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カイコ中部絹糸腺特異的遺伝子発現系を利用したタンパク質の製造方法

国内特許コード P06A009353
掲載日 2006年10月13日
出願番号 特願2005-072401
公開番号 特開2006-137739
登録番号 特許第5131798号
出願日 平成17年3月15日(2005.3.15)
公開日 平成18年6月1日(2006.6.1)
登録日 平成24年11月16日(2012.11.16)
優先権データ
  • 特願2004-279527 (2004.9.27) JP
発明者
  • 田村 俊樹
  • 瀬筒 秀樹
  • 小林 功
  • 小島 桂
  • 神田 俊男
  • 内野 恵郎
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 カイコ中部絹糸腺特異的遺伝子発現系を利用したタンパク質の製造方法
発明の概要 【課題】カイコの中部絹糸線における組換えタンパク質の生産方法を提供することを課題とする。
【解決手段】セリシン遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるGFPを有するトランスジェニックカイコを作出した。該カイコの最終齢の幼虫の絹糸腺を観察した結果、中部絹糸腺でのみ蛍光が観察された。また、吐糸期ころからGFPは中部絹糸腺の細胞から分泌され、GFPが腺腔内に移動していることがわかった。最終的にはGFPは繭糸として吐糸され、GFPを大量に含む繭が作られた。このことから、セリシン遺伝子のプロモーター領域を利用することにより、中部絹糸腺において組換えタンパク質を生産することが可能であることが分かった。また、中部絹糸腺で生産された組換えタンパク質は容易に中部絹糸腺の内腔に分泌されることが分かった。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要


組換えタンパク質を生産する方法として、大腸菌や酵母、哺乳動物の培養細胞、植物や動物の個体を使う方法等が知られている。これらの方法はいずれも短所と長所があり、生産しようとするタンパク質の性質や使用目的に応じて、使い分けられている。



昆虫を使った組換えタンパク質の生産系については、これまでに鱗翅目昆虫の核多角体病ウイルスによる方法と組換えカイコを用いる方法が開発されている。前者はベクターとしてDNA型のウイルスを用いている。そのため、比較的容易に組換えウイルスを作出し、これをカイコなどの幼虫個体に感染させることができる。感染後、ウイルスは昆虫の個体内で増殖し、これに伴ってウイルス中に導入した遺伝子から組換えタンパク質が合成される。この場合、ウイルス感染後の幼虫は数日後には死滅し、死ぬ直前のカイコ体液を採取してタンパク質を精製する。そのため、生産できるタンパク質量は多くの場合、体液1ml当たり1mg以下で、精製に多くの労力を要するという問題点がある。



