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優れたストレス耐性を有する酵母の分子育種法及び遺伝子改変酵母

国内特許コード P09A015282
掲載日 2010年3月5日
出願番号 特願2008-220525
公開番号 特開2009-072187
登録番号 特許第5682866号
出願日 平成20年8月28日(2008.8.28)
公開日 平成21年4月9日(2009.4.9)
登録日 平成27年1月23日(2015.1.23)
優先権データ
  • 特願2007-226287 (2007.8.31) JP
発明者
  • 安藤 聡
  • 島 純
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 優れたストレス耐性を有する酵母の分子育種法及び遺伝子改変酵母
発明の概要 【課題】優れたストレス耐性を有する遺伝子改変酵母を製造するための核酸カセット、方法、およびその酵母を提供すること。
【解決手段】高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセットであって、高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方により誘導されるプロモーター;および該プロモーターの下流に作動可能に連結された、酵母のARO1遺伝子、BUD23遺伝子、PMR1遺伝子、SNF5遺伝子、GON7遺伝子、SPT20遺伝子、CBS2遺伝子、もしくはDBF2遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはその5’末端フラグメント、あるいはそれらの組合せ;を含む、核酸カセット。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要


酵母の発酵産業への利用において、酵母の発酵および生育阻害要因となるストレスの存在が問題となっている。例えば、パンの製造においては、我が国において需要の多い菓子パン等に用いられる高糖生地では、約30%(対小麦粉比)にも及ぶショ糖が添加されることから、極めて高い浸透圧ストレス(高ショ糖ストレス)が負荷される。また、近年、急速に普及した冷凍生地製パン法においては冷凍ストレスが負荷される。以上のことから、酵母の産業利用においては様々なストレス(例えば、ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレス)に対する耐性の向上が求められている。従来より、ストレス耐性の向上を目的とした交配や突然変異導入等による育種が行われてきたが、得られた耐性は十分とは言い難い。近年のバイオマスエタノールへの注目を受け、より優れたストレス耐性を持つ酵母の開発が急務となっている。



1990年代以降、ストレス耐性機構に関する知見の蓄積に伴い、耐性関連遺伝子を改変することによって耐性を増強しようという試みがなされている。特許文献1は、ストレスに起因する細胞の障害を緩和する役割を担うことが知られている、いわゆる適合溶質の代謝を操作することによる冷凍耐性酵母の作出を開示する。具体的には、特許文献1は、NTH1遺伝子(中性トレハラーゼ遺伝子)を遺伝子破壊した1倍体酵母または2倍体以上の倍数体酵母を開示する。非特許文献1は、芳香族アミノ酸合成関連の遺伝子(ARO1など)を破壊することによって高ショ糖ストレス耐性が著しく損なわれることを開示する。非特許文献1はまた、BUD23、GON7、SPT20の遺伝子破壊株が高ショ糖ストレスに高い感受性を示すことを開示する。非特許文献2は、PMR1遺伝子またはSNF5遺伝子を破壊することによって冷凍ストレス耐性が損なわれることを開示する。非特許文献3は、CBS2欠損により、乾燥ストレス感受性になることを開示する。非特許文献4は、DBF2の破壊により、ソルビン酸ストレスに対して高感受性になることを開示する。
【特許文献1】
特開平10-117771号公報
【非特許文献1】
Andoら,「Identification and classification of genes required for tolerance to high-sucrose stress revealed by genome-wide screening of Saccharomyces cerevisiae.」,FEMS Yeast Res(2006)6:249-267
【非特許文献2】
Andoら「Identification and classification of genes required for tolerance to freeze-thaw stress revealed by genome-wide screening of Saccharomyces cerevisiae deletion strains.」FEMS Yeast Res.(2007)7:244-253
【非特許文献3】
Shimaら「Possible roles of vacuolar H+-ATPase and mitochondrial function in tolerance to air-drying stress revealed by genome-wide screening of Saccharomyces cerevisiae deletion strains」Yeast(2008)25:179-190
【非特許文献4】
Makrantoniら「A novel role for the yeast protein kinase Dbf2p in vacuolar H+-ATPase function and sorbic acid stress tolerance」Microbiology(2007)153:4016-4026

