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SSR法によるイグサ品種識別

国内特許コード P05A007535
整理番号 植物バイオ-196
掲載日 2005年9月21日
出願番号 特願2003-408328
公開番号 特開2005-168308
登録番号 特許第4465442号
出願日 平成15年12月5日(2003.12.5)
公開日 平成17年6月30日(2005.6.30)
登録日 平成22年3月5日(2010.3.5)
発明者
  • 齋藤 彰
  • 土門 英司
出願人
  • 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 SSR法によるイグサ品種識別
発明の概要

【課題】 イグサの品種識別に利用し得るDNAマーカーを同定し、イグサ産業における品種識別の判断材料を提供する。
【解決手段】 イグサの品種識別に有用なプライマーであって、該プライマーが、イグサ特異的な配列を有するオリゴヌクレオチド、もしくは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするプライマー部位にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むか、または少なくとも10ヌクレオチドの長さを有する該オリゴヌクレオチドの断片である、オリゴヌクレオチドからなる、プライマー;あるいは該プライマーが、該オリゴヌクレオチドを用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅断片の塩基配列に由来し得る配列を有し、かつ少なくとも10ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、プライマープライマーが提供される。
【選択図】 なし

従来技術、競合技術の概要


イグサは主に栄養繁殖で増殖・栽培されており、これまで育成された品種は、栄養系品種である。



従来、イグサの品種特性は茎長(草丈)、茎の太さ、幹茎色(茎の色)、茎数(一株あたりの茎の数)花序着生率(着花の頻度)、先枯程度(先端部分の枯れの程度)など産業上の品質に関わる特徴で表されてきた。しかし、これらの特性は量的形質であって、生育環境の変化に応じてそれらの形質も変化するため、一定の栽培環境における品種の特徴を説明することはできても、確実に品種を識別するマーカーとしては利用できなかった。このため、いったん入手経路が不確実になるとどの品種であるのか断定することは困難であった。その結果、いくつかの品種が混ざって製品の均一性が失われたり、あるいは優良品種の盗難、不法栽培を防止・規制することができなかった。



品種識別への分子生物学的技術の適用に関して、SSRマーカーはゲノムDNA中の遺伝子をコードしていない非コード領域に主に見られる単純反復配列(Simple Sequence Repeats)を利用し、SSRの反復回数が種系統間で異なる性質に基づいて品種系統を識別する方法である。SSRの検出は、PCRで増幅したDNA断片を電気泳動で分離し、DNA断片を蛍光色素で検出する方法で行う。品種の識別は,検出されたDNA断片長の違いを基準品種と比較することで行う。品種系統の識別には複数のDNAマーカーを併用することが望ましい。SSRマーカーはPCRによって増幅するDNA断片長の組み合わせによって、一回のPCR反応に付き4~5種類のSSRマーカーで遺伝子型を比較すること(マルチプレックス(multiplex)法)が可能であり、アガロースゲル電気泳動と組み合わせれば96サンプル程度の多検体の検出が3~4時間で可能であるため、スクリーニング的な用途に適用可能である。特に、イグサ製品の品種識別では、試料1点あたり20本程度の独立した茎からのDNA抽出とPCRが必要であるため、PCRのコストを抑えることが重要である。また、DNAシーケンサーを利用することで高精度の遺伝子型識別が可能となる。



他方、近年の分子生物学的技術の適用に関しては、九州農業試験場と熊本県農業研究センターい業研究所が平成9~10年に「RAPD法によるイグサ品種識別」について共同研究を行った。しかし、開発されたDNAマーカーは熱処理によって断片化した原草のDNAから安定に多型を検出することは困難であり、実用的な品種識別マーカーは全く得られなかった。このため、イグサの品種を識別することは極めて困難であった。