組換えカイコを用いる方法は、カイコの絹糸線という特殊な器官を利用する。絹糸腺は前部、中部、後部に分けられ、異なった機能を持っている。即ち、前部絹糸腺はほとんどタンパク質の生産機能はなく、繭糸タンパク質の75%は後部絹糸腺において、残りの25%は中部絹糸腺で生産される。作られるタンパク質は後部絹糸腺ではフィブロインであり、中部絹糸腺ではセリシンである。これまでの研究で後部絹糸腺特異的な遺伝子発現系を作出してきたが、中部絹糸腺については組換えタンパク質を作るのに成功した例はない。
【非特許文献1】
田村俊樹(1999)トランスポゾンを利用した形質転換カイコの作出方法.第7回昆虫機能研究会講演要旨、p49-56.
【非特許文献2】
Horn, C., B. Jaunich and E. A. Wimmer,(2000)Highly sensitive, fluorescent transformation marker for Drosophila transgenesis. Dev Genes Evol 210: 623-629.
【非特許文献3】
Horn, C., and E. A. Wimmer,(2000)A versatile vector set for animal transgenesis. Dev Genes Evol 210: 630-637.
【非特許文献4】
Thomas, J. L., M. Da Rocha, A. Besse, B. Mauchamp and G. Chavancy, 2002 3xP3-EGFP marker facilitates screening for transgenic silkworm Bombyx mori L. from the embryonic stage onwards. Insect Biochem Mol Biol 32: 247-253.
【非特許文献5】
Tamura, T., Thibert, C., Royer ,C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C. and Couble, P. (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector Nature Biotechnology 18, 81-84.
【非特許文献6】
Berghammer, A. J., M. Klingler and E. A. Wimmer,(1999) A universal marker for transgenic insects. Nature 402: 370-371.
【非特許文献7】
富田正浩、佐藤勉、安達敬泰、宗綱洋人、田村俊樹、神田俊男、吉里勝利(2001)ヒトコラーゲン遺伝子を組み込んだトランスジェニックカイコの作出.第24回日本分子生物学会年会講演要旨.p.854
【非特許文献8】
Tomita M, M. H., Sato T, Adachi T, Hino R, Hayashi M, Shimizu K, Nakamura N, Tamura T, Yoshizato K.,(2003)Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol 21, 52-56
【非特許文献9】
田村俊樹(2000)トランスジェニックカイコ:現状と展望.日蚕雑69、1-12.
【非特許文献10】
田村俊樹(2000)カイコ発生における有用遺伝子導入.第21回基礎育種シンポジウム報告:動植物分子育種における発生工学的手法の展開。p23-29.
【非特許文献11】
Tamura, T., Quan, G.X., Kanda, T., and Kuwabara, N. (2001) Transgenic silkworm research in Japan: Recent progress and future. Proceeding of Joint International Symposium of Insect COE Research Program and Insect Factory Research Project. p77-82.
【非特許文献12】
Imamura, M., Nakai, J., Inoue, S., Quan, G-X., Kanda T., and Tamura, T.(2003)Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori. Genetics 165, 1329-1340.
【非特許文献13】
Inoue, S., Tanaka, K., Tanaka, H., Ohtomo, K., Kanda, T., Imamura, M., Quan, G-X., Kojima, K., Yamashita, T., Nakajima, T., Taira, H., Tamura, T., and Mizuno, S. (2004) Assembly of the silk fibroin elementary unit in endoplasmic reticulum and a role of L-chain for protection of α1,2-mannose residues in N-linked oligosaccharide chains of fibrohexamerin/P25. Eur. J. Biochem. 271, p356-366.
【非特許文献14】
Tamura, T. (2003) Silkworms: Germ line transformation technology and production of useful substance. Farming Japan 37(3), 20-25.
【非特許文献15】
山田勝成・田中 貴・平松紳吾・田村俊樹(2003)絹糸中に生理活性タンパク質を産生する組換えカイコの作出.ブレインテクノニュース 97, 6-10.
【非特許文献16】
田村俊樹(2003)遺伝子組換えカイコと新繊維.高分子 52 (11), 822-825.
【非特許文献17】
田村俊樹(2004)組換え体カイコを利用した有用物質の生産系の開発とその展望.バイオインダストリー21(3)、28-35.

産業上の利用分野


本発明は、カイコ中部絹糸腺特異的遺伝子発現系を利用したタンパク質の製造方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の(a)および(b)の工程を含む、任意のタンパク質の製造方法:
(a)セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、および該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該任意のタンパク質を回収する工程。

【請求項2】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、および該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。

【請求項3】
トランスジェニックカイコが、任意のタンパク質を中部絹糸腺細胞から中部絹糸腺内腔に分泌するトランスジェニックカイコである、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
トランスジェニックカイコが、以下の(i)および(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項1~3のいずれかに記載の方法:
(i)セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。

【請求項5】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUAS、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項1~4のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項1~4のいずれかに記載の方法。

【請求項7】
以下の(a)および(b)の工程を含む、任意のタンパク質の製造方法:
(a)セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合したGAL4をコードするDNA、およびUASの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該任意のタンパク質を回収する工程。

【請求項8】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合したGAL4をコードするDNA、およびUASの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。

【請求項9】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、請求項1~8のいずれかに記載の方法:
(a)配列番号:1に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNAであって、プロモーター活性能を持つDNA。

