells comprises the steps of: preparing monocytes having proliferation abilities by the method for inducing proliferation of monocytes; inducing differentiation of the monocytes into dendritic cells by culturing the monocytes having the proliferation abilities; and preparing antigen-presenting dendritic cells by loading the prepared dendritic cells with an arbitrary antigen or introducing a gene of an arbitrary antigen to produce antigen-presenting dendritic cells.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


単球(Monocyte:Mo)は、白血球細胞に分類される単核の細胞であり、血液中を循環している未熟な食細胞である。単球は、感染に対する免疫に重要な役割を果たしており、細菌などの異物を細胞内に取り込み、消化する。断片化した異物を、もともと細胞質内に持っていたMHC分子と結合させ、細胞表面に提示し、これをヘルパーT細胞が認識することにより免疫反応が開始される。また単球は、マクロファージ、樹状細胞、破骨細胞に分化することが知られている。



マクロファージは、生体内における主要な異物処理細胞であり、生体内に侵入した感染性微生物等を貪食してこれを分解することにより、生体を感染症から防御する役割を有している。また、生体内では、日々、大量の細胞が死滅しており、マクロファージは、生体内組織中に存在するその残骸物を貪食し分解する。それ以外にも、マクロファージは、生体内で生じる様々な代謝産物を貪食・分解処理することにより、生体の恒常性維持において必須の役割を担っている。また、マクロファージは、悪性腫瘍の局所においてしばしば浸潤が認められる。腫瘍の局所に存在するマクロファージは、腫瘍細胞を攻撃している場合と腫瘍細胞の増殖を促進している場合の両方があると考えられている。これまでに、マクロファージの腫瘍細胞に対する攻撃能力を活用して悪性腫瘍を治療しようとする試みもなされている。



樹状細胞(Dendritic cell:DC)は、Tリンパ球を強力に刺激し活性化する細胞であり、生体内において免疫応答の制御を司っている細胞である。感染性微生物の生体内侵入に際して、樹状細胞は、微生物を貪食しそれに由来する抗原物質をTリンパ球に提示し、抗原特異的なTリンパ球を刺激し活性化することにより、免疫応答を誘導する。樹状細胞が有するTリンパ球を強力に刺激する能力を生かし、樹状細胞を、がんや感染症に対する免疫療法において細胞ワクチンとして用いる試みがなされている。



抗原性ペプチドを用いたワクチン治療はがん患者を治療するために広く用いられている。これらの抗原性ペプチドは、たとえば、アジュバントで乳化されたり、樹状細胞に付加されたりする。過去20年間、がん抗原由来CTLエピトープを同定するためにかなりの努力が払われてきたが、それは、HLAクラスIの共通のアレル、例えば、HLA-A*02:01に限定されたものであり、結果として、HLAクラスIの主要なアレルによって提示されるエピトープに関する膨大な量の情報が累積されている。他方、低頻度のHLAアレルに関しは比較的少ない種類のエピトープが同定されているにすぎない。よって、HLAクラスIの共通のタイプに対してネガティブながん患者は、現在行われている殆どのワクチン療法から除外されている。



HLA-A*02:01は、世界的にみて最も共通のクラスIアレルであるが、HLA-A*02:01の遺伝子頻度は大部分の人種集団で多くても30%である。従って、かなりの数の患者は、ワクチン療法の恩恵を受けられていない。これに加えて、HLA-B拘束性エピトープは、HLA-B遺伝子座において特に優性なアレルが恐らく存在しないためにほとんど同定されていない。しかし、既知のがん抗原を含む多くの有用なHLA-B-拘束性エピトープが存在するはずである。もしHLA-B-拘束性CTLが刺激できれば、抗がんワクチン療法の有効性は実質的に向上すると考えられる。



合成ペプチドベースのワクチン療法に関連した制限を克服するための可能な手段として、遺伝子ベースのワクチン療法、例えば、プラスミドDNAワクチン法や組換えウイルスを用いたワクチン法が考慮されている。しかしながら、プラスミドベースのDNAワクチンは、抗がん免疫を誘導するには十分な効果がない。組換えウイルスを用いた療法は、感染性ウイルスの患者への投与に伴う潜在的リスクが問題となる。がん抗原提示遺伝的改変樹状細胞を用いたワクチン法は、それらに比べて、より効果的でより安全である。



