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目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入する方法 コモンズ 新技術説明会

国内特許コード P09A014955
整理番号 OP00375
掲載日 2010年1月15日
出願番号 特願2008-181303
公開番号 特開2009-106268
登録番号 特許第5279378号
出願日 平成20年7月11日(2008.7.11)
公開日 平成21年5月21日(2009.5.21)
登録日 平成25年5月31日(2013.5.31)
優先権データ
  • 特願2007-265900 (2007.10.11) JP
発明者
  • 瀧 真清
  • 宍戸 昌彦
出願人
  • 国立大学法人 岡山大学
発明の名称 目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入する方法 コモンズ 新技術説明会
発明の概要

【課題】本発明の課題は、簡便かつ低コストに、アミノ酸を目的タンパク質または目的ペプチドに導入する方法を提供することであり、目的タンパク質または目的ペプチドへのアミノ酸導入のスケールアップを可能にする方法を提供することである。
【解決手段】1)目的タンパク質または目的ペプチド、2)導入するアミノ酸、3)tRNA、4)アミノアシルtRNA合成酵素、5)アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素を、同じ混合液中に、単一の容器内に存在させることによる。
【選択図】図1

従来技術、競合技術の概要


タンパク質の機能解析などの目的のため、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列を任意に組換えて構造を改変することが、遺伝子工学的な手法により、比較的古くから行われている。また、天然のアミノ酸のみならず、非天然のアミノ酸をタンパク質へ導入することも行われている。非天然アミノ酸導入により、タンパク質の構造・機能の解析のみならず、何らかの機能を人工的に付加した人工的なタンパク質の作製も可能になる。



機能性基をタンパク質表面に導入する場合、一般に用いられるのがタンパク質の特定残基への化学修飾である。また、近年タンパク質中のアミノ酸残基の置換が可能となったため、タンパク質合成系を拡張することで、アミノ骨格を有する所望の非天然型アミノ酸をタンパク質中に導入することが可能となった。



タンパク質合成系を用いずに、酵素的に非天然アミノ酸をtRNAに結合させる方法が開示されている(非特許文献1および2)。目的タンパク質と非天然アミノ酸によりアミノアシル化されたtRNAとを、ロイシル/フェニルアラニルタンパク質転移酵素の存在下で混合すると、目的タンパク質のN末端だけに非天然アミノ酸が転移することが見出された。



また、tRNAの3'末端に様々な非天然アミノ酸を結合させる酵素として、アミノアシルtRNA合成酵素変異体が作製されている(非特許文献3)。かかる酵素を用いて、翻訳系により非天然アミノ酸をタンパク質もしくはペプチドに導入する方法が開示されている(特許文献1)。

【特許文献1】国際公開WO03/073238号

【非特許文献1】Chembiochem, 2006, 7, 1676-1679

【非特許文献2】Biopolymers, 2007, 88, 263

【非特許文献3】Chembiochem, 2002, 02-03, 235-237

産業上の利用分野


本発明は、目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入する方法に関する。さらには、目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入するためのキットおよび、前記アミノ酸を導入する方法もしくは導入キットを用いて非天然タンパク質または非天然ペプチドを製造する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
少なくとも以下を含む混合溶液を用いて、目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入する方法:
1)目的タンパク質または目的ペプチド、
2)導入するアミノ酸であり、フッ素を含有するアミノ酸、
3)tRNA、
4)アミノアシルtRNA合成酵素、
5)アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素。

【請求項2】
混合溶液中における目的タンパク質または目的ペプチドとtRNAのモル比が、30:1~1:1である請求項1に記載の方法。

【請求項3】
混合溶液中における目的タンパク質または目的ペプチドとアミノアシルtRNA合成酵素のモル比が、100:1~2:1である請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素が、ロイシル/フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
目的タンパク質または目的ペプチドのN末端が塩基性アミノ酸であり、導入するアミノ酸が目的タンパク質または目的ペプチドのN末端に導入される、請求項4に記載の方法。

【請求項6】
アミノアシルtRNA合成酵素が、大腸菌由来フェニルアラニルtRNA合成酵素の294番目のアラニンがグリシンに置換した変異体である請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。

【請求項7】
フッ素を含有するアミノ酸が、以下から選択される少なくとも1以上のアミノ酸である請求項1~6のいずれか1項に記載の方法:
2-アミノ-3-(4-フルオロメトキシ-フェニル)-プロピオン酸;
2-アミノ-3-[4-(2-フルオロ-エトキシ)-フェニル]-プロピオン酸。

【請求項8】
少なくとも以下を含む請求項1~7のいずれか1項に記載の方法に用いる、目的タンパク質または目的ペプチドへのアミノ酸導入用キット:
1)tRNA、
2)アミノアシルtRNA合成酵素、
3)アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素。

【請求項9】
請求項1~7のいずれか1項に記載の方法または請求項8に記載のキットを用いる、非天然タンパク質または非天然ペプチドを製造する方法。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2008181303thum.jpg
出願権利状態 権利存続中
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