【請求項10】
任意のタンパク質が、絹糸腺細胞から絹糸腺内腔への分泌シグナルを有さないタンパク質である、請求項1~のいずれかに記載の方法。

【請求項11】
トランスジェニックカイコが裸蛹系統のカイコ由来である、請求項1~10のいずれかに記載の方法。

【請求項12】
トランスジェニックカイコがセリシン蚕由来である、請求項1~10のいずれかに記載の方法。

【請求項13】
トランスジェニックカイコがNd-sD由来である、請求項1~10のいずれかに記載の方法。

【請求項14】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、および該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコ。

【請求項15】
任意のタンパク質を中部絹糸腺細胞から中部絹糸腺内腔に分泌する、請求項14に記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項16】
以下の(i)および(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項14または15に記載のトランスジェニックカイコ:
(i)セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。

【請求項17】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUAS、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項1416のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項18】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項1416のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項19】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合したGAL4をコードするDNA、およびUASの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコ。

【請求項20】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、請求項14~19のいずれか一項に記載のトランスジェニックカイコ:
(a)配列番号:1に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNAであって、プロモーター活性能を持つDNA。

【請求項21】
任意のタンパク質が、絹糸腺細胞から絹糸腺内腔への分泌シグナルを有さないタンパク質である、請求項1420のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項22】
裸蛹系統のカイコ由来である、請求項1421のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項23】
セリシン蚕由来である、請求項1421のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項24】
Nd-sD由来である、請求項1421のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項25】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。

【請求項26】
転写制御因子がGAL4またはTetRである、請求項25に記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項27】
転写制御因子がGAL4である、請求項25に記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項28】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合したGAL4をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。

【請求項29】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、請求項25~28のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ:
(a)配列番号:1に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNAであって、プロモーター活性能を持つDNA。

【請求項30】
裸蛹系統のカイコ由来である、請求項2529のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項31】
セリシン蚕由来である、請求項2529のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項32】
Nd-sD由来である、請求項2529のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。

【請求項33】
以下の(a)および(b)からなる群より選択される、請求項1~13のいずれかに記載の方法に用いるためのDNA:
(a)セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA
(b)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNA。

【請求項34】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUAS、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項33に記載のDNA。

【請求項35】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項33に記載のDNA。

【請求項36】
以下の(a)および(b)からなる群より選択される、請求項1~13のいずれかに記載の方法に用いるためのDNA:
(a)セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合したGAL4をコードするDNA
(b)UASの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNA。

【請求項37】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、請求項33または36に記載のDNA:
(a)配列番号:1に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNAであって、プロモーター活性能を持つDNA。

【請求項38】
任意のタンパク質が、絹糸腺細胞から絹糸腺内腔への分泌シグナルを有さないタンパク質である、請求項3337のいずれかに記載のDNA。

【請求項39】
請求項1~13のいずれかに記載の方法に用いるための、以下の(a)および(b)のDNAの組み合わせからなるキット:
(a)セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA
(b)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNA。

【請求項40】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUAS、または、転写制御因子がTetRであり、標的プロモーターがTREである、請求項39に記載のキット。

【請求項41】
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項39に記載のキット。

【請求項42】
請求項1~13のいずれかに記載の方法に用いるための、以下の(a)および(b)のDNAの組み合わせからなるキット:
(a)セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合したGAL4をコードするDNA
(b)UASの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNA。

【請求項43】
セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、請求項39または42に記載のキット:
(a)配列番号:1に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNAであって、プロモーター活性能を持つDNA。

【請求項44】
任意のタンパク質が、絹糸腺細胞から絹糸腺内腔への分泌シグナルを有さないタンパク質である、請求項39~43のいずれかに記載のキット。

【請求項45】
トランスポゾンの逆位末端反復配列の間に、請求項3338のいずれかに記載のDNAを挿入したベクター。

【請求項46】
請求項45に記載のベクターとトランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するベクター(ヘルパーベクター)を含むキット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録


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