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一塩基反復多型解析方法及び一塩基多型解析方法

国内特許コード P100001287
掲載日 2010年12月2日
出願番号 特願2009-098068
公開番号 特開2010-246445
登録番号 特許第5641465号
出願日 平成21年4月14日(2009.4.14)
公開日 平成22年11月4日(2010.11.4)
登録日 平成26年11月7日(2014.11.7)
発明者
  • 西森 敬
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 一塩基反復多型解析方法及び一塩基多型解析方法
発明の概要 【課題】遺伝子型判定マーカーを利用して、一塩基反復多型中の反復数を解析する方法、及び一塩基反復の近傍に存在する一塩基多型を解析する方法を提供する。
【解決手段】以下のステップ:(a)対象となる一塩基反復多型又は一塩基反復の近傍に存在する一塩基多型が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップ、(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップ、(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、分離処理に供するステップ、及び(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較ステップを含む、一塩基反復多型中の反復数又は一塩基多型を解析する方法。
【選択図】図5B
従来技術、競合技術の概要


ゲノム、mRNAなどのある生物の核酸は、その生物に関する遺伝情報を含んでいる。個体間での遺伝子配列の変化は、多くの明白な表現型の相違(例えば毛髪、皮膚等の色素形成)及び多くの非明白なもの(例えば薬剤耐性及び疾患の易罹患性)を説明することが可能である。DNA多型を構成する1塩基対置換などのヌクレオチド配列における微小な変化でさえも、タンパク質の性質又は量に対して顕著な影響を及ぼす場合がある。



DNA多型はゲノム全体を通じて遺伝子内及び遺伝子間に存在し、種々の型が結果として異なる遺伝子機能をもたらす場合があり、あるいはもたらさない場合もある。遺伝子機能の差異は、同じ配列の2つの別個の型の機能を比較することにより決定される。ほとんどの多型は遺伝子機能を変化させず、そのような場合は中立的突然変異、又は中立多型と称される。その他の突然変異は、例えばタンパク質のアミノ酸配列を変化させることにより、あるいはプロモーターのような制御配列又はRNAスプライシング又は分解シグナルを変化させることにより、遺伝子機能に影響を及ぼす。遺伝子機能に影響を及ぼすDNA多型が疾患に関与することもある。すなわち、疾患の状態を誘発したり影響を及ぼしたりすることに加えて、突然変異は、病原体の変化した病原性、又は患者の疾患への易罹患性及び治療に対する抵抗性をもたらす場合もある。



DNA配列内における特定のヌクレオチドの変化又は特定の突然変異を検出する能力は、医療上又は非医療上の目的の多くに有用である。ヌクレオチドの変化を同定することができる方法は、DNA多型に関わる疾患のスクリーニング及び診断を可能にする。多型はまた、疾患に関与する遺伝子を同定するための遺伝子研究において有用である。多型が1以上の遺伝子の機能を疾患への易罹患性が増大するように変化させる場合、そのような多型は、疾患を有さない個体と比較して疾患を有する個体において、より高頻度に存在することになる。統計学的方法を用いることにより、正常な集団と比較した場合に罹患した集団で観察される多型の頻度を評価することができ、多型と疾患の表現型との間の因果関係の確立を容易にすることができる。疾患に相関する配列の変異を迅速に同定できる方法はまた、予防的手段を行う場合、疾患発症の確率を調べる場合、及びこのような疾患の予後を評価する場合において、価値あるものである。



中立的突然変異に関しては、これが自然淘汰を受けないために、時間とともに一定の割合で蓄積していく。このことが、中立的突然変異の分子時計としての利用の基礎となっている。中立的突然変異によるDNA多型(中立多型)は、例えば、微生物から高等生物までの系統解析、又は特定の系統の検出に利用されている。一定期間内での変異の頻度が十分に低く、利用に支障がないと推測される多型は、植物品種のDNA鑑定及び法医学的分析などに利用されている。



DNA多型のうち、最小単位であるゲノムDNAでの1ヌクレオチド変化は、一塩基多型又は単にSNP(Single Nucleotide Polymorphism)と称される。SNPなどの遺伝的多型の有用性の中核をなすのは、既知の多型に関して個体の遺伝子型を決定する能力である。この問題に対して多くのアプローチがなされてきた。例えば、一部の多型は、偶然にも制限エンドヌクレアーゼの開裂部位において変化をもたらし、これにより、消化されたゲノムDNA試料を電気泳動で分離する場合に観察されるフラグメントのパターンを変化させる。これは、制限酵素断片長多型分析、すなわちRFLP分析により検出することができる。