産業上の利用分野


本発明は、イグサ品種識別に関し、より詳細には、イグサ主要栽培品種のうち、最も優良な品質を持ち産業価値の高い品種「ひのみどり」と他の品種を識別するためのDNAマーカーおよび該マーカーを標的としてイグサ主要栽培品種から品種「ひのみどり」を識別する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
イグサ「ひのみどり」の品種識別に有用なプライマー対であって、以下の1)~13):
1)CTTCTCAAATTCTCCTGGTCCGAGT(配列番号1)および
TCAGACGACTGAGATCGCTTAACAG(配列番号2);
2)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)および
CTTCTTCACTCCTAACGGTGCAACT(配列番号4);
3)GATCGCGATTGAATTACCTTGGA(配列番号5)および
ACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTGA(配列番号6);
4)GTTTCTCACTGGCCGCTTCATC(配列番号7)および
CCAGCATTTTGAGATGAGACTTTGA(配列番号8);
5)CCAAGGCGCGTTGATTTGTACT(配列番号9)および
TCCCGGCCTTTGAGATTCAACT(配列番号10);
6)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)および
TTCTTCACTCCTAACGGTGCAACTC(配列番号13);
7)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)および
TCTTCACTCCTAACGGTGCAACTC(配列番号14);
8)ATTCAGAGCAGAAACAAGCCAACAA(配列番号15)および
CTTCTTCACTCCTAACGGTGCAACT(配列番号4);
9)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)および
GCTCTCTCCTTCTTCACTCCTAACG(配列番号16);
10)GATCGCGATTGAATTACCTTGGA(配列番号5)および
GACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTG(配列番号17);
11)GATCGCGATTGAATTACCTTGGA(配列番号5)および
CGATAATTTTCCTCGTGTCCTTGAA(配列番号18);
12)GTGGATCGCGATTGAATTACCTT(配列番号19)および
ACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTGA(配列番号6);ならびに
13)GTGGATCGCGATTGAATTACCTT(配列番号19)および
GACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTG(配列番号17)
からなる群より選択される、プライマー対。

【請求項2】
イグサ「ひのみどり」の品種識別に有用なプライマー対であって、以下のi)~xiii):
i)CTTCTCAAATTCTCCTGGTCCGAGT(配列番号1)の全長または断片および
TCAGACGACTGAGATCGCTTAACAG(配列番号2)の全長または断片;
ii)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)の全長または断片および
CTTCTTCACTCCTAACGGTGCAACT(配列番号4)の全長または断片;
iii)GATCGCGATTGAATTACCTTGGA(配列番号5)の全長または断片および
ACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTGA(配列番号6)の全長または断片;
iv)GTTTCTCACTGGCCGCTTCATC(配列番号7)の全長または断片および
CCAGCATTTTGAGATGAGACTTTGA(配列番号8)の全長または断片;
v)CCAAGGCGCGTTGATTTGTACT(配列番号9)の全長または断片および
TCCCGGCCTTTGAGATTCAACT(配列番号10)の全長または断片;
vi)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)の全長または断片および
TTCTTCACTCCTAACGGTGCAACTC(配列番号13)の全長または断片;
vii)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)の全長または断片および
TCTTCACTCCTAACGGTGCAACTC(配列番号1)の全長または断片;
viii)ATTCAGAGCAGAAACAAGCCAACAA(配列番号15)の全長または断片および
CTTCTTCACTCCTAACGGTGCAACT(配列番号4)の全長または断片;
ix)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)の全長または断片および
GCTCTCTCCTTCTTCACTCCTAACG(配列番号1)の全長または断片;
x)GATCGCGATTGAATTACCTTGGA(配列番号5)の全長または断片および
GACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTG(配列番号17)の全長または断片;
xi)GATCGCGATTGAATTACCTTGGA(配列番号5)の全長または断片および
CGATAATTTTCCTCGTGTCCTTGAA(配列番号18)の全長または断片;
xii)GTGGATCGCGATTGAATTACCTT(配列番号19)の全長または断片および
ACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTGA(配列番号6)の全長また
は断片;ならびに
xiii)GTGGATCGCGATTGAATTACCTT(配列番号19)の全長または断片および
GACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTG(配列番号17)の全長または断片
からなる群より選択され、
該各々の断片が少なくとも17ヌクレオチドの長さである、プライマー対。

