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インターフェロンアルファを誘導する免疫刺激オリゴヌクレオチド 新技術説明会

国内特許コード P08A013356
掲載日 2008年4月25日
出願番号 特願2004-053795
公開番号 特開2005-237328
登録番号 特許第3976742号
出願日 平成16年2月27日(2004.2.27)
公開日 平成17年9月8日(2005.9.8)
登録日 平成19年6月29日(2007.6.29)
発明者
  • 北川 治和
  • 伊保 澄子
  • 松木 孝澄
  • 山本 三郎
出願人
  • 江守商事株式会社
  • 国立大学法人福井大学
  • 国立感染症研究所長
  • 財団法人 ふくい産業支援センター
発明の名称 インターフェロンアルファを誘導する免疫刺激オリゴヌクレオチド 新技術説明会
発明の概要

【課題】新規な免疫刺激性オリゴヌクレオチドの提供。
【解決手段】特定の塩基配列を有する8種類の塩基配列を有するもののうち、何れかからなる免疫刺激オレゴヌクレオチドを有効成分として含む医薬品であって、生体に投与することによりTh1型免疫応答が誘導されるため、投腫瘍免疫賦活剤や感染症・癌ワクチンアジュバントおよび抗アレルギー剤として利用できる。
【選択図】なし

従来技術、競合技術の概要


細菌DNAの免疫刺激活性の発見と塩基配列:細菌DNAに出現頻度の高い、メチル化されていないシトシン・グアニンジヌクレオチド(5’-CpG-3’)を含む特定の塩基配列(CpG DNA)はToll-Like Receptor 9(TLR9)に認識されて哺乳動物の免疫系を活性化し、Th1免疫反応を誘導する。この概念の成立は、Tokunaga/Yamamotoらによる、BCGのDNA画分がI型インターフェロン(IFN)の産生とそれによって誘導されるNK細胞の活性化を惹起し、抗腫瘍効果を示すとの報告(Tokunaga T.,et al. J. Natl. Cancer. Inst.72:955-62(1984))に端を発する。



一連の研究において彼らは、活性のある配列として細菌DNAに出現頻度の高いパリンドローム型CpG DNAを同定した(Yamamoto S., et al. J. Immunol.148:4072-6(1992))。その後いくつかのグループからマウスやヒトB細胞に対する大腸菌DNA や非アンチセンスDNAによる免疫刺激活性が示され、非メチル化CpGを有しその両端に特定の塩基が配置された5’-PuPuCpGPyPy-3’がマウスB細胞活性化モチーフとしてKriegら(Krieg AM., et al. Nature.374:546-9(1995))により報告された。免疫刺激活性を示すCpG DNAには他にもユニークな配列が提示されているが、現在のところIFN誘導型、B細胞活性化型、その混合型に大別される(Verthelyi D., et al. Trends Immunol.24:519-22(2003))。



マウスNK細胞を活性化する塩基配列について:Tokunaga/Yamamotoのグループは、活性のある塩基配列を特定するためBCG蛋白をコードするcDNAから一定の長さの塩基配列を無作為に選び合成した。30鎖長塩基5’-ACCGATNNNNNNGCCGGTGACGGCACCACG-3’(Nは相補的塩基対)について検討した結果、NK活性の亢進にはNの部分がCpGを含み、片側の連続した3塩基にその相補的塩基が続いてパリンドローム構造をなすことが重要と考えた(Yamamoto S., et al. J. Immunol.148:4072-6(1992))。



KriegらはマウスB細胞活性化モチーフPuPuCpGPyPy(特にGACGTTが強力)にもNK活性亢進作用がある事から、NK細胞の活性化にとって重要な配列は非メチル化CpGであり、次に特定の塩基が結合することが必要であるが、そのモチーフがパリンドローム配列をとる必要はないと考えた(Krieg AM., et al. Nature.374:546-9(1995);Ballas ZK., et al. J.Immunol.157:1840-5(1996))。Boggsらは、CpGジヌクレオチドは必要であるがそれだけではNK細胞を活性化できず、CpGを囲む特定の塩基と背景配列およびそのチオール化やメチル化等の修飾形態がCpG DNAのNK細胞活性化を規定すると報告している(Boggs RL., et al. Antisense & Nucleic Acid Drug Development7:461-71(1997))。例えば、CpG DNAをチオール化するとNK細胞活性化作用は減弱する。