1本鎖高次構造多型(SSCP)分析もまた、増幅されたDNAフラグメント内のSNPを検出できる。この方法においては、増幅されたフラグメントを変性させ、次に非変性ポリアクリルアミドゲル中における電気泳動の間に再アニーリングさせる。1ヌクレオチド配列変化の存在は、野性型配列と比較した場合に、コンホメーション及び試料の電気泳動における移動度に検出可能な変化をもたらし得る。



ハイブリダイゼーションに基づく方法では、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブを使用する(例えば、特許文献1及び2参照)。ハイブリダイゼーションに基づく方法には、例えば、プローブRNA:試料DNA2本鎖でのミスマッチにおけるリボヌクレアーゼA切断に基づく検出、又はプローブDNA:試料DNA2本鎖におけるミスマッチについての変性勾配ゲル電気泳動が含まれる(非特許文献1及び2において概説されている)。



他のSNP遺伝子タイピング方法は、対立遺伝子特異的増幅(例えば、特許文献3~5参照)、ミニ配列決定法(mini-sequencing methods)、定量的RT-PCR法(例えばいわゆる「TaqManアッセイ」;例えば、Gelfandの特許文献6、Livakらの特許文献7、及びHaalandの特許文献8、並びに非特許文献3~6)、及び1ヌクレオチドプライマー伸長(SNuPE)アッセイ(例えば、特許文献9)及び関連する伸長アッセイ(例えば、特許文献10~14)を使用する。



SNPの解析のために、キャピラリー電気泳動(CE)が利用されてきた。ある研究では、1ヌクレオチドポリメラーゼ伸長アッセイの結果を分析するためにCEが使用された(非特許文献7)。その研究においては、多型部位に直接に隣接するプライマーのハイブリダイゼーション及び1個の蛍光標識連鎖ターミネーターによるプライマーの伸長、その後のCE分離と取り込まれた標識の検出とにより、既知のSNPを含むPCR(Polymerase Chain Reaction)増幅DNAを分析している。別の研究においては、既知のSNPを含むPCR増幅DNAは、2つの同一に蛍光標識された連鎖ターミネーターの1つを用いて伸長させ、その後CE分離及び取り込まれた標識の検出を行った。取り込まれたターミネーターの同一性は、オリゴヌクレオチドに関するCE移動度の配列特異的な相違に基づいて決定される。非特許文献8では、共通の上流プライマーを有し3’末端塩基において異なる2つの異なって蛍光標識されたプライマーのセットを用いたPCR、その後のCE及び蛍光検出を含むSNP遺伝子タイピングアッセイを記載している。



特許文献15は、グラフ理論技術に従ってサブセットに分配された分子の同時分離のためのCEの使用、及びSNP遺伝子タイピングへのこの方法の適用を教示している。特許文献16は、多型部位にハイブリダイズされたプライマーから蛍光標識を放出させるためにポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を使用するSNP検出方法におけるCEの使用を記載している。特許文献17もまた、核酸プローブ脱重合活性を含むSNP遺伝子タイピング方法におけるCE分離の使用を記載している。特許文献18は、タグが特定のヌクレオチドに相関する、有機的にタグ付加されたフラグメントを生成させる配列決定法を記載している。フラグメントをCEにより分離し、次にフラグメントからタグを切断し、切断されたタグを非蛍光スペクトル分析又は電位差測定法により検出する。特許文献19は、多型部位にハイブリダイズされたプライマーから識別ヌクレオチドを放出させる脱重合活性を用いるSNP検出方法におけるCEの使用を記載している。



