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アレルゲン蛋白質の検出方法

国内特許コード P100001003
掲載日 2010年10月1日
出願番号 特願2004-528835
登録番号 特許第4164576号
出願日 平成15年7月8日(2003.7.8)
登録日 平成20年8月8日(2008.8.8)
国際出願番号 JP2003008668
国際公開番号 WO2004017073
国際出願日 平成15年7月8日(2003.7.8)
国際公開日 平成16年2月26日(2004.2.26)
優先権データ
  • 特願2002-236048 (2002.8.13) JP
発明者
  • 矢野 裕之
  • 黒田 秧
出願人
  • 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 アレルゲン蛋白質の検出方法
発明の概要

本発明は、被験試料中の蛋白質の遊離SH基を化学修飾することにより保護し、遊離SH基が保護された蛋白質のジスルフィド結合を切断してSH基を露出させ、露出したSH基を検出することを含む、ジスルフィド結合を有する蛋白質又はアレルゲン蛋白質の検出方法に関する。

従来技術、競合技術の概要

アレルゲン蛋白質は我々の生活環境に広く存在している。アレルゲン蛋白質は食品アレルギー、ハウスダストアレルギー、花粉症等をもたらす有害な作用を示し、時にはアナフィラキシー等の致命的な症状を引き起こすこともある。アレルギー発症のメカニズムを解明し、防御法を開発するためには、アレルゲン蛋白質を包括的にスクリーニングすることが重要な課題である。
従来のアレルゲン蛋白質のスクリーニング法としては、イムノブロッティング法による検出法、すなわち蛋白質をニトロセルロースやPVDF等の膜に転写し、その蛋白質とアレルギー患者の血清中のIgE抗体とを反応させて、蛋白質に結合した抗体を検出する方法が用いられている(例えば、Weiss,W.,et al.,Electrophoresis,18,826-833(1997))。この方法を用いる場合、膜に転写する際に微量なアレルゲン蛋白質が失われやすく、重要なアレルゲン蛋白質が検出されずに見逃される可能性があった。そのため、ブロッティング手順を必要とせずにアレルゲン蛋白質を検出できる方法が求められている。
一方、一般的な蛋白質の検出方法としては、蛋白質を含む試料を二次元電気泳動(O’Farrell,P.H.,et al,Journal of Biological Chemistry,250,pp4007-4021(1975))した後、銀染色、色素染色(クーマシー染色)、ネガティブ染色又は蛍光染色等によりゲルを染色して蛋白質を可視化する方法が慣用されている。
さらに、試料中の蛋白質を予め還元してからモノブロモビマンにより蛍光標識し、それを二次元電気泳動に供し、蛍光シグナルを可視化することにより、蛋白質を高感度に検出する方法も知られている(Urwin,V.E.,and Jackson,P.,Anal.Biochem.209,57-62(1993))。
しかしながら、アレルゲン蛋白質を高感度に検出できる方法は知られていない。

産業上の利用分野

本発明は、蛋白質の検出方法、特にアレルゲン蛋白質の検出方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】 被験試料中の蛋白質の遊離SH基を化学修飾することにより保護し、遊離SH基が保護された蛋白質のジスルフィド結合を切断してSH基を露出させ、露出したSH基を検出し、検出されたSH基を有する蛋白質を単離してそのアミノ酸配列決定を行い、決定されたアミノ酸配列を既知アレルゲン蛋白質のアミノ酸配列と比較することによりアレルゲン蛋白質を同定することを含む、アレルゲン蛋白質のスクリーニング方法。
【請求項2】 決定されたアミノ酸配列を、アミノ酸配列データベースにおいて相同性検索することにより既知アレルゲン蛋白質のアミノ酸配列と比較する、請求項1に記載の方法。
【請求項3】 露出したSH基とSH基標識物質とを反応させて、標識されたSH基を検出することにより、露出したSH基を検出する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項4】 標識されたSH基を検出する前に、二次元電気泳動により被験試料中の蛋白質を分離することを特徴とする、請求項記載の方法。
【請求項5】 化学修飾がヨードアセトアミドによるアルキル化であり、SH基標識物質がモノブロモビマンである、請求項3又は4記載の方法。
【請求項6】 被験試料がイネ科植物の種子、花粉、ダニ又はハウスダストからの蛋白質抽出物である、請求項1~5のいずれか1項記載の方法。
【請求項7】 SH基保護剤及びSH基検出物質を含む、アレルゲン蛋白質のスクリーニング用キット。
【請求項8】 ヨードアセトアミド及びモノブロモビマンを含む、アレルゲン蛋白質のスクリーニング用キット。
【請求項9】 還元剤をさらに含む、請求項7又は8記載のキット。
産業区分
  • 試験、検査
  • 食品
  • 治療衛生
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2004528835thum.jpg
出願権利状態 権利存続中


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