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レポーター遺伝子に由来するmRNAの定量により遺伝子転写機能を測定する方法、及び、それに用いる各種プライマー

国内特許コード P05A007601
整理番号 NIRS-196
掲載日 2005年9月22日
出願番号 特願2004-025304
公開番号 特開2005-211032
登録番号 特許第4348435号
出願日 平成16年2月2日(2004.2.2)
公開日 平成17年8月11日(2005.8.11)
登録日 平成21年7月31日(2009.7.31)
発明者
  • 石原 弘
  • 田中 泉
出願人
  • 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構
発明の名称 レポーター遺伝子に由来するmRNAの定量により遺伝子転写機能を測定する方法、及び、それに用いる各種プライマー
発明の概要
【課題】試料に多量に共存する外来DNAの存在下であっても、ごく微量しか存在しない外来遺伝子に由来するmRNAから増幅されたcDNAを選択的に測定することが可能である方法を提供すること。
【解決手段】リアルタイム PCR法を利用した、極微量の外来遺伝子に由来するmRNAを選択的に定量する方法、該定量法を利用して構造遺伝子コード領域の上流に結合させた任意の配列の転写機能(転写調節能力)を測定する方法、及び、それに用いる各種プライマー。
【選択図】
図1
従来技術、競合技術の概要


ゲノムプロジェクトにより複数の生物種のゲノムの塩基配列が判明したが、その機能については殆ど判明していない。塩基配列の機能研究はポストゲノム研究としては重要な位置を占めている。機能研究には様々な段階があるが、DNAからmRNAを合成する過程である転写過程を調節する段階の調節機構の研究は最も研究が進んでいる。しかし、この転写調節の研究方法には制限があり、より良い測定技術開発が模索されている。



特定の塩基配列の転写に及ぼす機能を真核生物の生細胞内で測定するためにはレポーター遺伝子法が頻用されている。この方法は、検定する塩基配列をホタルルシフェラーゼ遺伝子等のアミノ酸コード配列の上流に連結してレポーター遺伝子を構築し、これを細胞に導入した後に、ルシフェラーゼ等の酵素活性を測定することにより、検定する塩基配列の遺伝子誘導能力を測定するものである。この方法は、生細胞内でレポーター遺伝子が前駆RNAに転写されてmRNAに成熟し、そのmRNAが翻訳されて酵素となり、酵素活性を発揮した後に測定がなされるものである。



このような従来のレポーター法に内包される問題点としては次の4点がある。
第一に、従来のレポーター法では、転写機能を測定する目的であるにも拘わらず、実際は転写の後RNAが翻訳されて蛋白質が合成され、ある程度蓄積された後に測定可能になる。このことは、転写から測定までにタイムラグの発生することを意味しており、急速な転写の制御の研究には原理的に不適である。実際、物理・化学処理をした細胞において、特定の遺伝子の転写が急速に増減することが、数多く知られているが、その転写機能を詳細に研究することは不可能である。



第二に、レポーター遺伝子を細胞に導入する効率が変化し易いことである。そのため、外来のDNAを細胞に導入する効率がシャーレ間、および、実験間で偏差が発生しやすいと考えられる。これを解決するために、細胞に二種類の異なるレポーター遺伝子を同時に導入して、両レポーター蛋白質活性を比較する方法もあるが、下記第三の問題により正確さに限界がある。



第三に、蛋白質の機能をもって分析することの限界である。真核生物の細胞における転写から翻訳までの過程の調節が殆ど解明されておらず、また、生成した蛋白の細胞内における安定性が変化しやすいので、細胞の状態や試料調製過程で値に相違が出やすく、測定値の偏差増大の原因と見なされている。特に、細胞に対して物理・化学的誘導した場合、その誘導が蛋白合成過程で作用する可能性も高い。こうした蛋白合成段階での作用が、転写段階での影響と判断されてしまう危険性がある。



