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特異的遺伝子の多重検出によるSalmonellaTyphimuriumの迅速同定法

国内特許コード P09A015328
掲載日 2010年3月12日
出願番号 特願2009-140192
公開番号 特開2010-035552
登録番号 特許第5224539号
出願日 平成21年6月11日(2009.6.11)
公開日 平成22年2月18日(2010.2.18)
登録日 平成25年3月22日(2013.3.22)
優先権データ
  • 特願2008-177942 (2008.7.8) JP
発明者
  • 秋庭 正人
出願人
  • 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 特異的遺伝子の多重検出によるSalmonellaTyphimuriumの迅速同定法
発明の概要

【課題】サルモネラの血清型に特異的な遺伝子を多重検出することにより、サルモネラ血清型を迅速に同定する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】まず、サルモネラ主要血清型(Salmonella Typhimurium、Choleraesuis、Enteritidis、Dublin、Gallinarum)に特異的な遺伝子をin silico(コンピューター上)で網羅的に抽出した。そして次に、3700株を超えるサルモネラ野外分離株を利用して、抽出された遺伝子の血清型特異性を検討した。その結果、サルモネラ主要血清型に特異的な遺伝子が存在し、それを指標に、サルモネラ血清型の判別が可能であることがわかった。
【選択図】なし

従来技術、競合技術の概要


サルモネラ感染は家畜生産の阻害要因であるのみならず、畜産物を介してヒトに食中毒を起こすことから、公衆衛生上の脅威ともなっている。サルモネラは飼料を介して伝播するため、飼料安全法で有害微生物として規定されている。このため、農林水産消費安全技術センター・肥飼料安全検査部では飼料のサルモネラ汚染のモニタリング調査を継続的に実施している。
分離されたサルモネラが、家畜伝染病予防法で「家畜伝染病」または「届出伝染病」と規定している主要6血清型(Gallinarum、Typhimurium、Dublin、Enteritidis、Choleraesuis、Abortusequi)であるか否かでその後の対応が異なるため、血清型の特定が必須である。また、2004年にと畜場法が改正され、食肉衛生検査所では、肉眼病変の認められた材料について上記の6血清型のサルモネラ検査を行う必要がある。現行のサルモネラ血清型別法では判定までに2週間を必要とする。このため、飼料から上記6血清型のサルモネラが検出されても、その判定結果が出るまでに当該飼料が消費されてしまう可能性が高い。また、食肉衛生検査所では判定まで枝肉を保留する必要があるため、食品衛生上大きな問題となっている。以上のことから、飼料検査および食肉検査現場で、サルモネラの6血清型迅速同定法の開発が強く求められている。6血清型の迅速同定法が実用化されれば、家畜保健衛生所における日常検査、血清型別不能菌の同定、スクリーニング検査等へも応用可能である。畜産物の安全・安心を確保する上で、飼料および畜産物を汚染するサルモネラのリスク管理、および生産現場でのサルモネラ保菌動物の早期摘発・淘汰は、極めて重要である。

産業上の利用分野


本発明は、血清型特異的遺伝子の多重検出によるサルモネラ血清型の迅速同定法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)~(4)に記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)~(4)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると示される工程。
(1)配列番号:1に記載の塩基配列において7223番目~7963番目の塩基からなる配列からなるDNA又は配列番号:99に記載の塩基配列からなるDNA
(2)配列番号:2に記載の塩基配列において5844番目~6587番目の塩基からなる配列からなるDNA
(3)配列番号:3に記載の塩基配列において1023番目~2213番目の塩基からなる配列からなるDNA
(4)配列番号:4に記載の塩基配列において9216番目~10040番目の塩基からなる配列からなるDNA

【請求項2】
配列番号:1に記載の塩基配列において7223番目~7963番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:2に記載の塩基配列において5844番目~6587番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:3に記載の塩基配列において1023番目~2213番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:4に記載の塩基配列において9216番目~10040番目の塩基からなる配列からなるDNAの増幅を、配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:99に記載の塩基配列からなるDNAが、配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅される、
請求項1に記載の方法。

【請求項3】
下記(d)及び(e)の工程をさらに含む、請求項2に記載の方法;
(d)サルモネラのO群血清型を判定する工程、及び
(e)工程(d)においてO群血清型がO4群と判定された場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると示される工程。

【請求項4】
下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。

【請求項5】
請求項に記載のセットを含有するサルモネラの血清型判別用キット。

【請求項6】
Salmonella TyphimuriumのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、下記(i)のセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物;
(i)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。

【請求項7】
配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。

【請求項8】
請求項に記載のセットを含有するサルモネラの血清型判別用キット。

【請求項9】
Salmonella TyphimuriumのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、下記(1)のセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物;
(1)配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。

【請求項10】
下記(i)から(v)を含むセット;
(i)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(ii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:33に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:34に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:35に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:36に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:37に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:38に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:39に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:40に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:41に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:42に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも4つを含むセット
(1)配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iv)下記(1)から(6)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:53に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:54に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:55に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:56に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:57に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:58に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:59に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:60に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:61に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:62に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:63に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:64に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(v)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。

【請求項11】
以下(1)から(13)を含むセット;
(1)配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:75に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:76に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:77に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:78に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:79に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:80に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:81に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:82に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:83に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:84に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(7)配列番号:85に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:86に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(8)配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(9)配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(10)配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(11)配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(12)配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(13)配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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25202_01SUM.gif
出願権利状態 権利存続中


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