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走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡、その探針及び探針の製造方法。

国内特許コード P110002343
整理番号 S2009-0263-N0
掲載日 2011年4月13日
出願番号 特願2009-140602
公開番号 特開2010-261923
登録番号 特許第5467473号
出願日 平成21年6月11日(2009.6.11)
公開日 平成22年11月18日(2010.11.18)
登録日 平成26年2月7日(2014.2.7)
優先権データ
  • 0907471.7 (2009.4.30) GB
  • 0907599.5 (2009.5.1) GB
発明者
  • 高橋 康史
  • 末永 智一
  • 珠玖 仁
  • 村上 有美
  • 長峯 邦明
  • アンドリュー・シェヴチャク
  • ユーリ・コルチェフ
出願人
  • 国立大学法人東北大学
  • インペリアル イノベーションズ リミテッド
発明の名称 走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡、その探針及び探針の製造方法。
発明の概要 【課題】一本の探針により探針-試料間距離一定モードで走査し形状イメージングを行うと共に電気化学イメージング行う、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡測定法、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡、その探針および探針の製造方法を提供する。
【解決手段】中空基材の一端を先鋭化し先端部25bとして先端を切断してなる先端面に、ファラデー電流の計測を行うSECM電極26Aを備えると共に、中空基材の中空部25a内に、中空部25a内を満たす電解質の先端面の開口25cからの流出量に応じたイオン電流を計測するSICM電極27を備えた探針21を使用する。探針21を、探針-試料間距離一定モードで試料表面に沿って相対的に走査移動し、SICM電極27で計測するイオン電流を距離制御フィードバック信号に利用しつつ、SECM電極26Aで試料表面の電気化学イメージングを行うと共に、SICM電極27で試料表面の形状イメージングを行う。
【選択図】図1
従来技術、競合技術の概要



1931年にE.Ruskaにより電子を利用した走査型電子顕微鏡(Scanning Electric Microscope; SEM)が開発された。SEMの分解能はオングストロームオーダーに達し、ウィルスやDNAの測定が可能であり、生化学の発展に多大の影響を与えた。しかし、真空中で測定が行われるため、生物を『生きた状態』で観測することはできない。





走査型プローブ顕微鏡(Scanning Probe Microscope;SPM)は、先端を非常に鋭く尖らせた微小な探針(プローブ)を用いて試料表面をなぞるように走査し、試料表面の状態を評価する分析システムである。1981年に開発された走査型トンネル顕微鏡(Scanning Tunnel Microscopy;STM)は、プローブのトンネル電流をフィードバックして垂直方向の分解能を原子・分子のレベルで制御でき、形状測定を行う。





SPMのバイオロジーへの応用は、1985年に原子間力顕微鏡(Atomic Force Microscopy;AFM)が開発されたことに端を発する。AFMは導電性のない試料の測定も可能であるため、液中での生物を生きた状態で観察可能である。そのため、リアルタイムでイメージングを行うことで、ナノメートルスケールの生体分子の動的挙動が観察できる。しかし、溶液中で10nmほどの厚さの生細胞の形状を高解像度で測定することは、現在でも困難とされている。さらにAFMでは、極めて柔らかい試料や10μm程度の表面凹凸のある試料の測定が困難である。





走査型電気化学顕微鏡(Scanning Electrochemical Microscopy; SECM)は、プローブとしてマイクロ電極を用い、局所領域において試料表面に電極を近接させ電気化学反応種をファラデー電流として定量評価するものであり、微量で分解されやすい神経伝達物質や一酸化窒素の検出に有効である。この際、一定の電位に保持するため、充電電流の影響は現れない。また、局所的に化学反応を誘起させることが可能となり、生体試料の表面や代謝の評価に有効である。





電気化学測定は、時間分解能が非常に高く、in situで定量測定が可能であり、生体試料の計測に有効である。特に、マイクロ電極では、マクロ電極にはない次のような特徴を有する。

(1)酸化還元電位を印加した際にファラデー電流/充電電流が非常に大きく、高速・高感度な測定が可能である。

(2)測定電流が微小であるため、低電解質溶液中での測定が可能であり、IRドロップを抑えられる。

(3)電子移動反応が十分に速い場合、電気化学反応種が球面拡散状態となり、定常電流が得られる。





しかし、SECMはマイクロ電極を用いるため、STMやAFMのような解像度を得ることはできない。SECMにおいて、解像度の向上には電極半径の微細化と電極を試料に近接させる必要がある。





SECMの測定は、試料が生成した物質を電極が検出するGCモードと、電極でのレドックス反応により生成した物質を試料が再生し、再び電極表面で反応が起こるFBモードに大別できる。

