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血管内皮増殖因子結合性アプタマー 新技術説明会

国内特許コード P10A015496
掲載日 2010年6月11日
出願番号 特願2007-078642
公開番号 特開2008-237042
登録番号 特許第5223086号
出願日 平成19年3月26日(2007.3.26)
公開日 平成20年10月9日(2008.10.9)
登録日 平成25年3月22日(2013.3.22)
発明者
  • 池袋 一典
  • 早出 広司
出願人
  • 国立大学法人東京農工大学
発明の名称 血管内皮増殖因子結合性アプタマー 新技術説明会
発明の概要

【課題】血管内皮増殖因子との結合能が高い新規なアプタマーを提供すること。
【解決手段】アプタマーの創製方法におけるスクリーニング工程として、標的物質と非標的物質の両者を固定した担体を用いる公知の方法と、溶液中で結合させた標的物質とポリヌクレオチドとの複合体をゲル電気泳動により分離し、採取する、ゲルシフト法とを組み合わせた新規なアプタマー創製方法を駆使することにより、血管内皮増殖因子との結合能が高いアプタマーを得ることに成功し、その塩基配列を決定し、さらに、その欠失変異体を複数合成し、それらの血管内皮増殖因子との結合能を調べて、血管内皮増殖因子との相互作用部位を突き止めた。
【選択図】図1

従来技術、競合技術の概要


VEGFは、血管の内皮細胞に存在する受容体に結合し、内皮細胞の増殖を促すことで、血管新生を促進する。このためVEGFは、血管新生が重要な役割を果たす各種疾患との関連が注目されており、例えば、固形腫瘍患者の血清中での濃度上昇が報告されている。このため、VEGFに結合する物質が得られれば、血管新生を伴うさまざまな疾患の診断を行ううえで有用なセンサー素子となることが期待される。



試料中のタンパク質等の被検物質の測定は、現在、主として免疫測定法により行なわれている。免疫測定法としては様々な方法が知られており、実用化されているが、いずれの方法においても、被検物質に対する特異抗体が用いられる。被検物質に対する特異抗体の作出は常法により行なうことができるが、手間がかかり、このため特異抗体は高価である。



一方、任意の分子と特異的に結合するポリヌクレオチド分子であるアプタマーが知られている。アプタマーは、市販の核酸合成機を用いて化学的に全合成できるので、特異抗体に比べてはるかに安価であり、修飾が容易であるため、センシング素子としての応用が期待されている。所望の標的分子と特異的に結合するアプタマーは、SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)と呼ばれる方法により作出可能である(非特許文献1)。この方法では、標的分子を担体に固定化し、これに膨大な種類のランダムな塩基配列を有する核酸から成る核酸ライブラリを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これをPCRにより増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を10回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得する。なお、上記核酸ライブラリーは、核酸の自動化学合成装置により、ランダムにヌクレオチドを結合していくことにより容易に調製可能である。このように、ランダムな塩基配列を有する核酸ライブラリーを用いた、偶然を積極的に利用する方法により、任意の標的物質と特異的に結合するアプタマーを作出できる。



また、本願発明者らは、通常のSELEXにおいて、被検物質との結合能がより高いアプタマーを効率的に得ることができるSELEXの改良法を発明した(特許文献1)。特許文献1に記載されるSELEX改良法では、通常のSELEXにおいて、所望の標的物質と核酸ライブラリー中の核酸とを結合させる際に、非標的物質を固定化した担体を共存させ、所望の標的物質と結合した核酸のみを回収し、PCRにより増幅し、増幅物から一本鎖核酸を取得し、これを核酸ライブラリーとして、標的物質を固定化した領域に接触させ、固相に結合した核酸を回収し、同様にPCRで増幅し、一本鎖を取得し、これを核酸ライブラリーとして再度、標的物質と非標的物質をそれぞれ固定化した領域と接触させ、以下同様にサイクルを繰り返す方法である。この方法によれば、非標的物質や担体に結合するアプタマーは淘汰され、標的物質に特異的に結合するアプタマーが濃縮されていく。



上記の通り、アプタマー自体及びその創製方法は公知であるが、VEGFに結合するアプタマーは知られていない。また、上記の通り、アプタマーの創製方法は、偶然を積極的に利用する方法であるので、標的物質に対して高い結合能を有するアプタマーが得られるかどうかはやってみなければわからない。




【特許文献1】特開2007-14292号公報

【非特許文献1】Tuerk, C. and Gold L. (1990), Science, 249, 505-510

産業上の利用分野


本発明は、血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor、以下、「VEGF」と呼ぶことがある)に結合する新規なアプタマーに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
配列番号1又は配列番号2記載の塩基配列から成る一本鎖ポリヌクレオチド。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 権利存続中
※ 国立大学法人東京農工大学では、先端産学連携研究推進センターにおいて、知的財産の創出・権利化・活用に取り組んでいます。上記の特許・技術の内容および導入に興味・関心がありましたら、当センターまでお気軽にお問い合わせください。


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