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インフルエンザ菌の検出方法、インフルエンザ菌検出用プライマーセット及びインフルエンザ菌検出用キット

国内特許コード P08S000180
整理番号 NUBIC-2004JP0055
掲載日 2009年4月3日
出願番号 特願2006-542239
登録番号 特許第5019431号
出願日 平成17年5月16日(2005.5.16)
登録日 平成24年6月22日(2012.6.22)
国際出願番号 JP2005008921
国際公開番号 WO2006043349
国際出願日 平成17年5月16日(2005.5.16)
国際公開日 平成18年4月27日(2006.4.27)
優先権データ
  • 特願2004-304879 (2004.10.19) JP
発明者
  • 関 みつ子
  • 鳥越 博貴
出願人
  • 学校法人日本大学
発明の名称 インフルエンザ菌の検出方法、インフルエンザ菌検出用プライマーセット及びインフルエンザ菌検出用キット
発明の概要

精確、迅速にインフルエンザ菌を検出可能なインフルエンザ菌の検出方法、インフルエンザ菌検出用プライマーセット及びインフルエンザ菌検出用キットを提供する。
インフルエンザ菌のDNAを鋳型とし、本発明の一例として配列番号1から5に示すLAMPプライマーを用いて核酸増幅を行い、この増幅産物の有無を検出する。配列番号1~5に記載の配列と相補的な配列を有するプライマーを用いた場合には、特異性に優れるのみでなく、検出感度及び検出の迅速性に優れる。また、本発明の他の例として、配列番号43~47に示すLAMPプライマーを用いて核酸増幅を行い、この増幅産物の有無を検出する。これにより、莢膜b型インフルエンザ菌を、他の莢膜型及び無莢膜型のインフルエンザ菌と区別して迅速、簡便かつ精確に検出することができる。

従来技術、競合技術の概要


インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae、以下「Haemophilus」については「H.」と略記することもある。)は中耳炎、肺炎、髄膜炎、菌血症の原因菌の一つで、近年様々な耐性菌が出現して問題となっている。



従来、インフルエンザ菌を検出するために、培養による選別と生化学的検査が併用されていたが、培養による選別と生化学的検査の併用した場合には、感染が判明するまでに3日以上を要するのに加え、コロニーをその形状や色の相違などから精確に選別するためには熟練した技術が必要であり、臨床診断及びその後の処置に支障をきたすおそれがあった。
一方、近年においては、特許文献1にも示されるように、PCR(polymerase chain reaction)法を用いた検出方法も採用されている。



PCR法を用いて検出する場合には、インフルエンザ菌に特徴的な遺伝子を標的として増幅反応を行うのが一般的であり、このようなインフルエンザ菌に特徴的な遺伝子として、例えば表層蛋白質であるP6蛋白質をコードするP6蛋白遺伝子が知られている。しかしながら、P6蛋白遺伝子を標的とした場合にも、インフルエンザ菌と同一環境内で共生しかつ遺伝的にも近似したパラインフルエンザ菌(Haemophilus parainfluenzae、以下「H.parainfluenzae」と略記することもある。)との区別は困難であった。また、この場合、ハイブリダイゼーション法を併用することにより特異性を高めることも可能であるが(参照文献1:T.Ueyama,他4名,“High Incidence of Haemophilus influenzae in Nasopharyngeal Secretions and Middle Ear Effusions as Detected by PCR,Journal of Clinical Microbiology”,1995,July,p.1835-1838)、検出するまでに多くの時間や費用を要する。



また、インフルエンザ菌は、莢膜の相違によって莢膜a~f型及び莢膜のない無莢膜型が存在し、これらの中でも莢膜b型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae Type b、以下、「Hib」と記すこともある。)が、特に小児において髄膜炎、喉頭蓋炎、菌血症、肺炎等の深刻な病気をもたらす病原の1つとなっている。このため、日本以外の先進国を中心に、小児に対してHibワクチンの接種が行われているものの、ワクチン接種後にHib感染症を発症する例が報告されており、感染の早期発見という本来の目的に加えて、ワクチン接種後の効果の確認という要請から簡便で感度に優れたHib検出方法が求められている。また、Hibワクチンの接種が行われていない開発途上国におけるHib感染拡大の可能性も報告されており、このような国でも簡便、迅速に行えるHibの検出方法が求められている。



しかし、従来から行われている血清学的型別法は、Hibによっては特徴的な形質の発現が抑制されていることがあり、感染を陰性と誤診断したり、非感染を陽性と誤診断したりしてしまうおそれがあり、あいまいな結果しか提供しなかった。また、非特許文献1に示されるようにPCR法に基づき検出する方法もあるが、この方法はコストや手間、時間を要し、さらにサーマルサイクラーのような特別な設備が必要なため、設備の不十分な病院の検査室や、上記のような開発途上国で手軽に実施するがことできなかった。



本発明は上述の問題点に鑑みてなされたものであり、精確、迅速にインフルエンザ菌及び莢膜b型インフルエンザ菌を検出可能なインフルエンザ菌の検出方法、インフルエンザ菌検出用プライマーセット及びインフルエンザ菌検出用キットを提供する。

【特許文献1】特開2000-342268号公報

【非特許文献1】Falla,T.J.,D.W.Crook,L.N.Brophy,D.Maskell,J.S.Kroll,and E.R.Moxon,1994,PCR for capsular typing of Haemophilus influenzae,J.Clin. Microbiol.,32:2382-2386

産業上の利用分野


本発明はインフルエンザ菌の検出方法に関し、特にインフルエンザ菌の検出方法、インフルエンザ菌検出用プライマーセット及びインフルエンザ菌検出用キットに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】 プライマーセットを用いた核酸増幅反応による核酸増幅の有無に基づいて莢膜b型インフルエンザ菌を検出する方法であって、
前記プライマーセットとして、配列表の配列番号43~47に記載の塩基配列からなる5種のプライマーを備えたLAMPプライマーセットを用いることを特徴とする、莢膜b型インフルエンザ菌の検出方法。
【請求項2】 配列表の配列番号43~47に記載の塩基配列からなる5種のプライマーを備えたLAMPプライマーセットであることを特徴とする、莢膜b型インフルエンザ菌検出用プライマーセット。
【請求項3】 配列表の配列番号43~47に記載の塩基配列からなる5種のプライマーを備えたLAMPプライマーセットを含むことを特徴とする、莢膜b型インフルエンザ菌検出用キット。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 権利存続中
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