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ポリメラーゼ連鎖反応に用いる鋳型DNAを菌体から調製する方法

国内特許コード P100001008
掲載日 2010年10月1日
出願番号 特願2005-504803
登録番号 特許第4496372号
出願日 平成16年1月31日(2004.1.31)
登録日 平成22年4月23日(2010.4.23)
国際出願番号 JP2004000960
国際公開番号 WO2004070032
国際出願日 平成16年1月31日(2004.1.31)
国際公開日 平成16年8月19日(2004.8.19)
優先権データ
  • 特願2003-030586 (2003.2.7) JP
発明者
  • 青木 孝之
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 ポリメラーゼ連鎖反応に用いる鋳型DNAを菌体から調製する方法
発明の概要 吸水性の担体に供試菌体を付着させて増殖させ、次いで、同担体をフェノールとCIAを等量混合した混合液で処理し、さらに、遠心分離後の上清を一定量分取し、揮発し乾燥させることで、DNA以外の夾雑物を反応に問題が無い程度に除去した鋳型DNA試料を調製することが可能であることを見いだした。また、この方法によれば、同一条件で調製された鋳型DNA試料を複製し保存することも可能であった。この方法で調製した鋳型DNAを利用して、PCR反応を試みたところ、多くの糸状体の菌類や酵母において、効率的に遺伝子増幅産物が得られた。
産業上の利用分野

本発明は、菌体からDNAを調製する方法に関する。さらに、本発明は、該方法により調製した鋳型DNAを用いたPCR法に関する。
生物の遺伝子DNA配列を解析するためには、事前にPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を用い、解析対象の遺伝子DNA領域を増幅することが一般的である。そのためには、鋳型DNAを調製する必要があるが、鋳型DNAを抽出する過程で、PCI(フェノール-クロロフォルム-イソアミルアルコール)混合液を用いる方法(非特許文献1)は、冷エタノール等で、DNA分子の再沈殿等、DNA分子の洗浄、純化行程が必要であった。
また、糸状体の菌類におけるPCR用の鋳型DNA試料の調製には、従来から複雑な手順と時間を要する前処理が必要であった(DNAを菌体から抽出精製する常法(非特許文献2))。また、DNAを抽出せず、少量の菌体や胞子を反応液に直接投入してPCR反応を行う、direct PCR(非特許文献3)やspore PCR法(非特許文献4)も試されているが、成功率は常法と比べると、投入する菌体の量や生育状態等の不確定要素が多く、成功率は不安定かつ低かった。後者では、反復実験やプライマー・セット等の条件を変更したPCR実験の場合にも、鋳型DNAの複製・保存ができないため、菌体を新たに培養し、試料を準備し直す必要があった。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
〔非特許文献1〕中山広樹(1996)細胞工学別冊 目で見る実験ノートシリーズ「バイオ実験イラストレイテッド」本当にふえるPCR.秀潤社刊.東京.162P.「5.微量DNAサンプルの調整法---末梢血のgenotypingを例に」p.52-54.
〔非特許文献2〕O′Donnell,K.,Cigelnik,E.,Weber,N.S.and Trappe,J.M.(1997)Phylogenetic relationships among ascomycetous truffles and the true and false morels inferred from 18S and 28S ribosomal DNA sequence analysis.Mycologia 89:48-65.
〔非特許文献3〕中山広樹(1996)細胞工学別冊 目で見る実験ノートシリーズ「バイオ実験イラストレイテッド」本当にふえるPCR.秀潤社刊.東京.162P.「5-2 実験例:コロニーからのダイレクトPCR」p.80-82.
〔非特許文献4〕Iwamoto,S..Tokumasu,S.,Suyama,Y.and Kakishima,M.(2002)Molecular phylogeny of four selected species of the strictly anamorphic genus Thysanophora using nuclear ribosomal DNA sequences.Mycoscience 43:169-180.

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の(a)~()に記載の工程を含む、菌体からDNAを調製する方法。
(a)以下の(1)から(3)の特徴を有する担体に菌体を付着させる工程
(1)栄養成分を含んでいる
(2)吸水性である
(3)多重性である
(b)担体に付着させた菌体を該担体上で培養することにより増殖させ、菌体を調製する工程
)サンプルチューブに、工程()において調製された菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
)遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
)サンプルチューブから上清を回収する工程
)回収した上清の水分を除去することによりDNAを回収する工程

【請求項2】
菌体からポリメラーゼ連鎖反応に用いる鋳型DNAを調製する方法である、請求項に記載の方法。

【請求項3】
以下の(a)~()に記載の工程を含む、ポリメラーゼ連鎖反応法。
(a)以下の(1)から(3)の特徴を有する担体に菌体を付着させる工程
(1)栄養成分を含んでいる
(2)吸水性である
(3)多重性である
(b)担体に付着させた菌体を該担体上で培養することにより増殖させ、菌体を調製する工程
)サンプルチューブに、工程()において調製された菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
)遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
)サンプルチューブから上清を回収する工程
)回収した上清の水分を除去することによりDNAを回収する工程
)回収したDNAとポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程

【請求項4】
被験菌体の鑑別・同定方法であって、
(a)以下の(1)から(3)の特徴を有する担体に被験菌体を付着させる工程
(1)栄養成分を含んでいる
(2)吸水性である
(3)多重性である
(b)担体に付着させた被験菌体を該担体上で培養することにより増殖させ、被験菌体を調製する工程
)サンプルチューブに、工程()において調製された被験菌体が付着した担体と、フェノール、クロロフォルムおよびイソアミルアルコールの混合液とを加え、混合する工程
)遠心により、サンプルチューブ内のフェノール層を沈降させる工程
)サンプルチューブから上清を回収する工程
)回収した上清の水分を除去することによりDNAを回収する工程
)回収したDNAと特定の菌種に由来するDNAに特異的にハイブリダイズするプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
を含み、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物が得られた場合に、被験菌体が上記プライマーの由来菌種と同一種であると判定される方法。

【請求項5】
担体が紙または不織布である、請求項1~のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
担体の形状が円盤状である、請求項1~5のいずれかに記載の方法。

【請求項7】
菌体が糸状体の菌または酵母である、請求項1~のいずれかに記載の方法。

【請求項8】
以下の(1)から(3)の特徴を有する担体、並びにサンプルチューブおよび/または栄養溶液を含む、菌体のDNA調製用キット。
(1)栄養成分を含んでいる
(2)吸水性である
(3)多重性である

【請求項9】
さらにフェノールおよび/またはクロロフォルムとイソアミルアルコールの混合液を含む、請求項に記載のキット。

【請求項10】
担体が紙または不織布である、請求項8または9に記載のキット。

【請求項11】
担体の形状が円盤状である、請求項8~10のいずれかに記載のキット。

【請求項12】
菌体が糸状体の菌または酵母である、請求項8~11のいずれかに記載のキット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録


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