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類似植物体および生薬同定用DNAマイクロアレイ 新技術説明会

国内特許コード P110002060
整理番号 S2008-0100-N0
掲載日 2011年3月29日
出願番号 特願2007-296158
公開番号 特開2009-118776
登録番号 特許第5163999号
出願日 平成19年11月14日(2007.11.14)
公開日 平成21年6月4日(2009.6.4)
登録日 平成24年12月28日(2012.12.28)
発明者
  • 小松 かつ子
  • 朱 シュウ
出願人
  • 国立大学法人富山大学
発明の名称 類似植物体および生薬同定用DNAマイクロアレイ 新技術説明会
発明の概要

【課題】生薬の基原植物のSNPs(Single nucleotide polymorphisms)情報に基づいた生薬同定用DNAマイクロアレイ及びそれを用いた客観的且つ迅速な同定方法の提供を目的とする。
【解決手段】生薬の基原植物等の遺伝子一塩基多型(SNP)情報に基づいて、同定に有効である特異的な塩基置換を検出するために、複数の区画に区分してそれぞれオリゴヌクレオチドからなるプローブを支持体に固定してあり、前記各区分に固定したオリゴヌクレオチドは生薬の基原植物の遺伝子に特異的な塩基を識別できるような塩基配列になっていて、被同定生薬から抽出したtotal DNAを鋳型としてPCR法で増幅した後に蛍光標識した遺伝子の部分配列をターゲットとして、前記支持体に固定してある複数のプローブにハイブリダイズさせることで得られる蛍光パターンをバーコードとして解析同定するものであることを特徴とする。
【選択図】 図1

従来技術、競合技術の概要


生薬の同定は、従来、経験に基づく五感による鑑別や、外部形態、内部組織形態の観察や、成分化学的方法により行われている。
これらの方法は植物体の表現形質に基づいているのであり、環境や植物の生育段階による影響が避けられない。
また、形態学的同定法は、同定者の経験や主観的判断に左右される。
一方、遺伝子情報に基づく生薬の同定法は、客観的で、上記のような影響を受けない特徴がある。
分子生物学的手法を用いた客観的な生薬同定法の開発には過去10年間、Random amplified polymorphic DNA (RAPD)、Restriction fragment length polymorphism (RFLP)、Direct sequencing、Polymerase chain reaction (PCR)-RFLP、Amplification refractory mutation system (ARMS)など、さまざまな試みが行われてきた。
しかし、生薬の場合、加工や貯蔵の過程において、DNAの断片化が顕著であるため、RAPD、RFLPなどの方法は適用できない。
Panax属植物及び人参類生薬について、遺伝子レベルの同定法の研究は、過去10年間に数報が報告された。
核のInternal transcribed spacer (ITS)領域(非特許文献1)、18S rRNA遺伝子領域、葉緑体trnK遺伝子領域の塩基配列(非特許文献2)を決定する方法、さらに、これらの塩基配列の違いを利用したPCR-RFLP法、ARMS法(非特許文献3)、Multiplex ARMS法(非特許文献4)が報告されている。
最近、人参と西洋人参を区別するため、ITS領域に特異的なプライマーを設計して、Pyrosequencing法を利用する方法(特許文献1)、また、薬用人参の品種(会津産)を識別するための合成オリゴヌクレオチド及び塩基配列が公表された(特許文献2)。
一方、DNA マイクロアレイは、遺伝子発現を網羅的に解析することやSNPsを大量かつ迅速に検出できる画期的な技術である。
生薬や薬用植物の同定用DNAマイクロアレイの開発研究はこれまでに3件の報告があった。
(1)26S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいて6種類のプローブを含むDNAマイクロアレイを作成し、貝母の同定を試みた研究(非特許文献5)。
(2)16種のDendrobium属植物のITS領域のPCR産物をプローブとし、スライド上に固定化してマイクロアレイを作成し、石斛の同定に応用した研究(非特許文献6)。
(3)5S rRNA遺伝子のスぺーサー領域の配列に基づいて19プローブ(14‐31 bp)を設計してマイクロアレイを作成し、19種の有毒中薬の同定に応用した研究(非特許文献7)。
しかし、これらのマイクロアレイは、薬用植物または生薬1種につき1プローブのみを設計し、スライド上に配置したものであるため、相同性の高い近縁種由来のターゲットとは非特異的に結合する恐れがあり、確実性の上で問題があった。




【非特許文献1】Mol. Phylog. Evol., 1996, 6: 167-177

【非特許文献2】Planta Med., 2003, 69: 647-653

【非特許文献3】Biol. Pharm. Bull., 1997, 20: 765-769

【非特許文献4】Planta Med., 2004, 70: 189-192

【非特許文献5】Acta Pharmaceutica Sin., 2003, 38: 185-190

【非特許文献6】Planta Med., 2003, 69: 1172-1174

【非特許文献7】Planta Med., 2005, 71: 578-580

【特許文献1】WO 2006/016762 A1

【特許文献2】P2001-186886A

産業上の利用分野


本発明は、遺伝子多型に基づく簡便な類似植物群および類似植物体を基原とする生薬の同定に関し、特に人参類生薬の同定に好適な同定用DNAマイクロアレイに係る。

特許請求の範囲 【請求項1】
類似植物群の遺伝子一塩基多型(SNP)情報に基づいて、
同定に有効である特異的な塩基置換を検出するために、複数の区画に区分してそれぞれオリゴヌクレオチドからなるプローブを支持体に固定してあり、
前記各区分に固定したオリゴヌクレオチドは類似植物群の遺伝子に特異的な塩基を識別できるような塩基配列になっていて、
被同定植物体から抽出したtotal DNAを鋳型としてPCR法で増幅した後に蛍光標識した遺伝子の部分配列をターゲットとして、前記支持体に固定してある複数のプローブにハイブリダイズさせることで得られる蛍光パターンをバーコードとして解析同定するものであり、
前記固定する類似植物群は、オタネニンジン類(Panax属植物)であり、人参類の18S rRNA遺伝子の部分配列をターゲットとして下記塩基配列からなるプローブを支持体に固定してあることを特徴とするDNAマイクロアレイ。
(1)配列番号1で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(2)配列番号2で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(3)配列番号3で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(4)配列番号4で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(5)配列番号5で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(6)配列番号6で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(7)配列番号7で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(8)配列番号8で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(9)配列番号9で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(10)配列番号10で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(11)配列番号11で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(12)配列番号12で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(13)配列番号13で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(14)配列番号14で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(15)配列番号15で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(16)配列番号16で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(17)配列番号17で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(18)配列番号18で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(19)配列番号19で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(20)配列番号20で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(21)配列番号21で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(22)配列番号22で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(23)配列番号23で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(24)配列番号24で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(25)配列番号25で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(26)配列番号26で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(27)配列番号27で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(28)配列番号28で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(29)配列番号29で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(30)配列番号30で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(31)配列番号31で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(32)配列番号32で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(33)配列番号33で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(34)配列番号34で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(35)配列番号35で示された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。

【請求項2】
同定したい人参類生薬からtotalDNAを抽出し、それらを鋳型として18S rRNA遺伝子の部分領域をPCR法で増幅した後に、蛍光ラベル剤にて蛍光標識し、請求項記載のDNAマイクロアレイにハイブリダイズさせることで、プローブとの特異的な結合による蛍光パターンを測定することを特徴とする人参類生薬の同定方法。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2007296158thum.jpg
出願権利状態 権利存続中
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