上記一から三までの問題を解決するために、これまでもレポーター遺伝子に由来するmRNAを測定する試みがなされてきた。例えば、リアルタイムPCRによる極微量のRNAを分析した報告が近年増加しつつある(総説Giulietti
A, Overbergh L, Valckx D, Decallonne B, Bouillon R, Mathieu C.: An overview of
real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression. Methods.
25, 386-401, 2001.等参照)。



又は、通常のRT-PCRを用いて転写物を測定したという報告 (Kovacs DM, Kaplan BB.: Discordant estimates
of heterologous promoter activity as determined by reporter gene mRNA levels
and enzyme activity. Biochem Biophys Res Commun. 189: 912-918, 1992)や、リアルタイムRT-PCRを利用して転写物を測定したという報告
(Jeyaseelan K, Ma D, Armugam A.: Real-time detection of gene promoter activity:
quantitation of toxin gene transcription. Nucleic Acids Res. 29: E58,
2001.)もあるが、両者ともRNA試料を調製する過程で、導入したレポーターDNAを検出不能な量まで除去して定量に影響させないようにすることが必須であるために、試料調製の条件やその技量等に左右され、再現性に問題のあることが予想される。



更に、残存するプラスミドDNAによる定量への影響を回避するために、専用のレポーター遺伝子を構築して、スプライシングを受けたレポーターRNAだけを選択的に通常のRT-PCR(Morales
MJ, Gottlieb DI.: A polymerase chain reaction-based method for detection and
quantification of reporter gene expression in transient transfection assays.
Anal Biochem. 210: 188-194, 1993. Kastenbauer S, Wedel A, Frankenberger M,
Wirth T, Ziegler-Heitbrock HW.: Analysis of promoter activity by polymerase
chain reaction amplification of reporter gene mRNA. Anal Biochem. 233: 137-139,
1996. )により定量する例が報告されている。しかし、両者とも、特殊な専用レポーターを新たに作製する必要があり、普及には至っていない。



【非特許文献1】
GiuliettiA, Overbergh L, Valckx D, Decallonne B, Bouillon R, Mathieu C.: An overview ofreal-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression. Methods. 25, 386-401, 2001
【非特許文献2】
KovacsDM, Kaplan BB.: Discordant estimates of heterologous promoter activity asdetermined by reporter gene mRNA levels and enzyme activity. BiochemBiophys Res Commun. 189: 912-918, 1992
【非特許文献3】
JeyaseelanK, Ma D, Armugam A.: Real-time detection of gene promoter activity:quantitation of toxin gene transcription. Nucleic Acids Res. 29: E58,2001.
【非特許文献4】
MoralesMJ, Gottlieb DI.: A polymerase chain reaction-based method for detection andquantification of reporter gene expression in transient transfection assays. Anal Biochem. 210: 188-194, 1993
【非特許文献5】
Kastenbauer S, Wedel A,Frankenberger M, Wirth T, Ziegler-Heitbrock HW.: Analysis of promoter activityby polymerase chain reaction amplification of reporter gene mRNA. Anal Biochem.233: 137-139, 1996

産業上の利用分野


本発明は、リアルタイム PCR法を利用した、極微量の外来遺伝子に由来するmRNAを選択的に定量する方法に関する。更に、該定量法を利用して構造遺伝子コード領域の上流に結合させた任意の配列の転写機能(転写調節能力)を測定する方法、及び、それに用いる各種プライマーに関する。本発明方法は、トランジエント導入によるレポーター法の変法である。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の一般式(I)に示される塩基配列を含む、外来遺伝子に由来するmRNAを選択的に定量するための逆転写反応用プライマー:
一般式(I) 5’N-S-(T) -3’。
(式中、Nは5塩基以下の任意の塩基配列、特異配列Sは塩基配列:AGCACTGACCGATGTCACGを含む塩基数が19~25の配列であってTm値が60℃以下である、mは10~19の整数)。