樹状細胞はヒト血液中に極めて少ない数で存在するので、抗がん治療に用いられる樹状細胞は通常は、末梢血中の単球をインビトロで分化させることによって作製する。がん抗原提示樹状細胞を作製するための手段として、ウイルスベクターを用いた単球の遺伝的改変が報告されている(非特許文献1~3)。しかし、通常、単球は増殖できず、トランスジェニック細胞を選択して増殖されることは実現可能な手段ではない。そこで、樹状細胞又はその前駆体である単球を増殖させる方法が、抗原提示樹状細胞をより効果的に作製するために望まれている。



本発明者は以前、レンチウイルスを用いてBMI1とともにcMYCを形質導入することにより、CD14+単球の増殖を誘導できることを報告した。この結果は、ヒト単球の増幅法を最初に確立したものであり、本発明者は、単球由来の増殖細胞をCD14-MLと名付けた(特許文献1、非特許文献4)。増殖したCD14-MLは、培地へのIL-4の添加により、機能的な樹状細胞(CD14-ML-DCs)へと分化した。この方法の一つの欠点は、増殖誘導はドナー依存性が大きく、CD14+単球の増殖は、報告では健常者12人の血液ドナー中3例(約30%)で成功していない。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、血液、特には末梢血由来の単球の増殖誘導方法に関する。本発明はまた、該増殖誘導方法を用いた単球の大量作製方法に関する。本発明はさらには、免疫療法に用いることができる単球由来樹状細胞を提供する方法であり、また、それらの樹状細胞を用いた免疫療法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ヒト末梢血由来の単球の増殖誘導方法であって、
単球に、少なくとも以下の3つの遺伝子:cMYC、BMI1、及びBCL2又はLYL1遺伝子を導入して発現させることにより、増殖能を有する単球を作製することを含む方法。

【請求項2】
 
前記末梢血由来の単球が凍結保存されていない新鮮な単球である請求項1に記載の単球の増殖誘導方法。

【請求項3】
 
前記単球が、がん患者由来の単球である請求項1又は2に記載の単球の増殖誘導方法。

【請求項4】
 
ヒト末梢血由来の単球から樹状細胞を作製する方法であって、以下の工程:
(a)請求項1~3のいずれか一つに記載の単球の増殖誘導方法により増殖能を有する単球を作製する工程、及び
(b)前記増殖能を有する単球を培養することにより樹状細胞へと分化誘導する工程、
を含む樹状細胞作製方法。

【請求項5】
 
さらに、前記工程(b)で作製した樹状細胞を任意の抗原で負荷(load)して抗原提示樹状細胞を作製することを含む、請求項4に記載の樹状細胞作製方法。

【請求項6】
 
さらに、前記工程(b)で作製した樹状細胞に任意の抗原の遺伝子を導入して抗原提示樹状細胞を作製することを含む、請求項4に記載の樹状細胞作製方法。

【請求項7】
 
請求項1~3のいずれか一つに記載の単球の増殖誘導方法により作製した増殖能を有する単球を含む医薬。

【請求項8】
 
請求項4~6のいずれか一つに記載の方法で作製した樹状細胞を含む医薬。

【請求項9】
 
前記医薬が、がんの治療又は予防のために用いるための医薬である請求項8に記載の医薬。

【請求項10】
 
請求項5又は6で作製した抗原提示樹状細胞を、末梢血由来のCD4T細胞又はCD8T細胞と共培養することにより、該抗原特異的なCD4Tセルライン又はCD8Tセルラインを樹立する方法。

【請求項11】
 
増殖能を有するヒト末梢血由来の単球であって、
少なくとも以下の3つの外因性(exogeneous)遺伝子:
cMYC、BMI1、及びBCL2又はLYL1遺伝子
を有し、それらが強制的に発現している単球。

【請求項12】
 
前記末梢血由来の単球が凍結保存されていない新鮮な単球である請求項11に記載の単球。

【請求項13】
 
前記単球が、がん患者由来の単球である請求項11又は12に記載の単球。

【請求項14】
 
請求項11~13のいずれか一つに記載の単球から分化誘導した樹状細胞。

【請求項15】
 
任意の抗原で負荷(load)されて該抗原を提示する、請求項14に記載の樹状細胞。

【請求項16】
 
任意の抗原の遺伝子を有しそれが強制的に発現されることにより該抗原を提示する請求項14に記載の樹状細胞。

【請求項17】
 
請求項11~13のいずれか一つに記載の単球を含む医薬。

【請求項18】
 
請求項14~16のいずれか一つに記載の樹状細胞を含む医薬。

【請求項19】
 
前記医薬が、がんの治療又は予防のために用いるための医薬である請求項18に記載の医薬。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2016012951thum.jpg
State of application right Published
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