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花色の予測方法 実績あり

国内特許コード P08A013414
掲載日 2008年5月30日
出願番号 特願2006-158794
公開番号 特開2007-325533
登録番号 特許第5039967号
出願日 平成18年6月7日(2006.6.7)
公開日 平成19年12月20日(2007.12.20)
登録日 平成24年7月20日(2012.7.20)
発明者
  • 橋本 文雄
  • 清水 圭一
  • ヤウワパクソポン ダララク
  • 坂田 祐介
出願人
  • 国立大学法人 鹿児島大学
発明の名称 花色の予測方法 実績あり
発明の概要

【課題】花卉の花色予測法を提供する。
【解決手段】花卉のフラボノイド生合成の色素前駆物質のB環の水酸化に関わるフラボノイド3',5’-水酸化酵素を含む酵素反応系の花粉親及び種子親配偶子由来の複対立遺伝子H、H、H、H及びHの組み合わせを、該複対立遺伝子に対応するフラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ遺伝子に基づいて開花前の花卉組織から決定し、遺伝子型H・Pg/pg・Cy/cy・Dp/dpについて花粉親及び種子親配偶子間の複対立遺伝子の組み合わせと花色との相関に基づいて、開花前の花卉の花色を予測する方法及びそのためのキット。
【選択図】図3

従来技術、競合技術の概要


花色発現の発現遺伝子に関する研究は、1980年代の前半より1990年代の後半の約20年間で大きな飛躍を遂げている。花色発現に関わる植物の生合成経路として、フラボノイド生合成がよく知られている。本経路の代謝産物であるフラボノイド中、特に、黄色い色を発現するフラボノール配糖体の色素や、赤から紫、青などの花色発現に重要なアントシアニンの色素は、他の色素と比べると普遍的に存在する。



トウモロコシ、キンギョソウ、ペチュニアの花色発現遺伝子の研究に関して、アントシアニン生合成の酵素をコードする構造遺伝子、例えば、カルコン合成酵素(CHS)、カルコン異性化酵素(CHI)、フラボン3-水酸化酵素(F3H)、フラボノイド3’-水酸化酵素(F3’H)、フラボノイド3’、5’-水酸化酵素(F3’、5’H)などの報告がある。また、アントシアニン生合成を調節する遺伝子、例えば、CHS、DFR、3GT、ANSなどを調節する遺伝子座の報告もある(非特許文献1)。



トルコギキョウの花色発現遺伝子に関して、メッセンジャーRNA(mNA)からコードされるF3’5’H遺伝子(F3’5’-H cDNA)をリンドウ、ペチュニア、ナスの類似遺伝子と比較した報告がある(非特許文献2)。この遺伝子は、紫色の花色を発現するデルフィニジンの生合成に関与することが示されている。



ペチュニアから単離したF3’5’-H cDNA、AK14をプローブとして利用し、トルコギキョウ(Eustoma russelianum)よりF3’5’-H cDNA、TG1を単離したという報告がある。さらに、TG1とAK14をペチュニアとタバコに挿入し、形質転換体植物の花色発現を調査した報告がある(非特許文献3)。さらにまた、フウリンソウ(Campanula medium)より単離したF3’5’-H cDNA、Ka1をタバコに挿入し、形質転換体植物の花色発現を調査し、本遺伝子が遺伝子工学を用いて花色を青色へ改変することのできる最も良好な遺伝子資源であるとの報告がある(非特許文献4)。



ニチニチソウ(Catharanthus roseus)より得られたチトクロームP450依存型フラボノイド水酸化酵素に関する報告がある。また、ペチュニアより得られたCYP75 Hf1 cDNAをプローブにして、ニチニチソウでF3’5’-H cDNAについてスクリーニング(heterologous screening)を行った結果、両者より得られたフラボノイド水酸化酵素は68~78%の相同性のあることが報告されている(非特許文献5)。



アサガオの花色多形に関して、アサガオの遺伝的表現型の変異は、通常遺伝子にトランスポゾンが挿入され、そのほとんどが改変された結果であるとの記載がある。また、アサガオの花色表現型を決定する遺伝子型が4つの遺伝子座で制御されるというメンデルの法則に従い、それらのなかでもA/a遺伝子座が上位優性(epistasis)であるとの記載がある(非特許文献6)。