また、活性モチーフのCpGをメチル化するとNK活性は低下する。ただし、モチーフの塩基配列によってはCpGをメチル化しても活性が保たれていることもある。この場合、CpG DNAの全てのシトシンをメチル化すると活性は完全に失われる。これまでに報告されたNK活性亢進作用のあるCpG DNAは、そのモチーフがパリンドロームやPuPuCpGPyPyに限定されず、非メチル化CpGを中心にその外側に特定の塩基配列を配して6鎖長で構成されていることから、CpG DNAによるNK活性の亢進は、活性モチーフとその背景配列を含む全塩基配列およびその修飾形態によって構築される高次構造によって誘導されると考えられる。



マウスNK細胞がCpG DNAに反応するには活性化される必要がある: Yamamotoらは、CpG DNAによるNK活性の亢進は、NK細胞以外の細胞により産生されたType-IIFNを介していることを示した(Yamamoto S., et al. J. Immunol.148:4072-6(1992))。Klinmanらは、CpG DNAで誘導されるマウス脾細胞のIFN-γ産生細胞はNK細胞であるが、そのIFN-γ産生はIL-12抗体で阻止されることを報告している(Klinman DM., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.93:2879-83(1996))。Halpernらは、細菌DNAやCpG DNAが単球/マクロファージを刺激してIL-12やTNF-αの産生を誘導し、その結果、非付着細胞からIFN-γが産生されることを示した(Halpern MD., et al. Cellular Immunol.167:72-8(1996))。



Ballasらは、NK細胞はIL-12、IFN-α/β、及びTNF-αの存在下でCpG DNAに反応してNK活性が亢進することを示した。ChaceらもNK細胞の活性化はマクロファージ依存性であり、NK細胞はIL-12で活性化されると細菌DNAに対する反応性を獲得してIFN-γ産生が増幅されると報告している(Ballas ZK., et al. J.Immunol.157:1840-5(1996))。これらの結果より、活性化されていないマウスNK細胞はCpG DNAに反応できないが、CpG DNA刺激単球/マクロファージに由来するサイトカインの刺激を受けると活性化され、CpG DNA反応性を獲得すると考えられる。



CpG DNAによるヒトNK細胞の活性化: CpG DNAの作用はマウスの免疫系では顕著に現れるが、ヒトの系では概して反応性が低い。しかし、BCG DNAの宿主免疫介在性抗腫瘍活性は1980年代に報告されており、in vivo 及びin vitroいずれの系においてもNK活性が亢進する。一方、ヒト末梢血単核球(PBMC)は、CpG DNA刺激によってIFN-αやIL-12,IL-18を産生し、IL-12刺激を介してIFN-γ産生が誘導される(Bohle B., et al. Eur. J. Immunol.29:2344-53(1999))。これらの結果は、ヒトにおいてもマウスと同様に、樹状細胞や単球/マクロファージがCpG DNAによるNK細胞の活性化にかかわっていることを示唆している。



Ihoらは、ヒト単核球をBCG DNAで刺激してもIL-12の産生が顕著に誘導されないことから、ヒトではCpG DNAの作用機構や活性配列がマウスと異なっていると想定した。実際に、マウスにおいて活性があると報告されているPuPuCpGPyPy型CpG DNAのうち、B細胞を活性化する#1643 (gagaacgctcgaccttcgat)、IFN-γを誘導する#1618(tccatgacgttcctgatgct)、NK細胞を活性化するアンチセンスDNA#1758(tctcccagcgtgcgccat)、及びヒトB細胞を活性化する#2105(ttgcttccatcttcctcgtc)についてIFN-γ産生を指標にNK細胞の活性化を検討したが、いずれの配列も精製したヒトNK(CD56+)細胞を活性化することはなかった。



