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ミトコンドリアの代謝活性測定方法 コモンズ

国内特許コード P100000678
整理番号 I028P001
掲載日 2010年5月14日
出願番号 特願2010-075564
公開番号 特開2011-205935
登録番号 特許第5477791号
出願日 平成22年3月29日(2010.3.29)
公開日 平成23年10月20日(2011.10.20)
登録日 平成26年2月21日(2014.2.21)
発明者
  • 藤川 誠
  • 吉田 賢右
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 ミトコンドリアの代謝活性測定方法 コモンズ
発明の概要 【課題】ミトコンドリア膜の損傷を与えることなく簡便にミトコンドリアの代謝活性を測定できる方法を提供すること。
【解決手段】ストレプトリジンO含有液で処理した細胞に対して、細胞透過用低張液を添加して透過処理し、かかる透過処理した細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝活性を測定するミトコンドリア代謝活性測定方法である。
【選択図】図1
従来技術、競合技術の概要



従来、哺乳類Fo1-ATP合成酵素のATP合成活性を測定するには、肝臓などの組織や培養細胞からのミトコンドリア画分を調製する必要があった。かかるミトコンドリア画分の調製には、組織や細胞の低張処理後にホモホジナイザーにより細胞膜を破砕して、その抽出液を低速遠心にて核を除去、その抽出液をさらにショ糖勾配を利用した高速遠心してミトコンドリアを沈殿させていた。この調製作業は煩雑な上、ミトコンドリア膜の損傷が問題となっていた。





また、培養細胞の場合には、10細胞ほどを集めて、ジギトニンなど穏和な界面活性剤により透過処理を行った上で活性測定する方法も知られている(非特許文献1参照)。この方法も、上記の方法と同様に、細胞の剥離、遠心、洗浄など作業が煩雑であり、さらに、界面活性剤が、細胞膜だけでなくミトコンドリア膜へも損傷を与えるという問題があった。

産業上の利用分野



本発明は、ハイスループットスクリーニングに適用可能なミトコンドリア代謝活性測定法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
ストレプトリジンO(StreptolysinO)含有液を用いて細胞をインビトロで透過処理し、該透過処理した細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝活性を測定する方法であって、ストレプトリジンO含有液を添加して15℃以下で反応させた後、細胞透過用低張液を添加して25~45℃で反応させ透過処理を行うことを特徴とするミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項2】
透過処理した細胞に対して、アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液を添加することを特徴とする請求項1記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項3】
細胞が培養細胞であることを特徴とする請求項1又は2記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項4】
10個以下の細胞を用いて測定を行うことを特徴とする請求項1~のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項5】
プレート上で培養した細胞に対して、直接透過処理を行うことを特徴とする請求項1~のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項6】
区分けされた複数区画の細胞に対して同時に透過処理を行うことを特徴とする請求項1~のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項7】
o1-ATP合成酵素によるATP合成活性を測定することを特徴とする請求項1~のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項8】
ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光を検出することによりATP合成活性を測定することを特徴とする請求項1~のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項9】
ミトコンドリア膜電位に関連する蛍光を検出することにより呼吸鎖活性を測定することを特徴とする請求項1~のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項10】
発光又は蛍光を定量することによりATPを定量することを特徴とする請求項又は記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項11】
ストレプトリジンO含有液と、細胞透過用低張液と、アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液とを備えたことを特徴とするミトコンドリア代謝活性測定用キット。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2010075564thum.jpg
出願権利状態 登録
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