トルコギキョウの花色発現に関わる遺伝子群の研究について、カルコン合成酵素(CHS)、カルコン異性化酵素(CHI)、フラボン3-水酸化酵素(F3H)、フラボノイド3’、5’-水酸化酵素(F3’5’H)、ジヒドロフラボノール還元酵素(DFR)、アントシアニン合成酵素(ANS)について、mRNAよりcDNAを合成し、それらの構造を解析したとの報告がある(非特許文献7)。これによると、トルコギキョウのF3’5’H cDNAは、1892bpの長さを持ち、これにより合成可能なフラボノイド3’、5’-水酸化酵素タンパクは510個のアミノ酸配列から成ることの記載がある。



ツルニチニチソウ(Vinca major)の花色発現に関わるフラボノイド3’、5’-水酸化酵素(F3’5’H)の研究に関して、ツルニチニチソウからPCR法により遺伝子クローンされたF3’5’H遺伝子を単離し、VmFH1と命名された。この遺伝子は、翻訳領域又は推定遺伝子領域(open reading frame、ORF)の塩基配列は1518bpであり、885bpと633bpの2つのエクソン(exon)から成る。また、この遺伝子は506個のアミノ酸をコードし、デルフィニジンを生合成できることから、将来、ユリ科植物の青色花改変植物を得るための第一段階の研究であることの記載がある(非特許文献8)。



ブドウ(Vitis vinifera)の果色発現に関わるアントシアニン生合成酵素遺伝子とその調節遺伝子の研究に関して、ブドウの果皮色は、myb-関連遺伝子であるVvmybA1遺伝子で発現し、品種「イタリア」と「ルビーオクヤマ」のクローン遺伝子の構造を解析した結果、VvmybA1遺伝子にはGret1(Grapevine retrotransposon 1)と称するレトロトランスポゾンが含まれていることが分かり、これがVvmybA1遺伝子をコードする上流部分に挿入されている理由から、変異を生じ、野生型の紫色の果皮色から自然に白色様の果皮色が出現したとの記載がある(非特許文献9)。また、ブドウの品種「キャビネットサウヴィニオン(Cabernet Sauvignon)」より4つのフラボノイド3’-水酸化酵素(F3’H)のDNAの遺伝子配列を明らかにしたとの記載がある(非特許文献10)。4つの遺伝子は、それぞれF3’h1、F3’h2、F3’h3、F3’h4と称し、同様の位置に二つのイントロン(intron)が挿入され、アサガオ、ダイズ、アラビドプシスと同様であったとの記載がある(非特許文献10)。



ペチュニア園芸品種のアントシアニジン3-グルコシド-ラムノシル変換酵素(anthocyanidin 3-glucoside-rhamnosyltransferase、RT)の遺伝子に、トランソポゾン様因子が挿入されたとの記載がある。トランソポゾン様因子はdTph3sと称し、これがRT遺伝子の1181bpの位置に挿入されることによって、赤色の花色を発現することができるとの記載がある。さらに、このトランスポゾンの挿入は不安定であり、挿入RT遺伝子から容易に抜け出すことができ、抜け出した後にはRT遺伝子にフットプリントを残し、フットプリントのあるRT遺伝子の方が、トランスポゾン様因子dTph3sが挿入されたRT遺伝子に比べて、赤色花を育種するためにはより利用価値があるとの記載がある(非特許文献11)。



また、ペチュニアのF3’5’Hをコードしている優性型遺伝子Hf1遺伝子と劣性型遺伝子hf1に関して、Hf1遺伝子の第3エクソン(exon)に、突然変異を起こすことのできる2つのトランスポゾン様因子dTph9とrTph1がそれぞれ挿入された遺伝子が、結果として劣性遺伝子であるhf1であることの報告がある(非特許文献12)。



特許文献1に、遺伝子型判定方法に関して、遺伝子にトランスポゾンが挿入された状態の長いDNA断片、遺伝子にトランスポゾンが挿入されたものの抜けた状態又は正常な中くらいの長さのDNA断片及びトランスポゾンのフットプリントに対応する短いDNA断片の長さを電気泳動法によって分析し、その組み合わせにより、これらを区別して、遺伝子型を判定することができることが記載されている。



特許文献2に、ライムギなどのムギ類の新規なトランスポゾン様因子に関して、トランスポゾン様因子は、有用資源植物の分子育種に資するプローブ又はプライマー、更には染色体マーカーを開発するためのツールとして有用であるという記載がある。