そこでBCG蛋白をコードするcDNAのうち、特定の6鎖長CpGパリンドローム(NNNNNN)を含む30鎖長DNA(Iho S., et al. J. Immunol. 163:3642-52(1999))、accgatNNNNNNgccggtgacggcaccacg、10種について検討したところ、そのうち7種にIFN-γ誘導活性を認めた。次に、ヒトNK細胞の活性化に有効でないマウスB細胞活性化モチーフaacgctとaacgtcを、ヒトNK細胞を活性化したCpG DNAの背景配列に挿入して、accgataacgctgccggtgacggcaccacgとaccgataacgtcgccggtgacggcaccacg(アンダーラインで示す配列を挿入)を合成し検討したが、活性は認められなかった。このことから、CpG DNAがNK細胞に認識されるには、CpG DNAの活性モチーフがパリンドローム構造をとる必要があると考えた。



しかし、同一配列においてもIFN-γ産生量がドナー間で変動し、至適配列にも個人差があったので、活性の弱いaccgatcgatcggccggtgacggcaccacgについて、アンダーラインのパリンドローム部CGATCGの両側にそれぞれ12鎖のGを付加し(g12CGA)検討した。Gを付加した理由は、ポリGは細胞親和性が高いうえDNAの高次構造を安定化させるからである。予想どおり、G付加によりCGATCGのIFN-γ誘導活性は上昇した。さらに強い活性を有する配列を求めて検討したところ、g12CGAのパリンドローム部を10塩基に反復伸長し、側鎖のそれぞれに10鎖のGを付加した全長30鎖のg10GACGA(GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG)に、より強い活性が認められた。



G10GACGAは1999年当時報告されていたヒトNK細胞活性化配列のなかでは最も強い活性を有する配列である。後述するように、NK細胞は活性化されると高いCpG DNA反応性を示すが、G10GACGAによるIFN-γの誘導は、抗IFN-α抗体などで非NK細胞由来サイトカインを中和しても消失しないので、ヒトNK細胞はCpG DNAに反応する能力を備えていると考えられる。G10GACGAにより産生されたIFN-γはオートクライン反応によりNK活性を亢進し、CD69、HLA-ABCの発現を誘導する。



活性化ヒトNK細胞のCpG DNA反応性:活性化されたNK細胞は、活性化されていないNK細胞に比べてCpG DNA反応性が高い(Iho S., et al. J. Immunol.163:3642-52(1999))。これは、非刺激NK細胞ではCpG DNAレセプターであるTLR9の発現が弱いことと一致している(Krug A., et al. J.Immunol.31:2154-63(2001))。しかし、NK細胞の活性化によりTLR9が誘導されるという報告はなく、活性化によってCpG DNA反応性が亢進するメカニズムは不明である。また、IL-2で活性化したNK細胞は非パリンドローム型CpG DNAにも反応する(Iho S., et al. J. Immunol.163:3642-52(1999))ので、CpG DNAの配列選択性に関しても検討が必要とされる。



ヒトNK細胞とマウスNK細胞のCpG DNA反応性の違い:ヒトNK細胞は活性化されてなくともCpG DNAに反応するが、マウスNK細胞は活性化されなければCpG DNAに反応しない。この反応性の違いについてはよくわかっていない。Ballasらは、5'-と3'-の両側にGの繰り返し配列を有するCpGパリンドローム(Ballas ZK., et al. J.Immunol.157:1840-5(1996))について検討したが、純化したマウスNK細胞やヒトNK細胞のいずれも活性化できなかった。Krugらの#2216(Krug A., et al. J.Immunol.31:2154-63(2001))は、GACGATCGTCを有するがヒトNK細胞を活性化しない。我々のg10GACGAとBallas/KrugらのCpG DNAの違いは、付加されたポリGの数とその修飾である。前者は非修飾型で、後者は一部がチオール化されている。