GCモードは、はじめ溶液中に反応物が存在しないため、バックグラウンドの電流を非常に低くできる。そのため検出感度が非常に高い。また、酵素の反応時間とともに生成物が多くなるため、生成物を蓄積させることができる。細胞の代謝物(一酸化窒素、神経伝達物質)の検出は、GCモードである。

FBモードは、基質添加後の反応時間に影響を受けず、また、レドックスサイクルが電極-試料間距離に依存するため、解像度の高い測定が可能である。低濃度のメディエータを用いることで、電極でのメディエータの直接酸化電流を低く抑えることができる。金属パターンの測定や、親水性メディエータ(細胞膜を透過できない)を用いた細胞の形状測定がFBモードである。





電気化学反応種が溶液に均一に存在する系では、探針の高さを一定に保ち測定を行うと、試料表面の凹凸に対応してFB効果が働き、形状測定が可能である。しかし、形状ではなく生細胞の代謝物などを測定する不均一系では、細胞の凹凸によるネガティブFB効果を無視できなくなる。また、代謝物の濃度は距離に反比例するので、細胞からの距離が離れるほど低くなる。そのため電極を細胞に近接させる必要がある。しかし、電極が微細な場合に、電極を検出可能な距離、すなわち電極半径以下まで近接させることが困難となる。このように、微小電極を用いた検出物の高感度測定には望まないFB効果の除去が不可欠であり、電極―サンプル間距離をできる限り近づけ、一定に保つ制御システムを導入する必要がある。





走査型プローブ顕微鏡(SPM)は、先端を非常に鋭く尖らせた探針と試料との間に生じる作用を利用して探針と試料との距離を一定に保つ形状測定モードと、表面で生じる作用から表面状態を観察する表面観察モードとに大別される。表面観察モードによる測定では、探針を水平移動させるのが一般的であるが、凹凸の激しい生体試料では、できるだけ探針を試料に近接させる必要がある。そのため、一般的に、探針と試料との力学的な相互作用を利用して、探針を試料に対して一定距離に近接させ測定を行う形状測定モードが採用されている。





SECMは、試料表面の近傍の化学的な変化を高解像度で観察するための顕微鏡であり、試料が設置されている電気化学セルおよび四つの電極、即ち、プローブとしてのtip電極、試料側の電極、対極(auxiliary)及び参照(reference)電極とそれらの電極信号の検出・制御用のバイポテンショスタットとを含んで構成され、試料表面の近傍を微小探針でスキャンし、微小探針で起こる反応を画像化し、又は反応速度の定量を行うなどのために使用する顕微鏡である。





SECMは、二次元ステージに載置した試料に対応する上方の任意の高さに探針(プローブ)を位置させ、コンピュータ制御でステージを駆動し試料を二次元方向に走査し、探針で試料表面の近傍をスキャンし、試料の局所領域の化学反応に関する定量的な情報を微小探針で得ることができ、または微小探針で局所領域に化学反応を誘起することができかつ化学反応の定量的な情報を微小探針で得ることができ、微小探針で得られた定量的な情報についてバイポテンショスタットを用い、酸化還元反応下での局所的情報を直流電気信号で検出し、電気化学イメージングを行い、すなわち、画像化・視覚化を行い、電気化学計測、データ解析を行う顕微鏡である。

SECMは、生体・細胞サンプル、細胞及び生体膜の機能評価、半導体などの材料の評価・表面観察・修飾加工、局部腐食、液/液界面を経由するイオン・電子移動反応、電極表面研究など、幅広い分野の研究で応用されてきた。





SECMは、特に、局所領域の電気化学反応種の定量に有効であり、生体試料をその場で測定できるため、生体分子の機能評価に応用されてきた。SECMによる電気化学測定は、時間分解能が非常に優れているため、リアルタイムで細胞表面の状態を評価可能であるが、細胞表面の局所領域における試薬に対する応答を評価するには、局所領域での試薬のインジェクションを同時に行う必要がある。生体試料の測定においても距離制御は重要であり、できる限り電極を試料表面に近接させる必要がある。





SECMは、溶液中で電気化学測定を行う際、試料形状の影響を受けずに測定するには電極一試料間距離を一定にする必要があるが、高性能な距離制御機能を有していない。SECMは、形状測定モードにおいては、溶液中で電気化学測定を行う際、力学的相互作用が極めて低感度になるので、高性能な距離制御機能を有していないから高精密な電気化学イメージングが行えなかった。即ちSECM研究では、SPMのカテゴリーの中では例外的に、ほとんどの画像が距離制御機構を用いない高さ一定モードで取得されてきた。





SECMでは、constant current 距離制御が行われてきた。constant current 距離制御は、XY座標の変化に合わせて測定されるファラデー電流の電流値が一定となるように電極をZ方向に対して距離制御を行いながら走査する。SECMでは、距離制御のためのプローブの加工が必要なく、電極の微細化、すなわち、電極半径およびRGを小さくすることにより形状測定の解像度が向上する。

