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オリゴヌクレオチド誘導体及びその利用 コモンズ 実績あり

国内特許コード P10S000429
整理番号 GI-H17-60
掲載日 2010年8月13日
出願番号 特願2008-500415
登録番号 特許第5493117号
出願日 平成19年2月15日(2007.2.15)
登録日 平成26年3月14日(2014.3.14)
国際出願番号 JP2007000087
国際公開番号 WO2007094135
国際出願日 平成19年2月15日(2007.2.15)
国際公開日 平成19年8月23日(2007.8.23)
優先権データ
  • 特願2006-038369 (2006.2.15) JP
発明者
  • 北出 幸夫
  • 上野 義仁
出願人
  • 国立大学法人岐阜大学
発明の名称 オリゴヌクレオチド誘導体及びその利用 コモンズ 実績あり
発明の概要 本発明は、良好なヌクレアーゼ抵抗性を有するオリゴヌクレオチド誘導体を提供することを目的とする。本発明は、この目的のため、ヌクレオシドに替えてベンゼン骨格を有するユニットを備える。
【選択図】図1
従来技術、競合技術の概要



近年、DNAやRNAなど各種のオリゴヌクレオチドが治療、診断等の用途に用いられるようになってきている。診断用途では、代表的には、DNAチップやDNAマイクロアレイが挙げられ、治療用途では、治療関連遺伝子の導入ほか、疾患関連遺伝子のノックダウンによる発現抑制等が挙げられる。また、アプタマーを治療薬として用いる試みもなされている。





近年、注目される核酸技術としては、特定遺伝子のノックダウン法としてRNA干渉(RNAi)が挙げられる。RNAiとは、二本鎖RNA (dsRNA)により配列の相同な遺伝子の働きが抑制される現象である。RNAiによる遺伝子発現の抑制は、具体的には、dsRNAがRNaseIIIファミリーの一種であるDicerによって認識、切断されて21-23量体のsiRNAs(short interfering RNAs)となり、このsiRNAがRISC(RNA-induced silencing

complex)に取り込まれ、続いて取り込まれたsiRNAに相同的なmRNAが中央部で切断され、分解されることによる。





生体内において外来性のDNAやRNAは、各種ヌクレアーゼに曝されており、特に、RNAは、ヌクレアーゼにより分解されやすいため、図したノックダウン効果やその効果を安定的に維持させるのが困難なことがあった。このため、RNAを化学修飾してヌクレアーゼ抵抗性を向上させることが検討されている(L.Beigelman.,J.A.McSwiggen.,K.G.Draper et al.,J Biol chem.,270,25702-25708(1995)27)、S.P.Zinnen.,K.Domenico.,M.Wilson

et al.,RNA.,8,214-228 (2002)及びS.Agrawal and E.R.Kandimalla.,Curr.Cancer Drug Targets.,1,197-209

(2001))。例えば、siRNAについても、図16に示すように、様々な化学修飾が試みられている(H.Hoshi.,FEBS

Letters.,521,195-199 (2002))。また、本発明者らは、siRNAの3’末端ダングリングエンドのリン酸ジエステル結合部分をカルバメート結合やウレア結合に変換して結合部分の負電荷をなくすことにより、siRNAのヌクレアーゼ抵抗性とサイレンシング活性とを高めることに成功している(Y.Ueno,T.Naito,K.Kawada,A.Shibata,Hye-Sook Kim,Y.Wataya,Y.Kidade,Biochem Biophys Res Commun 330,1168-1175(2005))。





RNAiにおいて重要な役割を果たすRISCはRNAiの標的mRNAの分解の過程に関与するマルチドメインタンパクとして知られているが、近年、RISC中のPAZドメインとsiRNAの共結晶X線結晶構造解析が行われた(J.B.Ma.,K.Ye and D.J.Patel.,Nature.,429,318-322 (2004).)。その結果、PAZドメインはsiRNAの3’末端ダングリングエンドを認識しており、3’末端ダングリングエンドの2ヌクレオチドがPAZドメインの疎水性ポケットに入り込んで認識されていることが明らかとなった(J.J.Song.,J.Liu.,N.H.Tolia.,J.Schneiderman.,S.K.Smith.,R.A.Martienssen.,G.J.Hannon and L.Joshua-Tor.,Nat.Struct.Biol.,10,1026-1032 (2003)、K.S.Yan.,S.Yan.,A.Farooq.,A.Han.,L.Zeng and M.M.Zhou.,Nature.,426,468-474 (2003)、Zhang.,F.A.Kolb.,L.Jaskiewicz.,E.Westhof and W.Filipowicz.,Cell.,118,57-68 (2003)及びA.Lingel.,B.Simon.,E.Izaurralde

and M.Sattler.,Nature.,426,465-469 (2003))。





他の核酸技術としては、遺伝子解析ツールとしてモレキュラービーコンが挙げられる。モレキュラービーコンは、ステム部分とループ部分とを持つヘアピン構造の核酸であり、ループ部分と相補性のある配列の存在確認のためのプローブとして利用される遺伝子解析ツールである。通常は蛍光剤と消光剤の距離が近いため消光されている。しかしループ部分に相補な配列があると、ループ部分が相補配列とハイブリダイズするため、ヘアピン構造が開き、蛍光剤と消光剤が引き離されるため、蛍光が検出される。これにより標的配列を検出することができる。モレキュラービーコンにはステム部分とループ部分の、ターゲット配列に対する相互作用の強弱が重要になる。こうしたモレキュラービーコンにおいては、ヌクレアーゼ耐性のほか、ループ部分およびステム部分の相補配列への配列選択性、二本鎖安定性の検討など検討されている。

