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物質と蛋白質との間の相互作用の検出方法、物質と相互作用する蛋白質のスクリーニング方法、及び、物質とその物質と相互作用する蛋白質との複合体の形成方法

国内特許コード P07A013152
掲載日 2008年3月10日
出願番号 特願2003-519415
登録番号 特許第3706942号
出願日 平成14年8月7日(2002.8.7)
登録日 平成17年8月12日(2005.8.12)
国際出願番号 JP2002008078
国際公開番号 WO2003014734
国際出願日 平成14年8月7日(2002.8.7)
国際公開日 平成15年2月20日(2003.2.20)
優先権データ
  • 特願2001-239175 (2001.8.7) JP
  • 特願2002-172129 (2002.6.12) JP
発明者
  • 柳川 弘志
  • 宮本 悦子
  • 松村 展敬
  • 土居 信英
  • 舘山 誠司
  • 石坂 正道
  • 堀澤 健一
出願人
  • 学校法人慶應義塾
発明の名称 物質と蛋白質との間の相互作用の検出方法、物質と相互作用する蛋白質のスクリーニング方法、及び、物質とその物質と相互作用する蛋白質との複合体の形成方法
発明の概要

ベイトと蛋白質であるプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法において、プレイを、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とし、ベイトは分離用修飾を有するようにし、無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイを含む融合蛋白質をコードするmRNAの翻訳を行うことにより、翻訳と相互作用の工程をカップリングし、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は分離用修飾及び検出用標識を利用して、in vitro(試験管内)で、蛋白質間、核酸-蛋白質間などの相互作用の解析を高感度で行う。あるいは、ベイトが蛋白質である場合は、無細胞共翻訳系で、前記ベイトを含む融合蛋白質をコードするmRNAの翻訳、および前記プレイを含む蛋白質あるいは融合蛋白質をコードするmRNAの翻訳により、翻訳と相互作用の工程をカップリングし、ベイトとプレイを生成させ相互作用せしめ、複合体の検出は分離用修飾および検出用標識を利用して、in vitro(試験管内)で、蛋白質間、核酸-蛋白質間などの相互作用の解析を高感度で行う。