特許文献3に、イネのトランスポゾン様DNA及びその利用方法が記載されている。このトランスポゾン様DNAは、イネのフィトクロームA遺伝子のプロモーター領域に存在する(TA/AT)の繰り返し配列からなるマイクロサテライトの解析をする過程で、マイクロサテライト内に391bpから成るDNA断片として見出された。



特許文献4には、レトロトランスポゾン、プロモーター活性を有するDNA断片、及びその利用の記載がある。



特許文献5には、タバコのレトロトランスポゾンを利用した遺伝子破壊法に関して、レトロトランスポゾンを該植物に導入する工程、及び該レトロトランスポゾンが導入された植物を培養することにより再分化させ、形質転換植物を作出する工程を包含する方法が記載されている。



特許文献6には、フラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質及びそれをコードする核酸に関する記載がある。



特許文献7には、フラボノイド生合成をコードする遺伝子配列とその利用に関して、フラボノイド3’-ヒドロキシラーゼ(F3’H)、又はその関連蛋白、これらを利用することによって植物や植物器官の色素発現を制御することが記載されている。



特許文献8には、花色遺伝型交配法が記載されている。特に、フラボノイド生合成のB環の水酸化に関するフラボノイド3’-ヒドロキシラーゼ(F3’H)やフラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ(F3’、5’H)、などの遺伝に着目し、その遺伝の分離を調べた結果、ペラルゴニジン(Pgn)、シアニジン(Cyn)、デルフィニジン(Dpn)の生合成に関与するジヒドロフラボノールリダクターゼ(DFR)及びアントシアニジンシンターゼ(AS)の酵素系の遺伝が、それぞれPg/pg、Cy/cy、Dp/dpの遺伝子によって制御されていることと併せて、フラボノイド3’-ヒドロキシラーゼ(F3’H)やフラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ(F3’、5’H)の遺伝が4つの複対立遺伝子(multiple allele)によって制御されているという法則を見出し、結果として、遺伝子組み替え、放射線等照射などによる突然変異を起こさせる方法を用いなくても、花卉の色素遺伝子型(pigment genotype)からその花色を自由に創成できること、また、色素前駆体のB環の水酸化に関与するフラボノイド3’-ヒドロキシラーゼ(F3’H)とフラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ(F3’、5’H)の酵素反応系には、H、H、H、Hの4つの複対立遺伝子が存在し、これらが3’位の水酸化、5’位の水酸化、3’、5’位の水酸化、及び3’位と3’、5’位の水酸化を制御し、これらの組合せによって色素表現型と花色表現型が決定されることが記載されている。




【特許文献1】特開2004-201582

【特許文献2】特開2005-73561

【特許文献3】特開平11-206374号公報

【特許文献4】特開2002-291473

【特許文献5】国際公開WO00/71699号パンフレット

【特許文献6】特開2000-23686

【特許文献7】米国特許出願公開2005081264号明細書

【特許文献8】国際公開WO2004/103065号パンフレット

【非特許文献1】Holton、T.A.とCornish、E.C.、「Genetics and Biochemistry of Anthocyanin Biosynthesis」、The Plant Cell、1995年、第7巻、第1071-1083頁

【非特許文献2】Nielson、K.M.とPodivinsky、E.、「cDNA Cloning and Endogenous Expression of a Flavonoid 3’5’-Hydroxylase from Petals of Lisianthus (Eustoma grandiflorum)」、Plant Science、1997年、第129巻、第167-174頁

【非特許文献3】Shimada、Y.ら、「Expression of Chimeric P450 Genes Encoding Flavonoid-3’、5’-Hydroxylase in Transgenic Tobacco and Petunia Plants」、FEBS Letters、1999年、第461巻、第241-245頁

【非特許文献4】Okinaka、Y.ら、「Selective Accumulation of Delphinidin Derivatives in Tobacco Using a Putative Flavonoid 3’、5’-Hydroxylase cDNA from Campanula medium」、Bioscience Biotechnology and Biochemistry、2003年、第67巻、第161-165頁

【非特許文献5】Kaltenbach、M.ら「Flavonoid Hydroxylase from Catharanthus roseus: cDNA、Heterologous Expression、 Enzyme Properties and Cell-Type Specific Expression in Plants」、The Plant Journal、1999年、第19巻、第183-193頁

