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外来遺伝子を導入しない、非遺伝子組換えの遺伝子欠損株とその作製および選抜方法

国内特許コード P10A015372
掲載日 2010年4月9日
出願番号 特願2008-226016
公開番号 特開2010-057406
登録番号 特許第5783503号
出願日 平成20年9月3日(2008.9.3)
公開日 平成22年3月18日(2010.3.18)
登録日 平成27年7月31日(2015.7.31)
発明者
  • 井上 康宏
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 外来遺伝子を導入しない、非遺伝子組換えの遺伝子欠損株とその作製および選抜方法
発明の概要 【課題】外来遺伝子を利用しない遺伝子欠損細菌株の作出方法の提供。
【解決手段】欠損させたい遺伝子の上流領域および下流領域のDNAからなる環状化DNAを用いた相同組換えにより、外来遺伝子を用いることなく作製される遺伝子欠損細菌株およびその作製方法とその選抜方法。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要


近年、様々な植物病原性細菌の病原性関連遺伝子が同定されている。その病原性関連遺伝子を分子生物学的手法により破壊した遺伝子破壊株が多数作製されている。これまでに病原性を喪失した細菌を施用することによって当該病害を防除できることが報告されており(非特許文献1)、病原性関連遺伝子を破壊して作製した病原性喪失株でもこのような能力を付加できることが期待される。



従来的に病原性関連遺伝子の破壊株は、外来遺伝子(例えば、抗生物質耐性遺伝子や、栄養素の利用性に関する遺伝子など)をマーカー遺伝子として、遺伝子組換え技術により病原性関連遺伝子に挿入または置換することによって作製される(非特許文献2,3,4)。また、従来の遺伝子破壊株はマーカーとして挿入された遺伝子の選択性を利用して選抜される。



【非特許文献1】
日本植物病理学会報56:243-246(1990)
【非特許文献2】
山田雅巳(2003)バクテリアにおける遺伝子破壊株の作成方法.Environ. Mutagen Res. 25:87-92
【非特許文献3】
S. Kamoun, E. Tola, H. Kamdar C. I. Kado (1992) Rapid generation of directed and unmarked deletions in Xanthomonas. Mol. Microbiol. 6: 809-816
【非特許文献4】
K. A. Datsenko, B. L. Wanner (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS 97:6640-6645

産業上の利用分野


本発明は、欠損させたい遺伝子の上流領域および下流領域のDNAからなる環状化DNAを用いた相同組換えにより、外来遺伝子を用いることなく作製される遺伝子欠損株とその作製および選抜方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
外来遺伝子を使用しない遺伝子欠損細菌株の作製方法であって、以下の工程:
(a)欠損させたい遺伝子の上流領域および下流領域のDNAをPCRによって増幅するステップ;
(b)得られた上流領域および下流領域のDNA断片を連結させ、上流領域および下流領域の連結DNA断片を得て、それを環状化するステップ;
(c)得られた環状化DNAをXanthomonas属に属する植物病原細菌に導入し、該細菌のDNAと相同組換えを行うステップ;および
(d)宿主細菌のDNA上における相同組換え部位の外側に設計されたプライマーを少なくとも1つ用いて1st PCRを行うことを含む、Nested-PCRによって遺伝子欠損細菌株のスクリーニングを行うステップ、
を含む、上記方法。

【請求項2】
病原性関連遺伝子の欠損細菌株を作製するための、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
上流領域および下流領域のDNA断片を結合PCRによって連結する、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
上流領域および下流領域の連結DNA断片をセルフライゲーションにより環状化する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
1st PCRにて用いられるプライマーが全て相同組換え部位の外側に設計されたプライマーである、請求項1~のいずれか1項に記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録


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