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ゲノム物理地図作成法及び作成装置

国内特許コード P05A007520
整理番号 植物バイオ-185
掲載日 2005年9月21日
出願番号 特願2003-341476
公開番号 特開2005-102614
登録番号 特許第4581076号
出願日 平成15年9月30日(2003.9.30)
公開日 平成17年4月21日(2005.4.21)
登録日 平成22年9月10日(2010.9.10)
発明者
  • 大谷 敏郎
  • 山本 公子
  • 杉山 滋
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 ゲノム物理地図作成法及び作成装置
発明の概要 【課題】 SNOMによりライブラリークローンやマーカーをパキテン期染色体上に高分解能で直接位置づけることにより位置情報を回復するゲノム物理地図作成方法及び装置。
【解決手段】 探針1の先端から蛍光色素で標識されたマーカーを励起する光が照射され、試料からの蛍光は、対物レンズ4を通して集光された後、検出器5において検出される。位置決め機構3をXY方向に2次元的に走査を行うことによって、試料表面の形状と蛍光像を取得し、試料上の蛍光標識を0.5μm以下の分解能で検出することができる。検出された蛍光標識の信号は、制御装置および信号解析装置を兼ねたコントローラー6により、蛍光標識の染色体上での位置と染色体の形状データを解析し、マーカーの染色体上での相対位置関係または絶対位置を決定して、ゲノム物理地図を作成する。
【選択図】 図4
従来技術、競合技術の概要


従来、一般に行われている物理地図の作成手順を以下に示す。
まず、対象生物の組織から全ゲノムDNAを抽出し、細かく断片化し、BAC(bacterial artificial chromosome)やYAC(yeast artificial chromosome)などのベクターにクローニングしてゲノムDNAライブラリーを作成する。次に、ライブラリーに含まれるクローンを何種類かの制限酵素によって切断し、切断サイトのクローン上の位置を決定して制限酵素地図を作成する。その後、各クローンの間で制限酵素地図を比較し、その切断パターンの解析から隣り合うクローンを決定する(フィンガープリント法)。複数のクローンについて隣接関係を特定し、ある程度の長さの領域をカバーするクローンのグループをコンティグと呼ぶ。
この作業と並行して、遺伝地図を参照して、得られたコンティグを染色体上に位置付ける。マーカーのうち配列情報を有するものを利用し、その塩基配列をもとにPCRプライマーないしハイブリダイゼーションプローブを作成して、ライブラリーの中から、そのマーカーの配列を有するものを特定する。あるコンティグに含まれるクローンのひとつが、このようにして染色体上に位置づけられれば、そのコンティグそのものの染色体上の位置も明らかになる。
以上の作業を繰り返して、染色体のほぼ全域にコンティグを位置づけることができれば物理地図が完成する。
一方、近接場光プローブ顕微鏡(Scanning Near-field Optical Microscopy、SNOM)を用いて染色体にハイブリダイズさせた蛍光標識を観察した例は、J. Microsc. 182, 40-45 (1995)やJ. Microsc. 209, 22-33 (2003)などこれまでに少数があるが、いずれも染色体上に数百から数万ヶ所存在する反復配列を対象としており、ゲノムライブラリークローンや遺伝子マーカー(原則的に染色体上に1ヶ所のみ存在)の計測は行った例はない。また、従来例の計測分解能は300nm程度と低く、本発明に必要とされる条件を満たしていない。さらに、これまでに、ハイブリダイズした蛍光シグナルの位置と染色体形状の比較解析からゲノム上の物理位置を算出するような試みはいっさい行われていない。



【非特許文献1】
J. Microsc. 182, 40-45 (1995)
【非特許文献2】
J. Microsc. 209, 22-33 (2003)

産業上の利用分野


本発明は、SNOM/AFMを用いて真核生物のゲノム物理地図を作成する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
真核生物のゲノム物理地図を作成する方法であって、
真核生物由来のDNA断片を蛍光標識する工程、
蛍光標識した該DNA断片を、該真核生物から調製した染色体上のDNAとハイブリダイゼーションさせる工程、及び
ハイブリダイゼーションされた蛍光標識DNAの染色体上の位置を、0.5μm以下の分解能で検出する工程、
を含み、
前記検出工程を、近接場光プローブ顕微鏡を用いて行う、
前記ゲノム物理地図作成方法。

【請求項2】
前記真核生物由来のDNA断片が、該真核生物から抽出したゲノムDNAを断片化し、断片化したゲノムDNAをクローニングベクターに挿入してクローニングすることにより作成したゲノムDNAライブラリーに含まれるクローンである、請求項1記載のゲノム物理地図作成方法。

【請求項3】
前記真核生物由来のDNA断片が、該真核生物由来の遺伝子配列、cDNA、あるいは既知のゲノム塩基配列情報により人工的に合成されたDNA、または、既知のゲノム塩基配列あるいはランダムな配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして該真核生物のゲノムDNAからPCRにより増幅したDNAである、請求項1記載のゲノム物理地図作成方法。

【請求項4】
前記染色体が、分裂期染色体またはパキテン期染色体である、請求項1記載のゲノム物理地図作成方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2003341476thum.jpg
出願権利状態 登録


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