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動物の血管透過性の高感度迅速測定方法

国内特許コード P05A007504
整理番号 測定・分析-67
掲載日 2005年9月21日
出願番号 特願2003-287673
公開番号 特開2005-055344
登録番号 特許第4119981号
出願日 平成15年8月6日(2003.8.6)
公開日 平成17年3月3日(2005.3.3)
登録日 平成20年5月9日(2008.5.9)
発明者
  • 八巻 幸二
  • 石川 祐子
出願人
  • 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 動物の血管透過性の高感度迅速測定方法
発明の概要

【課題】 動物(但し、ヒトを除く)、特に齧歯類の血管透過性を高感度かつ迅速に測定する方法を提供することを目的とすると共に、有機溶媒の使用量が少なく、また、保管・使用に制限のある物質を使用することのない、動物(但し、ヒトを除く)、特に齧歯類の血管透過性の測定方法を提供することを目的とする。
【解決手段】 蛍光色素でラベルした血清アルブミンを血漿成分の血管外透過の指標として用い、採取した測定部の皮膚をホルムアミドで加温浸漬し、蛍光プレートリーダーを用いた直接測定により動物(但し、ヒトを除く)の血管透過性を高感度かつ迅速に測定する方法を提供する。
【選択図】 図2

従来技術、競合技術の概要


食品のアレルギー・炎症の抑制効果を明らかにするにあたり、炎症によって惹き起こされる血漿成分の血管外漏出を測定し、血管透過性の多寡を検討することは効果的な手法である。



従来、例えば齧歯類の血管透過性の測定は、一般に図1に示すような手順で、染色色素を用いて行われていた(例えば、非特許文献1参照)。



即ち、まずダイレクトブルー(もしくはエバンスブルー)色素を齧歯類の尾静脈より投与する。
次いで、予め剃毛した背部皮膚に起炎剤を皮内投与する。
30分ほど経過し、齧歯類を屠殺した後、血液及び起炎剤等を投与した部分の皮膚を切り取り採取する。切り取り採取した皮膚からなる試験片を細断し、ガラス試験管にとり、アルカリで加水分解する。
一晩放置後、リン酸でアルカリを中和し、アセトンで色素を抽出する。血液及び皮膚から抽出した色素量を分光光度計により測定し、血漿漏出量として算出する。



しかしながら、これまで齧歯類の血管透過性を測定するために用いられてきた、このような染色色素による方法は、ダイレクトブルー(もしくはエバンスブルー)色素を皮膚から抽出する操作に時間がかかり、さらに色素抽出用に大量のアセトンを必要とし、色素が希釈されてしまうことから、感度が低いものであった。
また、加水分解のためと、その中和にアルカリ及び酸を使用するため、取扱いに注意が必要であると共に、有機溶媒の使用量が多いため、環境負荷が高いという問題があった。
さらに、指標として用いるダイレクトブルー色素は、強度の変異原性があるとして、第二種指定化学物質に指定されているものであり、保管・使用に制限がある。



このように、これまで動物(但し、ヒトを除く)、特に齧歯類の血管透過性を測定するために用いられてきた染色色素による方法は、感度が低く、また多くの時間を必要としたため、より感度が高く、かつ迅速な測定法の開発が求められていた。さらに、有害な物質の使用を最低限に抑えた測定法の開発が求められていた。




【非特許文献1】Ishida H. et al.;Br. J. Pharmacol. 130, 1235(2000)

産業上の利用分野


本発明は、動物(但し、ヒトを除く)の血管透過性を高感度かつ迅速に測定する方法に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
蛍光色素でラベルした血清アルブミンを血漿成分の血管外透過の指標として用い、これを動物(但し、ヒトを除く)に投与した後、測定部の皮膚を採取し、次いで、採取した測定部の皮膚からなる試験片を培養プレートの底に貼り付け、ホルムアミドを加えて加温浸漬した後、蛍光プレートリーダーを用いて、前記培養プレートの底に貼り付けられた前記試験片の蛍光値を直接測定することを特徴とする、動物(但し、ヒトを除く)の血管透過性を高感度かつ迅速に測定する方法。

【請求項2】
ホルムアミドでの加温浸漬を、0.5~2mlのホルムアミドを加え、40~60℃で1~3時間程度浸漬することにより行う請求項1記載の方法。
産業区分
  • 試験、検査
  • 治療衛生
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2003287673thum.jpg
出願権利状態 権利存続中


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