DNAのチオール化はDNase抵抗性を高めるが、DNA結合蛋白との相互作用が弱められるため免疫刺激活性の低下を招く。従って、チオール修飾がNK細胞のCpG 反応性を低下させている可能性がある。一方、ポリGを背景配列にもつ非修飾型CpGパリンドロームでもggggggggggggaacgttggggggggggggのように活性のないものがある(Iho S., et al. J. Immunol.163:3642-52(1999))。パリンドローム塩基の配列や長さも重要な要素と考えられる。後にヒトの細胞はマウス活性化モチーフに低反応性であることが報告されており、霊長類においてもCpG DNAに対する反応性が、ヒト・チンパンジー・サル間で異なることが判った事から、現在ではCpG DNA反応性には種差があるとのコンセンサスが得られている(Hartmann G., et al. J. Immunol.164:1617-24(2000))。さらにCpG DNA配列には細胞選択性があることも明らかになってきている(Verthelyi D., et al. Trends Immunol.24:519-22(2003))。



CpG DNAの細胞内取り込みとTLR9による認識: 最近の研究で、CpG DNAはTLR9のリガンドであることが明らかにされた(Hemmi H.,et al. Nature408:740-5(2000))。共焦点顕微鏡による観察では、CpG DNAの細胞膜への結合および細胞内取り込みに配列特異性はないが、CpG DNAはエンドゾームにTLR9と共に局在することが認められている。従って、CpG DNAはエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ、エンドゾーム膜に存在するTLR9により認識されると考えられている。CpG DNAが生物活性を示すにはエンドゾームで何らかの修飾を受けることが必要である。CpG DNAが細胞に取り込まれてTLR9に認識される過程、およびTLR9下流のシグナル伝達には複数分子の共同作業が必要であると考えられており、研究が進められている。



CpG DNAのシグナル伝達: CpG DNAの細胞内取り込みはCpG非特異的に行われるが、TLR9による認識から生物活性の発現にいたる過程はCpG特異的である。TLR9を強く発現する細胞はヒト末梢血では主にB細胞や形質細胞様樹状細胞(plasmacytoid dendritic cells:PDC)である(Hornung V., et al. J.Immunol.168:4531-7(2002))。CpG DNA刺激B細胞においてはp38とJNKの活性化が非常に早い時期に起こり、転写因子AP-1のDNA結合能が増加し関連遺伝子の転写が亢進する(Hartmann G., et al. J. Immunol.164:944-52(2000))。



PDCでは、CpG DNAはエンドサイトーシスによって取り込まれることによりTLR9に認識され、p38 MAPKの活性化をもたらす。続いてSTAT1がリン酸化され、STAT2、IRF-9と共にISGF3を形成する。これによってIRF-7遺伝子の転写が亢進し、産生されたIRF-7がIFN-α遺伝子の転写を誘導し、IFN-αが産生される。さらに、細胞外に分泌されたIFN-αがフィードバックしてJAK-STAT経路を刺激することにより大量のIFN-αが産生される(Takauji R., et al. J. Leukoc. Biol.72:1011-1019(2002))。



ポリG付加パリンドロームCpG DNAの重要性:CpG DNAは、CpGジヌクレオチドを含む最低6鎖の塩基が中心となって標的細胞に認識されるが、その活性は中心配列のみでなく、それを取り囲む塩基(背景塩基)の僅かな違いによって、大きく異なってくる。PDCに直接IFN-αの産生を誘導し、さらにオートクライン反応により大量のIFN-αを産生させるには、CpG DNAの中心配列がパリンドローム構造をとることが重要である。次に、その長さと位置、および両側塩基の種類が活性を左右する要因としてあげられる。実際に、中心配列“GACGATCGTC”に細胞膜親和性の高いGを連続して付加すると高い活性が誘導される。