SNPと同様に小さな単位で見られる遺伝的多型としては、マイクロサテライトが挙げられる。これは、SSR(Sort Sequence Repeat若しくはSimple Sequence Repeat)又はSTR(Short Tandem Repeat)とも呼ばれる、短い同一配列の反復単位の隣接した反復(縦列反復)を有する領域である。ゲノム配列内での縦列反復は、真核生物のゲノムDNAの密度勾配遠心による分画において形成されるいわゆるサテライトバンドの形成に関与するため、サテライトと称されるようになった。当初検出された反復単位が数百bpであったので、一般に、それよりも小さい10~100bp程度の反復単位を有するものはミニサテライト、さらに小さい1~13bp程度の反復単位を有するものはマイクロサテライトと称される。SSRなどのマイクロサテライトは、以前には原核生物においては存在しないと考えられていたが、種々の遺伝子のシーケンス解析の過程で原核生物にも存在することが明らかとなった。サテライト内の反復単位の反復数には多様性がある場合がある。現在では、真核生物に加えて、ゲノムプロジェクトによりゲノム解析がなされた多くの原核生物においても、この多様性を利用した遺伝子型判別のためのサテライトの利用が可能となっている。例えば、マイクロサテライトは、植物での品種の遺伝子型の同定などに役立てられ、ミニサテライトは、微生物の遺伝子型の同定などに役立てられている(非特許文献9)。



SSRの多くはその全体を含む領域で100~200bp程度であることが多いため、PCR増幅を用いて、産物の長さを比較することにより反復数の特定が行われている。しかしながら、反復単位が一塩基である場合には、PCR産物長の比較による多型の同定は比較的困難である。そのような場合には、上記のSNP解析と同様の手法やシーケンス法を用いて反復数の特定を行う必要がある。

産業上の利用分野


本発明は、一塩基反復多型及び一塩基多型の解析方法に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子型判定マーカーを利用して、一塩基反復多型中の反復数を解析する方法、及び一塩基反復の近傍に存在する一塩基多型を解析する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
一塩基反復多型中の反復数を解析する方法であって、以下のステップ:
(a)対象となる一塩基反復が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有するステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、電気泳動による分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基反復中の反復数を判定するステップ
を含む、上記方法。

【請求項2】
一塩基反復とともにPCR増幅される核酸領域に存在する一塩基多型を解析する方法であって、以下のステップ:
(a)対象となる一塩基多型が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカーを調製するステップであって、該遺伝子型判定マーカー中に含まれる各核酸断片は、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有するステップ、
(b)被験核酸中の、該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する領域をPCR法を用いて増幅することにより被験核酸断片を調製するステップであって、該被験核酸断片は該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片とは異なる標識物質を用いて標識されているステップ、
(c)該遺伝子型判定マーカーと該被験核酸断片とを混合し、電気泳動による分離処理に供するステップ、及び
(d)該被験核酸断片の移動度を該遺伝子型判定マーカー中の核酸断片の移動度と比較することにより、該被験核酸断片における対象となる一塩基多型を判定するステップ
を含む、上記方法。

【請求項3】
前記核酸断片がDNA断片である、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
前記核酸領域がゲノム領域である、請求項1~のいずれか1項記載の方法。

【請求項5】
前記遺伝子型判定マーカー中の各核酸断片が、前記対象となる一塩基反復中の反復数において1ずつ異なる配列を有する、請求項1~のいずれか1項に記載の方法。

【請求項6】
前記電気泳動による分離処理をキャピラリー電気泳動により行う、請求項1~のいずれか1項に記載の方法。

【請求項7】
前記遺伝子型判定マーカー中の核酸断片が、1種類の標識物質を用いて標識されている、請求項1~のいずれか1項に記載の方法。

【請求項8】
前記標識が蛍光標識である、請求項1~のいずれか1項に記載の方法。

【請求項9】
前記核酸領域が細菌のゲノム領域である、請求項1~のいずれか1項に記載の方法。

【請求項10】
前記細菌がヨーネ菌である、請求項に記載の方法。

【請求項11】
前記核酸領域が配列番号1又は2に示される配列又は該配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。

【請求項12】
対象となる一塩基反復多型が生じ得ることが知られている核酸領域、又は一塩基反復とともにPCR増幅され、且つ対象となる一塩基多型が生じ得ることが知られている核酸領域に対応する、該一塩基反復において異なる反復数を有する配列を有する標識された2種以上の核酸断片を含む遺伝子型判定マーカー、及び該遺伝子型判定マーカーに含まれる核酸断片に対応する核酸領域を増幅するためのプライマーペアを少なくとも含む、一塩基反復多型中の反復数又は一塩基多型を解析するためのキット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2009098068thum.jpg
出願権利状態 登録


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