【非特許文献6】Clegg、M.T.とDurbin、M.L.、「Flower Color Variation: A Model for the Experimental Study of Evolution」、Proceeding of the National Academy of Science Colloquium、2000年、第97巻、第7016-7023頁

【非特許文献7】Nodaら、「Regulation of Gene Expression Involved in Flavonol and Anthocyanin Biosynthesis during Petal Development in Lisianthus (Eustoma grandiflorum)」、Physiologia Plantarum、2004年、第122巻、第305-313頁

【非特許文献8】Mori、S.ら、「Heterologous Expression of the Flavonoid 3’、5’-Hydroxylase Gene of Vinca major Alters Flower Color in Transgenic Petunia hybrida」、 Plant Cell Report、2004年、第22巻、第415-421頁

【非特許文献9】Kobayashi、S.ら、「Association of VvmybA1 Gene Expression with Anthocyanin Production in Grape (Vitis vinifera) Skin-Color Mutants」、 Journal of the Japanese Society of Horticutural Science、2005年、第74巻、第196-203頁

【非特許文献10】Jeong、S.T.ら、「Expression of the Flavonoid 3’-Hydroxylase and Flavonoid 3’、5’-Hydroxylase Genes and Flavonoid Composition in Grapes (Vitis vinifera)」、Plant Science、2006年、第170巻、第61-69頁

【非特許文献11】Nakajima、T.ら、「Insertion and Excision of a Transposable Element Governs the Red Floral Phenotype in Commercial Petunias」、Theoretical and Applied Genetics、2005年、第110巻、第1038-1043頁

【非特許文献12】Matsubara、K.ら、「Two Novel Transposable Elements in a Cytochrome P450 Gene Govern Anthocyanin Biosynthesis of Commercial Petunias」、Gene、2005年、第358巻、第121-126頁

産業上の利用分野


本発明は、花卉の花色発現に重要な役割を演じているフラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ(F3’、5’H)の遺伝子、並びに、この遺伝子を利用する花色の予測及び改変方法に関する。より詳しくは、本発明は、フラボノイド生合成に関与し、遺伝する花色遺伝型交配法の育種法に用いることができるF3’、5’H遺伝子構造が含まれる複対立遺伝子、及び/又は、複対立遺伝子にレトロトランスポゾン遺伝子が挿入されたF3’、5’H遺伝子を利用して、開花前の花卉の花色を予測する方法、或いは、花色を改変する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
明細書記載の図4に示す経路式のフラボノイド生合成の色素前駆物質のB環の水酸化に関わるフラボノイド3',5’-水酸化酵素を含む花卉の酵素反応系の花粉親配偶子及び種子親配偶子由来の複対立遺伝子H、H、H、H及びHの組み合わせを、電気泳動を用いて、該複対立遺伝子に対応するフラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ遺伝子のサイズに基づいて開花前の花卉組織から決定し、さらに遺伝子型H・Pg/pg(すなわち、PgPg,Pgpg又はpgpg)・Cy/cy(すなわち、CyCy,Cycy又はcycy)・Dp/dp(すなわち、DpDp,Dpdp又はdpdp)について花粉親配偶子及び種子親配偶子間の複対立遺伝子の組み合わせと花色との相関に基づいて開花前の花卉の花色を予測する方法であって、
ここで、複対立遺伝子Hが、該フラボノイド生合成の前駆物質でのB環の水酸化に関して3’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン(Pgn)とシアニジン(Cyn)の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子Hが該フラボノイド生合成の前駆物質でのB環の水酸化に関して5’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン(Pgn)の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子H又はHが、該フラボノイド生合成の前駆物質でのB環の水酸化に関して3’,5’位の水酸化を制御し、デルフィニジン(Dpn)の生合成に関与する遺伝子であり、並びに、複対立遺伝子Hが該フラボノイド生合成の前駆物質でのB環の水酸化に関して3’、5’位の水酸化を制御し、デルフィニジン(Dpn)の生合成に関与する遺伝子である、並びに、
(a)複対立遺伝子H又はHが、配列番号1の8525bpの塩基配列、又はその配列と95%以上の同一性を有しかつ該配列番号1の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、を含むDNAであり、及び該DNAに対応するEf3バンド(電気泳動)を示し、(b)複対立遺伝子H又はHが、配列番号2の3115bpの塩基配列、又はその配列と95%以上の同一性を有しかつ該配列番号2の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、を含むDNAであり、及び該DNAに対応するEf2バンド(電気泳動)を示し、(c)複対立遺伝子Hが、配列番号3の2498bpの塩基配列、又はその配列と95%以上の同一性を有しかつ該配列番号3の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、を含むDNAであり、及び該DNAに対応するEf1バンド(電気泳動)を示す、並びに、
花粉親配偶子及び種子親配偶子間の前記複対立遺伝子の組み合わせと花色が、下記の表(表中、Ef1はHホモを表す電気泳動バンドを示し、Ef2はH又はHホモを表す電気泳動バンドを示し、及びEf3はH又はHホモを表す電気泳動バンドを示す。)に示される相関を有する、
ことを特徴とする、前記方法。



