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自己溶菌耐性細胞及びこれを用いた物質生産方法 実績あり

国内特許コード P110002252
整理番号 S2009-0960-N0
掲載日 2011年4月8日
出願番号 特願2009-174343
公開番号 特開2011-024494
登録番号 特許第5545562号
出願日 平成21年7月27日(2009.7.27)
公開日 平成23年2月10日(2011.2.10)
登録日 平成26年5月23日(2014.5.23)
発明者
  • 山田 守
出願人
  • 国立大学法人山口大学
発明の名称 自己溶菌耐性細胞及びこれを用いた物質生産方法 実績あり
発明の概要 【課題】
本発明は、原核細胞においてファージの感染や薬剤/酵素処理など外部からの直接的な刺激によらずに起こる溶菌に対して耐性を有する細胞、及びその細胞を用いた物質の生産方法を提供することをその目的とする。
【解決手段】
上記課題の解決のため、本発明は、原核生物において、活性酸素種応答タンパク質をコードした塩基配列を有する外来遺伝子で形質転換されたことを特徴とする自己溶菌耐性細胞、及びこの細胞を用いた物質の生産方法を提供する。
【選択図】 図3
従来技術、競合技術の概要



大腸菌や乳酸菌など種々の原核生物は、その物質生産能の多様性や培養の容易さなどから、組み換えタンパク質の大量発現、代謝産物の蓄積、発酵などを通じ種々の有用物質生産に利用されてきた。これらの生物を用いた物質生産は、適当な培地・培養液に菌株を接種した後、菌の増殖と共役的に行われるのが一般的である。菌の増殖は前期の対数増殖期(Log phase)と後期の定常期(Stationary phase)に分けることができ、対数増殖期には活発な増殖と物質生産能を示し、一方で定常期には菌の増殖が停止し、代謝活性も低下することが知られている。また、定常期に特徴的に見られる現象として、増殖した菌の自己溶菌(Bacteriolysis)が起こることが知られている。溶菌自体はバクテリオファージなどが感染した細菌などで普遍的に観察される現象であるが、培養が定常期に到達した細菌の細胞集団においては、ファージの感染や薬剤/酵素処理といった外部からの直接的な刺激によらない自己溶菌が起こることが明らかにされてきた(非特許文献1)。

培養液中における溶菌は、細胞の内容物の放出を伴うものであり、特に細菌を用いた物質生産においては、放出された核酸やタンパク質など目的物以外の好ましくない物質が培養液中に大量に混入する原因となり、目的物の精製のために多大なコストが生じるなど大きな問題になっていた。





細菌などの溶菌の問題を解決するための手段としては、これまで、主にバクテリオファージを用いた研究により、ファージ耐性菌とその作出方法(特許文献1)、ファージ溶菌耐性を持つ納豆菌の自然変異株(特許文献2)などが知られているが、これはファージ感染後の溶菌に対する抵抗性であって、他の要因による溶菌には適用できないという問題があった。また溶菌に係る遺伝子として、ある種のプラスミドにコードされたkil遺伝子とその作用機序が解析され(非特許文献2)、これに対する抵抗性を有した系(特許文献3)などが開示されているが、プラスミドを持たない系には適用できないという問題点があった。更に溶菌に係る遺伝子としてエンドリシン、トランスグリコシラーゼ、リゾチーム等の遺伝子を大腸菌ゲノム中に導入し、効果的に溶菌を誘導する系も開示されているが(特許文献4)、これらは積極的に溶菌を起こす遺伝子を導入するものであって、その抑制が溶菌の抑制につながるというものではなかった。ファージ感染やプラスミドなどが関与しない定常期における溶菌が、原核生物の内在的な因子(遺伝子)の働きにより引き起こされると考えられることから、これらの溶菌に広く適用可能な手段を提供するものとして、自己溶菌に耐性を有する細胞の開発が望まれていた。

産業上の利用分野



本発明は、原核生物の自己溶菌耐性細胞に関し、詳しくは、活性酸素種応答遺伝子で形質転換されたことにより自己溶菌耐性を獲得した細胞及び同細胞を用いた物質の生産方法に関する。





本明細書において、「菌」とは原核生物一般を指す。「自己溶菌」とは、ファージの感染や薬剤/酵素処理といった外部からの直接的な刺激によらず、原核生物の細胞が細胞壁の崩壊を伴って崩壊する現象を指す。「自己溶菌耐性」とは自己溶菌に対して耐性を有する形質、すなわち通常では自己溶菌がおこる条件下においても自己溶菌を起こさない形質と定義される。更に、本明細書において「外来遺伝子」とは、形質転換のために菌の外部から導入される遺伝子を指し、当該菌とは別種の生物由来の遺伝子、当該菌と同種の生物由来の遺伝子のどちらも含み、またこれらを改変した遺伝子も含む。

特許請求の範囲 【請求項1】
大腸菌(Escherichia coli)において、カタラーゼまたはスーパーオキシドディスムターゼのいずれかをコードした塩基配列を有する外来遺伝子で形質転換されたことを特徴とする、自己溶菌耐性細胞。

【請求項2】
大腸菌(Escherichia coli)において、
(1)araBAD、ilvIH、gal、lac、malXY、manXYZ、ful、fucAO、fucPIK、aga、xyl、mtlAD、lct、glvCBG、rhaBAD、malK-lamB、treBCのうちいずれかより選択されるオペロンのプロモーター・オペレーターをコードした塩基配列、及び
(2)カタラーゼまたはスーパーオキシドディスムターゼいずれかをコードした塩基配列の2種類の塩基配列を有する外来遺伝子で形質転換されたことを特徴とする、請求項1に記載の自己溶菌耐性細胞。

【請求項3】
自己溶菌が高温ストレスによって引き起こされる自己溶菌である、請求項1または請求項2に記載の自己溶菌耐性細胞。

【請求項4】
請求項1から請求項3のうちいずれか1項に記載の自己溶菌耐性細胞を用いることを特徴とする、物質の生産方法
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2009174343thum.jpg
出願権利状態 登録
山口TLOは平成11年11月に山口大学の教官50名の出資により設立された、リエゾン一体型のTLO活動会社です。山口大学を主とし、山口県内の大学・高専の研究成果をご紹介致します。特許の内容に興味を持たれた方は、下記までご連絡ください。


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