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イチゴの品種識別方法

国内特許コード P05A007518
整理番号 植物バイオ-187
掲載日 2005年9月21日
出願番号 特願2003-337714
公開番号 特開2005-102535
登録番号 特許第4065951号
出願日 平成15年9月29日(2003.9.29)
公開日 平成17年4月21日(2005.4.21)
登録日 平成20年1月18日(2008.1.18)
発明者
  • 國久 美由紀
  • 松元 哲
  • 吹野 伸子
出願人
  • 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 イチゴの品種識別方法
発明の概要

【課題】 多様なイチゴ品種を正確に識別することが可能であり、しかも、柔軟に対応できるとともに、イチゴ品種を正確に識別することができる方法イチゴの種苗、果実等を試料として、栽培条件や保存条件などに左右されずに、イチゴ品種を正確に識別することが可能な方法を提供すること。
【解決手段】 19種類のプライマー対のうちのいずれかをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種類より抽出したDNAを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したDNAの制限酵素による消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。
【選択図】 なし

従来技術、競合技術の概要


従来、イチゴの品種識別は、果実の形や大きさ、葉の形や大きさ、草型等の形質の比較により行われてきたが、この方法では正確な判断が極めて困難である上に、苗の大きさや生育状態等を揃えて同一の条件下で栽培した場合には有効であるが、果実のない苗では品種を識別することは事実上できないという問題があった。また、市場に流通しているイチゴは、多様な条件の下で栽培されているため、上記の従来方法では品種を識別することは困難であった。



このような問題点を解決すべく、本発明者らは、イチゴのガクを含む果実及び/又は葉より抽出したDNAを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したDNAの制限酵素による消化で生じる多型(DNA断片の長さの差異)を識別することを特徴とするイチゴの品種識別方法を開発した(特許文献1)。
特許文献1記載の識別方法では、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、APX-MluI、CHI-PvuII、F3H-NcoI、F3H-HpaII、F3H2-AccI、F3H-DdeI及びF3H-RsaIの7つのうち少なくとも1種を識別用DNAマーカーとして用い、DNA多型部分を検出することにより品種の識別を行う。しかし、7種のマーカーの全てを用いたとしても、識別可能な品種に限界があった。例えば、「女峰」と「アスカルビー」、「レッドパール」と「さつまおとめ」、および、「とよのか」と「はるのか」は、識別することができない。
昨今は、新品種の育種が活発であり、市場に流通する品種も多様化しているが、このように既存の品種の識別に限界がある特許文献1記載の方法は、このような状況に柔軟に対応することが困難である。



また、イチゴが遺伝的に8倍体であることに起因して、特許文献1で挙げられている7つの識別用DNAマーカーにより検出されるDNA多型断片は、視覚的に薄く、非常に見えにくい。そのため、PCRによるDNAの増幅が不十分であると、多型の判断に間違いが生ずる可能性があり、品種識別の正確性に問題があった。
このような状況下、識別可能な品種が限定されず、しかも多様化する市場において次々と生み出される新品種に柔軟に対応できる、イチゴの品種識別方法の開発が望まれていた。