一方、ポリGそのものはマウス脾細胞ではIFN-γ産生を抑制する(Halpern MD., et al. Immunopharmacology 29:47-52(1995))ことから、Gの付加は活性の消失・抑制にも影響することが懸念される。このことは、見方を変えれば、パリンドローム配列とGの付加様式を変えることでCpG DNA活性が調節でき、特定のサイトカインを選択的に誘導するCpG DNAが開発できる可能性を示している。実際、ポリG付加パリンドロームCpG DNAはPBMCにおいてIFN-αやIFN-γ産生を強く誘導するが、IL-12やIL-6は誘導しない。この配列はその後の研究でDまたはAタイプオリゴと呼ばれることになり、Kuramoto/Ihoらが1992年(Kuramoto E., et al.Jpn.J.Cancer Res.83:1128-31(1992))と1999年に報告したG10GACGAはこのタイプに含まれる。



連続的グアニンで構成されるDNA配列は、ポリG配列やG-カルテットと呼ばれており、CpG DNAの細胞内取り込みを増大させる。従って、ポリG付加パリンドロームCpG DNAでは、パリンドローム塩基配列により二重鎖重複領域が形成され、その末尾に付加されたポリGが、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を高め、DNAの高次構造を安定化させることにより活性発現が効率よく行われると考えられる。実際、ポリGを導入したCpG パリンドロームDNAはIFN-αやCXCL10誘導活性が高い。従って、Th1免疫反応が効率的に誘導されると考えられ、癌、アレルギー、及び感染症治療への有用性が期待できる。動物実験では、通常、チオール修飾CpG DNAが用いられるが、致命的な副作用をもたらすことが報告されている。これらの事から、安全で効果の高いTh1免疫刺激活性を有する非修飾型のポリG付加パリンドロームCpG DNAを開発することが重要である。




【特許文献1】公表特許公報(A)2002-510644

【特許文献2】公表特許公報(A)2002-517156




【非特許文献1】Tokunaga T.,et al. J. Natl. Cancer. Inst.72:955-62(1984)

【非特許文献2】Yamamoto S., et al. J. Immunol.148:4072-6(1992)

【非特許文献3】Krieg AM., et al. Nature.374:546-9(1995)

【非特許文献4】Verthelyi D., et al. Trends Immunol.24:519-22(2003)

【非特許文献5】Ballas ZK., et al. J.Immunol.157:1840-5(1996)

【非特許文献6】Boggs RL., et al. Antisense & Nucleic Acid Drug Development7:461-71(1997)

【非特許文献7】Klinman DM., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.93:2879-83(1996)

【非特許文献8】Halpern MD., et al. Cellular Immunol.167:72-8(1996)

【非特許文献9】Bohle B., et al. Eur. J. Immunol.29:2344-53(1999)




【非特許文献10】Iho S., et al. J. Immunol.163:3642-52(1999)

【非特許文献11】Krug A., et al. J.Immunol.31:2154-63(2001)

【非特許文献12】Hornung V., et al. J.Immunol.168:4531-7(2002)

【非特許文献13】Hartmann G., et al. J. Immunol.164:1617-24(2000)

【非特許文献14】Hemmi H.,et al. Nature408:740-5(2000)

【非特許文献15】Hartmann G., et al. J. Immunol.164:944-52(2000)

【非特許文献16】Takauji R., et al. J. Leukoc. Biol.72:1011-1019(2002)

【非特許文献17】Halpern MD., et al. Immunopharmacology 29:47-52(1995)

【非特許文献18】Kuramoto E., et al. Jpn. J. Cancer Res.83:1128-31(1992)

産業上の利用分野


本発明は、従来のCpG DNAが有するインターフェロンアルファ(IFN-α)誘導活性よりも十倍以上強力な誘導活性を有するオリゴヌクレオチドの配列に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
下記塩基配列:
GGGGGGGGGGACGATCGTCG(配列番号:7)
から成る免疫刺激オリゴヌクレオチド。

【請求項2】
請求項1に記載の、配列番号7の塩基配列から成る免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含む医薬。

【請求項3】
請求項1に記載の、配列番号7の塩基配列から成る免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分とし、さらに免疫調節因子を含む医薬。

【請求項4】
前記免疫調節因子が抗原又はアジュバントである、請求項2又は3に記載の医薬。
産業区分
  • 微生物工業
  • 薬品
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 権利存続中
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