特許請求の範囲 【請求項1】ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、
プレイは蛋白質であり、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイを含む融合蛋白質をコードするmRNAの翻訳を行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は、分離用修飾及び検出用標識を利用して行われることを特徴とする前記方法。
【請求項2】ベイトが蛋白質であり、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするmRNAの翻訳が行われることにより、ベイトが無細胞翻訳系に存在する請求項1記載の方法。
【請求項3】ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするmRNAの翻訳を、翻訳されたプレイが該mRNAと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は、分離用修飾及び翻訳されたプレイと会合したmRNAを利用して行われることを特徴とする前記方法。
【請求項4】mRNAが、その3'末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該mRNAと会合する請求項3記載の方法。
【請求項5】ペプチドアクセプター領域が、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と1残基もしくは2残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなる請求項4記載の方法。
【請求項6】スペーサー領域が、ポリエチレングリコール(PEG)を主成分としたPEG領域である請求項4又は5記載の方法。
【請求項7】mRNAが、その3'末端領域に長さが2~10塩基のポリA配列を有する請求項4~6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするDNAの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該DNAと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させ、複合体の検出は、分離用修飾及び翻訳されたプレイと会合したDNAを利用して行われることを特徴とする前記方法。
【請求項9】DNAが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、DNAがビオチンにより標識され、DNA一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写及び翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該DNAと会合する請求項8記載の方法。
【請求項10】ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で前記翻訳を行う請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項11】ベイトが完全長蛋白質である請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項12】プレイが、複数のプレイからなるプレイライブラリーとして提供される請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項13】プレイをコードするDNAが、ランダムプライミングcDNAライブラリーとして提供される請求項8又は9記載の方法。
【請求項14】プレイをコードするDNAが、dTプライミングcDNAライブラリーとして提供される請求項8又は9記載の方法。
【請求項15】請求項1~14のいずれか1項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項16】選択工程で選択されたプレイを調製する調製工程を含み、
調製されたプレイを、検出工程で使用されたベイトの代わりに又はそのベイトと共に用いて、検出工程、選択工程及び調製工程を繰り返す、請求項15に記載の方法。
【請求項17】請求項3~7のいずれか1項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイをコードするmRNAを選択することによりプレイを選択する選択工程を含み、選択工程で選択されたmRNAを検出工程のmRNAとして用いて検出工程及び選択工程を繰り返す、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項18】請求項8又は9記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイをコードするDNAを選択することによりプレイを選択する選択工程を含み、選択工程で選択されたDNAを検出工程のDNAとして用いて検出工程及び選択工程を繰り返す、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項19】ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で検出工程での翻訳を行う請求項17又は18記載の方法。
【請求項20】ベイトが完全長蛋白質である請求項17~19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項21】検出工程におけるプレイが、複数のプレイからなるプレイライブラリーとして提供される請求項17~20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項22】検出工程における、プレイをコードするDNAが、ランダムプライミングcDNAライブラリーとして提供される請求項18記載の方法。
【請求項23】検出工程における、プレイをコードするDNAが、dTプライミングcDNAライブラリーとして提供される請求項18記載の方法。
【請求項24】選択工程において複数のプレイが選択される請求項21~23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項25】ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の形成方法であって、
プレイは蛋白質であり、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイを含む融合蛋白質をコードするmRNAの翻訳を行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させることを特徴とする前記方法。
【請求項26】ベイトが蛋白質であり、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされており、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするmRNAの翻訳が行われることにより、ベイトが無細胞翻訳系に存在する請求項25記載の方法。
【請求項27】ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の形成方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするmRNAの翻訳を、翻訳されたプレイが該mRNAと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させることを特徴とする前記方法。
【請求項28】mRNAが、その3'末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該mRNAと会合する請求項27記載の方法。
【請求項29】ペプチドアクセプター領域が、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と1残基もしくは2残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなる請求項28記載の方法。
【請求項30】スペーサー領域が、ポリエチレングリコール(PEG)を主成分としたPEG領域である請求項28又は29記載の方法。
【請求項31】mRNAが、その3'末端領域に長さが2~10塩基のポリA配列を有する請求項28~30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項32】ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の形成方法であって、
プレイは蛋白質であり、ベイトは分離用修飾を有し、
無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするDNAの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該DNAと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させることを特徴とする前記方法。
【請求項33】DNAが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、DNAがビオチンにより標識され、DNA一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写及び翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該DNAと会合する請求項32記載の方法。
【請求項34】ベイト及びプレイのいずれか又は両方と相互作用する物質の存在下で前記翻訳を行う請求項25~33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項35】ベイトが完全長蛋白質である請求項25~34のいずれか1項に記載の方法。
【請求項36】ベイトと、複数のプレイからなるプレイライブラリーとを接触させることにより、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させる工程が行われる請求項25~35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】ベイトと、複数のプレイからなるプレイライブラリーとを接触させることにより、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させる工程が行われ、プレイをコードするDNAが、ランダムプライミングcDNAライブラリーである請求項32又は33記載の方法。
【請求項38】ベイトと、複数のプレイからなるプレイライブラリーとを接触させることにより、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させる工程が行われ、プレイをコードするDNAが、dTプライミングcDNAライブラリーである請求項32又は33記載の方法。
【請求項39】複合体を形成するプレイが、複数のプレイからなる請求項25~38のいずれか一項に記載の方法。
産業区分
  • 試験、検査
  • 有機化合物
  • 高分子化合物
  • 薬品
  • 微生物工業
  • 治療衛生
国際特許分類(IPC)
画像

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出願権利状態 権利存続中
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