【請求項2】
配列番号1に示される塩基配列から成る、請求項1記載の逆転写反応用プライマー。

【請求項3】
以下の一般式(II)に示される塩基配列を含む、外来遺伝子に由来するmRNAを選択的に定量するためのリバースPCRプライマー:
一般式(II) 5’S-(T) -3’。
(式中、特異配列Sは塩基配列:AGCACTGACCGATGTCACGを含む塩基数が19~25の配列であってTm値が60℃である、nは2~5の整数)。

【請求項4】
配列番号2に示される塩基配列から成る、請求項3記載のリバースPCRプライマー。

【請求項5】
請求項3又は4記載のリバースPCRプライマー、及び、転写停止配列に由来するフォワードPCRプライマーの組み合わせから成る、外来遺伝子に由来するmRNAを選択的に定量するためのPCRプライマーセット。

【請求項6】
フォワードPCRプライマーの塩基数が20~30であり、Tm値が58~62℃の範囲にある、請求項6記載のPCRプライマーセット。

【請求項7】
転写停止配列が、SV40の転写停止配列及び合成された転写停止配列から成る群から選択される、請求項7又は8記載のPCRプライマーセット。

【請求項8】
フォワードPCRプライマーが配列番号3に示される塩基配列から成る、請求項7記載のPCRプライマーセット。

【請求項9】
転写停止配列が合成された転写停止配列である、請求項5又は6記載のPCRプライマーセット。

【請求項10】
フォワードPCRプライマーが配列番号5に示される塩基配列から成る、請求項9記載のPCRプライマーセット。

【請求項11】
転写停止配列が内在性遺伝子由来の転写停止配列である、請求項5又は6記載のPCRプライマーセット。

【請求項12】
フォワードPCRプライマーが配列番号7に示される塩基配列から成る、請求項11記載のPCRプライマーセット。

【請求項13】
請求項1又は2記載の逆転写反応用プライマー、請求項5~12のいずれか一項に記載のPCRプライマーセット、及び、フォワードPCRプライマーと同じ転写停止配列に由来するTaqMan(商標)プローブを含む、外来遺伝子に由来するmRNAを選択的に定量するためのリアルタイムPCR用キット。

【請求項14】
TaqManプローブの塩基数が22~40であり、Tm値が68~70℃の範囲にある、請求項13記載のリアルタイムPCR用キット。

【請求項15】
TaqManプローブが配列番号4、6及び8に示される塩基配列から成る群から選択される、請求項14記載のリアルタイムPCR用キット。

【請求項16】
請求項1又は2記載の逆転写反応用プライマー、請求項5~12のいずれか一項に記載のPCRプライマーセット、又は、請求項15~17のいずれか一項に記載のリアルタイムPCR用キットを用いてcDNAを増幅させ、細胞内で発現された外来遺伝子に由来するmRNAを定量する方法。

【請求項17】
請求項16記載の方法を用いて、任意の配列の転写機能により細胞内で発現されたレポーター遺伝子由来のmRNAを定量し、該配列の転写機能を測定する方法。

【請求項18】
更に、外来遺伝子であるレポーター遺伝子及びリファレンス遺伝子由来のmRNAを定量し、それらを比較することにより、外来DNAの細胞への導入効率の変動を制御することを特徴とする、請求項17記載の方法。

【請求項19】
レポーター遺伝子とリファレンス遺伝子を同時に細胞に導入することを特徴とする、請求項18記載の方法。

【請求項20】
更に、内在性遺伝子由来のmRNAを定量し、それに対するレポーター遺伝子及びリファレンス遺伝子由来のmRNAの相対的な量を判定する段階を含む、請求項17~19のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】
更に、測定機器のウェル間の偏差を制御するために、本測定に先だって等量の標準DNAを鋳型とした予備リアルタイムPCR測定を行い、利用可能なウェルの組合せを選定する段階を含む、請求項17~20のいずれか一項に記載の方法。
国際特許分類(IPC)
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