産業上の利用分野


本発明は、優れたストレス耐性を有する遺伝子改変酵母を製造するための核酸カセット、その方法、およびその核酸カセットを使用して得られる遺伝子改変酵母に関する。より具体的には、本発明は、ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセット、その方法、および得られる酵母に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方に対して耐性の酵母を製造するための核酸カセットであって、
高ショ糖ストレスもしくは冷凍ストレスまたはその双方により誘導されるプロモーター;および
該プロモーターの下流に作動可能に連結された、酵母のARO1遺伝子、BUD23遺伝子、PMR1遺伝子、SNF5遺伝子、GON7遺伝子、SPT20遺伝子、CBS2遺伝子、もしくはDBF2遺伝子をコードするポリヌクレオチド
を含む、核酸カセットであって、
該ARO1遺伝子が、配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなり、
該BUD23遺伝子が、配列番号2に示されるヌクレオチド配列からなり、
該PMR1遺伝子が、配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなり、
該SNF5遺伝子が、配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなり、
該GON7遺伝子が、配列番号34に示されるヌクレオチド配列からなり、
該SPT20遺伝子が、配列番号35に示されるヌクレオチド配列からなり、
該CBS2遺伝子が、配列番号36に示されるヌクレオチド配列からなり、
該DBF2遺伝子が、配列番号37に示されるヌクレオチド配列からなり、
該プロモーターが、HSP104プロモーターであり、
該酵母が、サッカロミセス・セレビシェであり、
該ARO1遺伝子、該BUD23遺伝子、該GON7遺伝子、該SPT20遺伝子、該CBS2遺伝子および該DBF2遺伝子は、高ショ糖ストレスに対する耐性を付与するものであり、
該PMR1遺伝子および該SNF5遺伝子は、冷凍ストレスに対する耐性を付与するものである、
核酸カセット

【請求項2】
前記プロモーターの上流に、前記ARO1遺伝子、BUD23遺伝子、PMR1遺伝子、SNF5遺伝子、GON7遺伝子、SPT20遺伝子、CBS2遺伝子、もしくはDBF2遺伝子の上流領域のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載の核酸カセット。

【請求項3】
選択マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載の核酸カセット。

【請求項4】
前記選択マーカーが、栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、発光タンパク質マーカー、酵素タンパク質マーカー、および薬剤耐性マーカーからなる群より選択される、請求項に記載の核酸カセット。

【請求項5】
前記栄養要求性マーカーが、URA3マーカーである、請求項に記載の核酸カセット。

【請求項6】
高ショ糖ストレスまたは冷凍ストレスに対して耐性の酵母を製造する方法であって、
サッカロミセス・セレビシェ中に請求項1に記載の核酸カセットを導入する工程;
を包含する、方法。

【請求項7】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Y244株(受託番号NITE P-274)である、請求項に記載の方法。

【請求項8】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Y245株(受領番号NITE AP-401;受託番号NITE P-401)である、請求項に記載の方法。

【請求項9】
請求項1に記載の核酸カセットを含む、サッカロミセス・セレビシェ

【請求項10】
受領番号NITE AP-404(受託番号NITE P-404)、受領番号NITE
AP-405(受託番号NITE P-405)、受領番号NITE AP-403(受託番号NITE P-403)、受領番号NITE AP-402(受託番号NITE
P-402)、受領番号NITE AP-633、受領番号NITE AP-634、受領番号NITE AP-635、受領番号NITE AP-636からなる群より選択される株である、請求項に記載のサッカロミセス・セレビシェ

【請求項11】
請求項に記載のサッカロミセス・セレビシェを含む、食品またはその材料。

【請求項12】
パン、パン生地、アルコール、菓子類、漬物、および発酵調味料からなる群より選択される、請求項11に記載の食品またはその材料。

【請求項13】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Y249株(受領番号NITE AP-631)である、請求項に記載の方法。

【請求項14】
前記サッカロミセス・セレビシェが、Y251株(受領番号NITE AP-632)である、請求項に記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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25106_01SUM.gif
出願権利状態 登録


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