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シバ属植物の再分化植物体及び形質転換植物体

国内特許コード P09A015146
掲載日 2010年3月5日
出願番号 特願2002-371053
公開番号 特開2004-201509
登録番号 特許第4228044号
出願日 平成14年12月20日(2002.12.20)
公開日 平成16年7月22日(2004.7.22)
登録日 平成20年12月12日(2008.12.12)
発明者
  • 小林 正樹
  • 福澤 洋光
  • 蝦名 真澄
  • 高溝 正
  • 中川 仁
  • 小林 真
出願人
  • 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 シバ属植物の再分化植物体及び形質転換植物体
発明の概要

【課題】シバ属植物の安定した再分化方法と、該方法により再分化したシバ属植物を提供する。
【解決手段】シバ属植物の走出枝の節の生長点から誘導したカルスを無菌的に培養して植物体を再生させることを特徴とする、シバ属植物の再分化法。
【選択図】 なし

従来技術、競合技術の概要
従来、シバ属植物において組織培養を行う場合には以下のような方法が採られている。すなわち、完熟種子を次亜塩素酸ナトリウム水溶液および70%エタノール水溶液で滅菌した後、ホルモンを含まないムラシゲ・スクーグ(Murashige & Skoog)培地(MS培地)を基本とする培地やガンボルグB5培地等の寒天培地または湿らせた滅菌濾紙上に置床して発芽させ、次に胚軸、子葉または根をオーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモンを含むMS培地やガンボルグB5培地等に移植し、培養することで再分化可能なカルスを得る、というものである(例えば非特許文献1及び2参照)。
【0003】
適切な条件を選べば、種子以外にも根や走出枝(ランナー)などからもカルスを誘導することができるが、それらのカルスは必ずしも再分化能を持っているとは限らない。例えば、器官による特異性やカルスを維持する培養条件及び培養期間によっても、再生能力に違いが見られる事が知られている(非特許文献3参照)。
【0004】
また、シバ属植物の中でも特にノシバ(Zoysia japonica)やコウライシバ(Zoysia tenuifolia)の種子は、堅い外えいに覆われていること、種子中のアブシジン酸濃度が高いこと等の理由で発芽率が低い事が知られている上、遺伝的背景が個体ごとに異なり、再分化効率の高い遺伝子型の種子あるいは植物を見出すことが困難であることが知られている(非特許文献4参照)。従って、効率的に再分化可能なカルスを得るためには、種子以外の組織、器官から再分化可能なカルスを誘導する方法を開発する必要があった。
【0005】
しかしながら、上記記載のように種子以外の組織、器官から誘導したカルスは必ずしも再分化能を持っていない。このため、シバ属植物の研究を進めるには、ごく稀な遺伝子型である高い再分化能を示すカルスのスクリーニングを、多大な労力と手間を掛けて実施する必要があり、特殊な事例としてのみ研究が行われてきた。
【0006】
さらに、シバ属植物において任意の遺伝子を導入するためには、細胞壁を酵素消化したプロトプラストに対し電気的に穴を開けて遺伝子を取り込ませる電気穿孔法や、カルスに遺伝子をまぶした金属球を打ち込むパーティクルボンバートメント法を用いる必要があった。しかしこれらの技術は高価な機器が必要であること、プロトプラストから植物体を再生させるまでには煩雑な操作が必要なうえ長い培養期間が必要であるためにアルビノなどのいわゆる培養変異を起こす確率が高いこと、電気穿孔法やパーティクルボンバートメント法では一細胞あたり複数の遺伝子が導入されてしまうこと、等の欠点が指摘されていた(非特許文献5参照)。
【0007】
一方、アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入法は、実験操作が簡便である、培養変異が少ない、遺伝子が1コピーのみ導入されることが多い、等の優れた特徴を持つが、アグロバクテリウムは本来イネ科の植物に対する感染能力が低いため、従来はシバ属植物に対して適用できなかった(非特許文献6参照)。
【0008】
近年、ノシバにおいてアグロバクテリウム法を用いて外来遺伝子を導入した事例が報告された(非特許文献7参照)。しかしながら上記方法は種子からカルス誘導を行っているために、新たに再分化率の高い遺伝子型をスクリーニングするのに多大な労力と時間を必要とする上、同じ遺伝子型の植物体は得られないので再現性がない、不稔の個体には適用できない、操作法そのものはイネなどで用いられているものとほぼ同じであるためシバ属植物に適用すると形質転換効率が低い、等の問題が依然として解消されないままであった。
【0009】
【非特許文献1】
ムラシゲら(Murashige et al.)、 Physiol. Plant. 第15巻 473~497頁、1962年
【非特許文献2】
クランスら(Krans et al.)、 Crop Sci. 第22巻 1193~1197頁、1982年
【非特許文献3】
ゾングら(Zhong et al.)、 Plant cell rept. 第10巻、453~456頁、1991年
【非特許文献4】
アサノ(Asano)、 Plant Science 第72巻、267~273頁、1990年
【非特許文献5】
ザオら(Xiao et al.)、 Plant cell rept. 第16巻、874~878頁、1997年
【非特許文献6】
ヒエイら(Hiei et al.)、 Plant J. 第6巻、271~282頁、1994年
【非特許文献7】
遠山ら、育種学研究 第3巻 別冊2号 第86項、2001年
産業上の利用分野
本発明は、基本的に他殖性で遺伝的背景が個体ごとに異なり、かつ高い再分化率の遺伝子型の種子あるいは植物を見出すことが困難なシバ属植物において、効率的に再分化可能なカルスを誘導し、さらにこのカルスにアグロバクテリウムを感染させて任意の遺伝子を導入した植物体を効率よく得る方法に関する。
特許請求の範囲 【請求項1】 シバ属植物の走出枝の節の生長点から誘導したカルスを無菌的に培養して植物体を再生させることを特徴とする、シバ属植物の再分化法。
【請求項2】 遺伝子を導入したアグロバクテリウムを、シバ属植物の走出枝の節の生長点から誘導したカルスと共培養することを特徴とする、シバ属植物の形質転換法。
産業区分
  • 農林
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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24979_01SUM.gif
出願権利状態 権利存続中


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