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金属プロトポルフィリン錯体の定量方法及びそれに用いる酵素センサー UPDATE コモンズ 新技術説明会

国内特許コード P100000445
整理番号 9001
掲載日 2009年12月11日
出願番号 特願2009-129822
公開番号 特開2010-273610
登録番号 特許第5761660号
出願日 平成21年5月29日(2009.5.29)
公開日 平成22年12月9日(2010.12.9)
登録日 平成27年6月19日(2015.6.19)
発明者
  • 坂本 寛
  • 古賀 真也
  • 小松 英幸
出願人
  • 国立大学法人九州工業大学
発明の名称 金属プロトポルフィリン錯体の定量方法及びそれに用いる酵素センサー UPDATE コモンズ 新技術説明会
発明の概要 【課題】従来のヘムを含む金属プロトポルフィリン錯体の定量方法を改善して、簡便かつ高感度な定量方法と、それに用いる酵素センサーを提供すること。
【解決手段】蛍光色素で蛍光ラベル化されたヘムオキシゲナーゼを用いる金属プロトポルフィリン錯体の定量方法において、蛍光色素として、親水性で、かつ、その蛍光波長が金属プロトポルフィリン錯体の吸収波長と重なるような蛍光色素を用いることからなる金属プロトポルフィリン錯体の定量方法、及び、それに用いる酵素センサー。ヘムオキシゲナーゼとしては、ラットヘムオキシゲナーゼの18番目の残基をシステインに変異させ、該位置に、金属ポルフィリン錯体の吸収波長と重なるような蛍光波長をもつ親水性蛍光色素を導入したものであるのが好ましい。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要


プロトポルフィリンは、ポルフィン環に4つのメチル基、2つのビニル基、2つのプロピォン酸基が結合したポルフィリンの総称であり、通常は、ヘムやクロロフィルの前駆体となる、下記化1の式で表わされるプロトポルフィリンIXを意味する。そして、金属とこのプロトポルフィリンとから構成される錯体が金属プロトポルフィリン錯体であり、金属が鉄原子(2価又は3価)の場合が、ヘモグロビン(ヘム蛋白)の構成成分として知られているヘムである。



【化1】




生体色素のヘムは、遊離状態で細胞内エフェクターとして働くことが近年明らかとなってきた。それに伴い、低濃度のヘムを高感度で定量するための技法に対するニーズが高まってきている。遊離ヘムは、幅広い吸収帯を有する一方で吸光率が小さい分子であるため、本来の吸光度測定による定量は、低濃度領域において不可能である。また、既存のヘム定量法は、煩雑な操作を有することや、低感度であること、また、夾雑物を多く含む試料の定量が困難であることなどの問題点がある。



これまで、具体的なヘムの定量には、主に、ピリジンヘモクロム法(非特許文献1と2参照)が用いられてきたが、有機溶媒による抽出操作が煩雑で、発色団の吸光係数も低く、毒性のあるピリジンを使うなど問題点が多かった。また、ヘモグロビンの定量に関し、試験検体中のヘモグロビンの非蛍光性ヘム部分を蛍光性ポルフィリンに定量的に変換し、その蛍光を検出して、検体中のヘモグロビン量を測定する方法も提案されているが(特許文献1と2参照)、煩雑な操作を要するものであり実用的ではなかった。



本発明者らは、ヘム分解酵素であるヘムオキシゲナーゼ(HO)の強固なヘム結合性を利用して、HOのアミノ酸改変及び蛍光プローブ修飾により、遊離型ヘムに応答する人工センサーを構築し、簡便かつ高感度な測定法を開発し提案した(非特許文献3と4)。しかしながら、この測定法では、微量なヘム濃度差を検出する場合に、感度面で不十分であるという問題があった。

産業上の利用分野


本発明は、ヘムを含む金属プロトポルフィリン錯体の定量方法と、それに用いる酵素センサーに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
蛍光色素で蛍光ラベル化されたヘムオキシゲナーゼを用いる金属プロトポルフィリン錯体の定量方法において、蛍光色素として、親水性で、かつ、その蛍光波長が金属プロトポルフィリン錯体の吸収波長と重なるような蛍光色素を用い、前記ヘムオキシゲナーゼが、ラットヘムオキシゲナーゼの18番目の残基をシステインに変異させ、該位置に親水性蛍光色素を導入したものであることを特徴とする金属プロトポルフィリン錯体の定量方法。

【請求項2】
前記システインへの変異は、前記18番目の残基のみになされていることを特徴とする請求項1記載の金属プロトポルフィリン錯体の定量方法。

【請求項3】
前記ラットヘムオキシゲナーゼは、C末端膜結合部分を除去して水溶性とされたものであることを特徴とする請求項1又は2記載の金属プロトポルフィリン錯体の定量方法。

【請求項4】
前記金属プロトポルフィリン錯体がヘムであり、前記親水性蛍光色素の最大蛍光波長が450nm以下であることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項に記載の金属プロトポルフィリン錯体の定量方法。

【請求項5】
蛍光色素の蛍光波長が金属プロトポルフィリン錯体の吸収波長と重なるような親水性蛍光色素で蛍光ラベル化されたヘムオキシゲナーゼからなり、前記ヘムオキシゲナーゼが、ラットヘムオキシゲナーゼの18番目の残基をシステインに変異させ、該位置に親水性蛍光色素を導入したものである酵素センサー。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
詳細は、下記「問合せ先」まで直接お問い合わせください。


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