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イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー 新技術説明会 実績あり

国内特許コード P100000342
整理番号 TUK20080031
掲載日 2009年9月4日
出願番号 特願2008-214831
公開番号 特開2010-046038
登録番号 特許第5522820号
出願日 平成20年8月25日(2008.8.25)
公開日 平成22年3月4日(2010.3.4)
登録日 平成26年4月18日(2014.4.18)
発明者
  • 佐藤 征弥
  • 広田 恵介
  • 向井 真紀子
出願人
  • 国立大学法人徳島大学
  • 徳島県
発明の名称 イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー 新技術説明会 実績あり
発明の概要 【課題】本発明は、イチゴの重要病害で初期症状が似ている病原菌を早期に検出し、同定しうる検査方法を提供することを課題とする。より詳しくは、炭疽病、疫病および萎黄病等の病原菌の検出方法を提供することを課題とし、具体的には、検査に使用しうるオリゴヌクレオチド(プライマー)を提供することを課題とする。
【解決手段】各病原菌の遺伝子特異的に増幅し、増幅産物の分子量が異なるように設計された各プライマーを混合したプライマーミックスを用いて遺伝子増幅操作を行い、増幅産物の分子量を測定することによる。
【選択図】図2
従来技術、競合技術の概要



イチゴの重要病害である炭疽病、疫病、萎黄病はいずれも糸状菌の感染により引き起こされ、初期症状が似ている。各重要病害に起因する病原菌を早期に同定し、適切な対策をとることが被害の拡大を防ぐことにつながる。しかしながら、従来は、病原菌を分離・培養して形態を比較することで、菌の同定が行われ、時間と熟練と菌の形態に関する深い知識が必要であった。





近年では、種特異的なDNA情報に基づいた手法による病原菌等の同定が実施可能である。種特異的なDNA情報に基づいた遺伝子反応を用いた検査法は、1)操作が簡便であり、高度に専門的な知識を要しない、2)きわめて微量のDNAを対象とした検査ができ、培養法等と比較して病原菌をより高感度に検出できる、3)検査に要する時間が短い、などの利点があり、病原菌を同定する方法として幾つか報告されている。





例えば非特許文献1には、イチゴ、キク病原菌の核rDNA-ITS領域のシークエンスと属特異的プライマーの設計について開示されており、非特許文献2には徳島県で最近話題になっているイチゴ炭疽病、キュウリ褐斑病における薬剤耐性菌の出現状況に関し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の手法を用いてチトクロームb遺伝子変異の有無により検定を行ったことが開示されている。また、特許文献1には、真菌の病原体であるコレトトリカム・アクタツム、アルテナリア属、及びクラドスポリウム・カルポフィラムの検出のためのPCR分析方法について開示がある。





しかしながら、複数の菌の由来する各種のイチゴの重要病害に関し、一度の検査で容易かつ正確に菌を検出し、同定しうる検出方法はなかった。なお、各重要病害に対し、とりうる対策が異なるので、その対策を誤ると被害の拡大を招くことになる(図1参照)。したがって、早期に病原菌を検出し、同定する方法が望まれている。

【非特許文献1】

良県農業技術センター研究報告 第32号、9-18頁(2001年)

【非特許文献2】

国植物防疫研究 第41巻、49-50頁(2006年)

【特許文献1】

表2004-520843号公報

産業上の利用分野



本発明は、イチゴ重要病害に係る病原菌の早期診断のために各病原菌を検出するための各病原菌特異的DNA配列を増幅しうるDNA増幅プライマーに関し、より詳しくは各種病原菌特異的DNA配列を増幅する工程を含むイチゴ重要病害に係る病原菌の検出方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
イチゴ組織または土壌を試料とし、試料中に混入可能性のある遺伝子を分析することによるイチゴの重要病害の検出方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする検出方法:
1)イチゴの重要病害に関連する少なくとも5種以上の病原菌の遺伝子配列を各々特異的に増幅しうる、以下のA)~E)の組み合わせからなるプライマーペアを含む、イチゴの重要病害の検出用キットを用いて遺伝子増幅処理を行う工程:
A)配列番号1に記載のオリゴヌクレオチド(GTAGGGTCTCCGCGACCCT)と、配列番号3に記載のオリゴヌクレオチド(TTCCTACCTGATCCGAGGTCA)の組み合わせ;
B)配列番号4に記載のオリゴヌクレオチド(GCCGGCCCCACCACGGGGA)と、配列番号5に記載のオリゴヌクレオチド(AAGGGCCCACGTGTGCCGTG)の組み合わせ;
C)配列番号2に記載のオリゴヌクレオチド(CCTAAACTCTGTTTCTATATGTAAC)もしくは配列番号10に記載のオリゴヌクレオチド(ctatatgtaacttctgagtaaaacc)と、配列番号3に記載のオリゴヌクレオチド(TTCCTACCTGATCCGAGGTCA)の組み合わせ;
D)配列番号8に記載のオリゴヌクレオチド(CAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGC)と、配列番号9に記載のオリゴヌクレオチド(ATGCATACCGAAGTACACATTAAG)の組み合わせ;
E)配列番号6に記載のオリゴヌクレオチド(CTTCGGCCTGAGCTAGTAGCTTT)と、配列番号7に記載のオリゴヌクレオチド(ATGCATACCGAAGTACACACACAT)の組み合わせ;
2)上記遺伝子増幅処理工程により得られた増幅産物の分子量を測定する工程;
3)測定した分子量から、増幅産物に関連する病原菌を同定する工程。

【請求項2】
前記イチゴの重要病害が、炭疽病、疫病および/または萎黄病である請求項1に記載の検出方法。

【請求項3】
前記イチゴの重要病害に関連する病原菌が、糸状菌から選択される少なくとも種以上である、請求項1または2に記載の検出方法。

【請求項4】
前記糸状菌が、グロメレラ(Glomerella)属、コレトトリカム(Colletotrichum)属、フィトフィトラ(Phytophthora)属、フザリウム(Fusarium)属のいずれかに属する請求項3に記載の検出方法。

【請求項5】
プライマー機能を有する少なくとも2種のオリゴヌクレオチドを1対とした、以下のA)~E)の組み合わせからなるプライマーペアを含む、請求項1~のいずれか1に記載の検出方法に使用する、イチゴ重要病害の検出用キット
A)配列番号1に記載のオリゴヌクレオチド(GTAGGGTCTCCGCGACCCT)と、配列番号3に記載のオリゴヌクレオチド(TTCCTACCTGATCCGAGGTCA)の、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
B)配列番号4に記載のオリゴヌクレオチド(GCCGGCCCCACCACGGGGA)と、配列番号5に記載のオリゴヌクレオチド(AAGGGCCCACGTGTGCCGTG)の、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
C)配列番号2に記載のオリゴヌクレオチド(CCTAAACTCTGTTTCTATATGTAAC)もしくは配列番号10に記載のオリゴヌクレオチド(ctatatgtaacttctgagtaaaacc)と、配列番号3に記載のオリゴヌクレオチド(TTCCTACCTGATCCGAGGTCA)の、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
D)配列番号8に記載のオリゴヌクレオチド(CAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGC)と、配列番号9に記載のオリゴヌクレオチド(ATGCATACCGAAGTACACATTAAG)の、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ;
E)配列番号6に記載のオリゴヌクレオチド(CTTCGGCCTGAGCTAGTAGCTTT)と、配列番号7に記載のオリゴヌクレオチド(ATGCATACCGAAGTACACACACAT)の、2種のオリゴヌクレオチドの組み合わせ。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録
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