産業上の利用分野



本発明は、新規なオリゴヌクレオチド誘導体、該オリゴヌクレオチド誘導体を用いたオリゴヌクレオチド構築物、該オリゴヌクレオチド誘導体を合成するための化合物及び該オリゴヌクレオチド誘導体の製造方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
少なくとも1個の以下の式(1);
【化45】


[式中、Aは独立して以下の式(2);
【化46】


[式(2)中、Zは、CH又はNを表す。]
から選択される置換されていてもよい環式化合物含有基を表す。]
で表される単位を、ヌクレアーゼ抵抗性を発現可能に有する遺伝子調節剤であって、
以下の式(3)で表される、遺伝子発現調節剤。
【化47】


[式中、R及びRは、それぞれ独立して水素又はヒドロキシル保護基を表し、各Xは独立してO、S又はSeを表し、各Xは独立してOH若しくはO、SH若しくはS、Se若しくはSe、炭素数1~4個のアルキル基又はモルホリノ基を表し、l、m及びnは独立して0以上の整数であり、少なくとも一つが1以上であり、B及びCは独立して改変されていてもよいオリゴヌクレオチドであってBとCを合わせた鎖長が3以上のオリゴヌクレオチドを表す。ただし、B及びCにおいてオリゴヌクレオチドの3’末端と5’末端の水酸基を含まない。]

【請求項2】
前記Aの少なくとも一つが、式(2)中の化合物2a及び2bから選択される、請求項1に記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項3】
は、OH又はOである、請求項1又は2に記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項4】
及びRはHである、請求項1~3のいずれかに記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項5】
mは0である、請求項1~4のいずれかに記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項6】
l及びmはいずれも0である、請求項1~5のいずれかに記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項7】
l及びmは0であり、nは1以上5以下である、請求項1~6のいずれかに記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項8】
B及びCは、所定の遺伝子のmRNAの部分配列又はその相補配列を有する、請求項1~7のいずれかに記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項9】
B及びCを合わせた鎖長は、10以上35以下である、請求項1~8のいずれかに記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項10】
B及びCはオリゴリボヌクレオチドである、請求項1~9のいずれかに記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項11】
1本鎖及び2本鎖DNA、1本鎖及び2本鎖RNA、DNA/RNAキメラ並びにDNA/RNAハイブリッドから選択される構築物である、請求項10に記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項12】
アンチジーン、アンチセンス、アプタマー、siRNA、miRNA、shRNA及びリボザイムから選択される、請求項10又は11に記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項13】
ダングリングエンド部分に前記Aを含むユニットを有する、請求項10~12のいずれかに記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項14】
siRNAであって、3’末端ダングリングエンド部分に前記Aを含むユニットを有する、請求項12に記載の遺伝子発現調節剤。

【請求項15】
請求項1~14のいずれかに記載の遺伝子発現調節剤の製造方法であって、
以下の式で表される化合物から選択される1種又は2種以上をヌクレアーゼ抵抗性を発現可能に遺伝子発現調節剤のヌクレアーゼターゲット部位に導入する、製造方法。
【化48】


[式中、各Aは独立して以下の式(2);
【化49】


[式(2)中、Zは、CH又はNを表す。]
から選択される置換されていてもよい環式化合物含有基を表し、Wは、ヒドロキシル保護基を表し、Wは、H、ホスホロアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。]

【請求項16】
前記Aの少なくとも一つが式(2)中の化合物2a及び2bから選択される、請求項15に記載の製造方法。

【請求項17】
遺伝子発現調節剤の修飾方法であって、
前記遺伝子発現調節剤に、少なくとも1個の以下の式(1)で表される単位を、ヌクレアーゼ抵抗性を発現可能に遺伝子調節剤に付加、置換及び挿入のいずれか又はこれらを組み合わせて以下の式(3)で表されるように導入する、方法。
【化50】


[式中、Aは独立して以下の式(2);
【化51】


【化52】


[式中、R及びRは、それぞれ独立して水素又はヒドロキシル保護基を表し、各Xは独立してO、S又はSeを表し、各Xは独立してOH若しくはO、SH若しくはS、Se若しくはSe、炭素数1~4個のアルキル基又はモルホリノ基を表し、l、m及びnは独立して0以上の整数であり、少なくとも一つが1以上であり、B及びCは独立して改変されていてもよいオリゴヌクレオチドであってBとCを合わせた鎖長が3以上のオリゴヌクレオチドを表す。ただし、B及びCにおいてオリゴヌクレオチドの3’末端と5’末端の水酸基を含まない。]
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録
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