【請求項3】
前記断片が20~25ヌクレオチドの長さである、請求項2に記載のプライマー

【請求項4】
イグサ「ひのみどり」の品種識別に有用なプライマー対であって、以下のa)~m):
a)CTTCTCAAATTCTCCTGGTCCGAGT(配列番号1)およびTCAGACGACTGAGATCGCTTAACAG(配列番号2)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
b)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)およびCTTCTTCACTCCTAACGGTGCAACT(配列番号4)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
c)GATCGCGATTGAATTACCTTGGA(配列番号5)およびACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTGA(配列番号6)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
d)GTTTCTCACTGGCCGCTTCATC(配列番号7)およびCCAGCATTTTGAGATGAGACTTTGA(配列番号8)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
e)CCAAGGCGCGTTGATTTGTACT(配列番号9)およびTCCCGGCCTTTGAGATTCAACT(配列番号10)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り
返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
f)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)およびTTCTTCACTCCTAACGGTGCAACTC(配列番号13)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
g)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)およびTCTTCACTCCTAACGGTGCAACTC(配列番号14)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
h)ATTCAGAGCAGAAACAAGCCAACAA(配列番号15)およびCTTCTTCACTCCTAACGGTGCAACT(配列番号4)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
i)AGATTCAGAGCAGAAACAAGCCAAC(配列番号3)およびGCTCTCTCCTTCTTCACTCCTAACG(配列番号16)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
j)GATCGCGATTGAATTACCTTGGA(配列番号5)およびGACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTG(配列番号17)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
k)GATCGCGATTGAATTACCTTGGA(配列番号5)およびCGATAATTTTCCTCGTGTCCTTGAA(配列番号18)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;
l)GTGGATCGCGATTGAATTACCTT(配列番号19)およびACG
ATAATTTTCCTCGTGTCCTTGA(配列番号6)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対;ならびに
m)GTGGATCGCGATTGAATTACCTT(配列番号19)およびGACGATAATTTTCCTCGTGTCCTTG(配列番号17)を用いてイグサの試料DNAを増幅させて得られた増幅産物の断片の塩基配列に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、該塩基配列の相補鎖に由来し得る配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプライマーとを含み、
該増幅産物中に含まれる単純反復配列であるCT反復またはGA反復を、PCRサイクル(96℃ 2分;96℃ 5秒、58℃ 15秒、および72℃ 30秒を30回繰り返す;72℃ 2分間)により増幅可能である、プライマー対
からなる群より選択され、各々のプライマーが少なくとも17ヌクレオチドの長さである、プライマー対。

【請求項5】
前記各々のプライマーが20~25ヌクレオチドの長さである、請求項4に記載のプライマー対。

【請求項6】
請求項1~5のうちの一項に記載のプライマー対に含まれる、プライマー。

【請求項7】
イグサ「ひのみどり」の品種識別に有用なプライマー対の組み合わせであって、
請求項1の1)~13)に記載のプライマー対の各々、請求項2のi)~xiii)に記載のプライマー対の各々、請求項3に記載のプライマー対、請求項4のa)~m)に記載のプライマー対の各々、および請求項5に記載のプライマー対からなる群より選択される2種以上のプライマー対
を含む、プライマー対の組み合わせ。

【請求項8】
イグサの品種を識別する方法であって、以下の工程を包含する、方法:
(a)請求項1~5のうちのいずれか1項に記載のプライマー対または請求項7に記載のプライマー対の組み合わせを用いて、イグサの試料DNAを増幅させる工程;
および
(b)該増幅産物を検出する工程。

【請求項9】
前記プライマー対が少なくとも2つである、請求項8に記載の識別方法。

【請求項10】
前記プライマー対が少なくとも3つである、請求項9に記載の識別方法。

【請求項11】
前記プライマー対が少なくとも4つである、請求項10に記載の識別方法。

【請求項12】
イグサから試料DNAを抽出する工程をさらに包含する、請求項8から11のうちのいずれか一項に記載の方法。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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11428_01SUM.gif
出願権利状態 権利存続中


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