【請求項2】
花卉が、双子葉植物又は単子葉植物から選択される、請求項に記載の方法。

【請求項3】
花卉がトルコギキョウである、請求項に記載の方法。

【請求項4】
複対立遺伝子H又はH由来の配列番号1の塩基配列又はその配列と95%以上の同一性を有しかつ該配列番号1の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、或いはその相補的塩基配列、を含むDNAであって、該複対立遺伝子Hが、該フラボノイド生合成の前駆物質でのB環の水酸化に関して3’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン(Pgn)とシアニジン(Cyn)の生合成に関与する遺伝子であり、該複対立遺伝子Hが該フラボノイド生合成の前駆物質でのB環の水酸化に関して5’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン(Pgn)の生合成に関与する遺伝子である、前記DNA

【請求項5】
前記DNAが、複対立遺伝子H又はH由来の配列番号2の塩基配列を含むDNAの第1エクソン配列中に、配列番号4のレトロトランスポゾンの塩基配列又はその配列と95%以上の同一性を有しかつ該配列番号4の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、が挿入されたDNAである、ただし該複対立遺伝子H又はHが、該フラボノイド生合成の前駆物質でのB環の水酸化に関して3’,5’位の水酸化を制御し、デルフィニジン(Dpn)の生合成に関与する遺伝子である、請求項に記載のDNA。

【請求項6】
配列番号4の塩基配列又はその配列と95%以上の同一性を有しかつ該配列番号4の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むレトロトランスポゾン。

【請求項7】
複対立遺伝子H由来の配列番号3の塩基配列又はその配列と95%以上の同一性を有しかつ該配列番号3の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、或いはその相補的塩基配列、を含むDNAであって、該複対立遺伝子Hが該フラボノイド生合成の前駆物質でのB環の水酸化に関して3’、5’位の水酸化を制御し、デルフィニジン(Dpn)の生合成に関与する遺伝子である、前記DNA

【請求項8】
請求項1~のいずれか一項に記載の方法によって開花前の花卉の花色を予測するためのキットであって、下記の(1)~(3)のDNA:
(1)複対立遺伝子H又はH由来の配列番号1の塩基配列又はその配列と95%以上の同一性を有しかつ該配列番号1の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、或いはその相補的塩基配列、を含むDNA、
(2)複対立遺伝子H又はH由来の配列番号2の塩基配列又はその配列と95%以上の同一性を有しかつ該配列番号2の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、或いはその相補的塩基配列、を含むDNA、並びに、
(3)複対立遺伝子H由来の配列番号3の塩基配列又はその配列と95%以上の同一性を有しかつ該配列番号3の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、或いはその相補的塩基配列、を含むDNA、
をプローブ又は遺伝子マーカーとして含む、前記キット。

【請求項9】
プローブが標識されている、請求項に記載のキット。

【請求項10】
花卉がトルコギキョウであり、ならびに、花粉親配偶子及び種子親配偶子間の前記複対立遺伝子の組み合わせと花色との相関を示す下記の早見表(表中、Ef1はHホモを表す電気泳動バンドを示し、Ef2はH又はHホモを表す電気泳動バンドを示し、及びEf3はH又はHホモを表す電気泳動バンドを示す。)をさらに含む、請求項又はに記載のキット。
産業区分
  • 微生物工業
  • 農林
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2006158794thum.jpg
出願権利状態 権利存続中
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