【特許文献1】特願2002-155547号明細書

産業上の利用分野


本発明はイチゴの品種識別方法に関し、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種類より抽出したDNAを鋳型として、イチゴ品種間で相違性のある塩基配列を標的にしたPCR法によってDNAを増幅し、得られた増幅産物を制限酵素処理して得られるDNAの多型を検出し、これを識別することによってイチゴの品種を識別する技術に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号1記載の塩基配列からなるAPXFw2と配列番号2記載の塩基配列からなるAPXRv2をプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号37又は38記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドAPXを標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したAPX中の配列番号39で表されるMlu I認識配列を認識する制限酵素Mlu Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項2】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号3記載の塩基配列からなるCHIFwと配列番号4記載の塩基配列からなるCHIRv2をプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号40記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドCHIを標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したCHI中の配列番号41で表されるPvu II認識配列を認識する制限酵素Pvu IIによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項3】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号5記載の塩基配列からなるF3H2Fwと配列番号6記載の塩基配列からなるF3HRvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号42記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドF3H2を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したF3H2中の配列番号43で表されるAcc I認識配列を認識する制限酵素Acc Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項4】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号7記載の塩基配列からなるDFRFwと配列番号8記載の塩基配列からなるDFRRvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号44記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドDFRを標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したDFR中の配列番号45で表されるHha I認識配列を認識する制限酵素Hha Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項5】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号9記載の塩基配列からなるCTI1Fwと配列番号10記載の塩基配列からなるCTI1Rvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号46記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドCTI1を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したCTI1中の配列番号47で表されるHinf I認識配列を認識する制限酵素Hinf Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項6】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号11記載の塩基配列からなるMSRFwと配列番号12記載の塩基配列からなるMSRRvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号48記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドMSRを標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したMSR中の配列番号49で表されるAlu I認識配列を認識する制限酵素Alu Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項7】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号13記載の塩基配列からなるPGPFwと配列番号14記載の塩基配列からなるPGPRvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号50記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドPGPを標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したPGP中の配列番号43で表されるAcc I認識配列を認識する制限酵素Acc Iによる消化で生じる多型、および/または増幅したPGP中の配列番号51で表されるRsa I認識配列を認識する制限酵素Rsa Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項8】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号15記載の塩基配列からなるPGP2Fwと配列番号16記載の塩基配列からなるPGP2Rvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号52記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドPGP2を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したPGP中の配列番号51で表されるRsa I認識配列を認識する制限酵素Rsa Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項9】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号17記載の塩基配列からなるAPX2Fwと配列番号18記載の塩基配列からなるAPX2Rvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号53記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドAPX2を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したAPX2中の配列番号54で表されるDra I認識配列を認識する制限酵素Dra Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項10】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号19記載の塩基配列からなるAPX3Fwと配列番号18記載の塩基配列からなるAPX2Rvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号55記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドAPX3を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したAPX3中の配列番号54で表されるDra I認識配列を認識する制限酵素Dra Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項11】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号20記載の塩基配列からなるAPX4Fwと配列番号18記載の塩基配列からなるAPX2Rvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号56記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドAPX4を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したAPX4中の配列番号57で表されるTaq I認識配列を認識する制限酵素Taq Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項12】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号21記載の塩基配列からなるAUBFwと配列番号22記載の塩基配列からなるAUBRvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号58記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドAUBを標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したAUB中の配列番号45で表されるHha I認識配列を認識する制限酵素Hha Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項13】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号23記載の塩基配列からなるOLPFwと配列番号24記載の塩基配列からなるOLPRvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号59記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドOLPを標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したOLP中の配列番号60で表されるDde I認識配列を認識する制限酵素Dde Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項14】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号25記載の塩基配列からなるCTI2Fwと配列番号26記載の塩基配列からなるCTI2Rvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号61記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドCTI2を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したCTI2中の配列番号62で表されるMbo I認識配列を認識する制限酵素Mbo Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項15】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号27記載の塩基配列からなるCYTFwと配列番号28記載の塩基配列からなるCYTRvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号63記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドCYTを標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したCYT中の配列番号64で表されるBsaB I認識配列を認識する制限酵素BsaB Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項16】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号29記載の塩基配列からなるtRNAFwと配列番号30記載の塩基配列からなるtRNARvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号65記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドtRNAを標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したtRNA中の配列番号66で表されるFok I認識配列を認識する制限酵素Fok Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項17】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号31記載の塩基配列からなるPYDFwと配列番号32記載の塩基配列からなるPYDRvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号67記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドPYDを標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したPYD中の配列番号68で表されるHae III認識配列を認識する制限酵素Hae IIIによる消化で生じる多型、および/または増幅したPYD中の配列番号69で表されるCfr13 I認識配列を認識する制限酵素Cfr13 Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項18】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号33記載の塩基配列からなるPYD2Fwと配列番号34記載の塩基配列からなるPYD2Rvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号70記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドPYD2を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したPYD2中の配列番号68で表されるHae III認識配列を認識する制限酵素Hae IIIによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項19】
必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するプライマーである、配列番号35記載の塩基配列からなるPYD3Fwと配列番号36記載の塩基配列からなるPYD3Rvをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも1種より抽出したDNAを鋳型として、配列番号71記載の塩基配列からなるイチゴ品種間で異なるポリヌクレオチドPYD3を標的としたPCR法によってDNAを増幅し、増幅したPYD3中の配列番号72で表されるHga I認識配列を認識する制限酵素Hga Iによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。

【請求項20】
とよのか、女峰、とちおとめ、章姫、さちのか、アイベリー、レッドパール、濃姫、サンチーゴ、ピーストロ、アイストロ、紅ほっぺ、けいきわせ、久留米IH-1号、久留米IH-2号、久留米9323号、セセナ、栃の峰、とちひめ、さがほのか、系統A-17、福岡S6号および宝交早生を対象品種とする、請求項1~19のいずれかに記載のイチゴの品種識別方法。

【請求項21】
配列番号1記載の塩基配列からなるAPXFw2、配列番号2記載の塩基配列からなるAPXRv2、配列番号3記載の塩基配列からなるCHIFw、配列番号4記載の塩基配列からなるCHIRv2、配列番号5記載の塩基配列からなるF3H2Fw、配列番号6記載の塩基配列からなるF3HRv、配列番号7記載の塩基配列からなるDFRFw、配列番号8記載の塩基配列からなるDFRRv、配列番号9記載の塩基配列からなるCTI1Fw、配列番号10記載の塩基配列からなるCTI1Rv、配列番号11記載の塩基配列からなるMSRFw、配列番号12記載の塩基配列からなるMSRRv、配列番号13記載の塩基配列からなるPGPFw、配列番号14記載の塩基配列からなるPGPRv、配列番号15記載の塩基配列からなるPGP2Fw、配列番号16記載の塩基配列からなるPGP2Rv、配列番号17記載の塩基配列からなるAPX2Fw、配列番号18記載の塩基配列からなるAPX2Rv、配列番号19記載の塩基配列からなるAPX3Fw、配列番号20記載の塩基配列からなるAPX4Fw、配列番号21記載の塩基配列からなるAUBFw、配列番号22記載の塩基配列からなるAUBRv、配列番号23記載の塩基配列からなるOLPFw、配列番号24記載の塩基配列からなるOLPRv、配列番号25記載の塩基配列からなるCTI2Fw、配列番号26記載の塩基配列からなるCTI2Rv、配列番号27記載の塩基配列からなるCYTFw、配列番号28記載の塩基配列からなるCYTRv、配列番号29記載の塩基配列からなるtRNAFw、配列番号30記載の塩基配列からなるtRNARv、配列番号31記載の塩基配列からなるPYDFw、配列番号32記載の塩基配列からなるPYDRv、配列番号33記載の塩基配列からなるPYD2Fw、配列番号34記載の塩基配列からなるPYD2Rv、配列番号35記載の塩基配列からなるPYD3Fw、および、配列番号36記載の塩基配列からなるPYD3Rvの中から選ばれた少なくとも1種である、必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅するイチゴの品種識別用プライマー。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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23076_01SUM.gif
出願権利状態 権利存続中


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