Constant Current距離制御の弱点は、導電性と絶縁性の混在した試料の測定ができないこと、ファラデー電流がフィードバック信号に使用されてしまうため、凹凸以外に試料表面の情報を取得できないこと、試料表面に電極を近接させる際に、従来の力学的相互作用を利用した距離制御システムが、試料に対してダメージを与える虞があること、が挙げられる。





そこで従来から、SECMについて、高性能な距離制御機能を保有させる研究が行われている(非特許文献1~10)。

非特許文献1には、SchuhmannらがSECMにシアフォース距離制御を取り入れたが、生細胞のイメージングには成功していないことが報告されている。非特許文献2には、Macphersonらは、原子間力顕微鏡に用いられる距離制御をSECMに導入したが、AFMプローブの形状の影響で表面の状態を詳細に捉えることが困難であることが報告されている。非特許文献3には、Wipfらにより、インピーダンス距離制御も考案されたが、電極が微小になると距離制御が困難となることが報告されている。





非特許文献4には、イオン電流計測用電極に一定電位を印加し、探針を試料に近接させると溶液抵抗が上昇し探針-試料間距離がイオン電流値に依存して変化する現象が観測されるため、その距離範囲でイオン電流値が一定になるよう探針を試料と並行に、X-Y平面、すなわち水平方向に走査することにより試料の形状イメージングを得ることができる、という報告がなされている。ところが、イオン電流値の安定性、探針の強度、探針-試料間の距離制御機構など技術的困難が多く、一般的に使用されるには至っていなかった。





非特許文献5には、1997年からKorchevらが精力的に走査型イオンコンダクタンス顕微鏡(Scanning ion-conductance microscope; SICM)のイメージングの改良に取り組んだことが報告されている。SICMは、1989年にHansmaにより発明されたイメージング技術であり、探針として、ガラスキャピラリに、電解液を充填し後方から電極を挿入したイオン電流計測用電極を用いている。





現在では、AFMでも取得困難な、極めて柔らかく、表面の高低差が著しい試料の形状を取得することが可能となったことが非特許文献6で報告されている。





ナノピペットをプローブとして用いてピペット先端部のイオン流をイオン電流として捉え、その信号をフィードバック制御することで溶液中の細胞表面の形状測定を完全に非接触で行うことが可能である。この特徴からSNOM(走査型近接場光学顕微鏡)との融合技術が開発されたことが非特許文献7で報告されている。





本発明の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡およびその探針に対応する、電気化学計測とイオン電流計測の同時取得の検討およびそれを可能とする探針の開発の試みは、これまでに報告例がある(非特許文献8、非特許文献9)。非特許文献8でBardらにより、また非特許文献9でBaurらにより、それぞれプローブの先端部の形状が類似した探針電極についての報告がされているが、ナノメートルオーダーの先端径を実現するには至っていない。

産業上の利用分野



本発明は、走査型プローブ顕微鏡の範疇に含まれるもので、一本の探針-試料間距離一定モードで走査しイメージングを行うと共に電気化学イメージングを行う際に用いられる走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡、その探針及び探針の製造方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
ナノメートルオーダーに先鋭化した先端面と、該先端面の開口により露出される中空部とを有する探針本体と、
上記探針本体の中空部の内周面に炭素層が形成され該炭素層の先端が上記探針本体の先端面において上記開口を取り巻いてリング状に露出して構成され、探針-試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測するSECM電極と、
上記中空部内に備えられており、該中空部内に満たされる電解質の上記開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するSICM電極と、
を有してなり、
上記SECM電極と上記SICM電極に独立に電圧が印加されて上記ファラデー電流と上記イオン電流とを干渉を起こすことなく同時に検出する、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。

【請求項2】
ナノメートルオーダーに先鋭化した先端面と、該先端面の各開口により露出される2つの中空部とを有する探針本体と、
上記探針本体の一方の中空部に導電線が配置されて該一方の中空部の開口を塞ぐと共に該導電線の先端が露出して構成され、探針-試料表面間の電気化学反応に起因するファラデー電流を計測するSECM電極と、
上記探針本体の他方の中空部内に備えられており、該他方の中空部内に満たされる電解質の上記開口からの流出量に応じたイオン電流を計測するSICM電極と、
を有してなり、
上記SECM電極と上記SICM電極に独立に電圧が印加されて上記ファラデー電流と上記イオン電流とを干渉を起こすことなく同時に検出する、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。

【請求項3】
前記探針本体が、鉛ドープされたソーダガラス、ボロシリケイト又はクオーツキャピラリの中空基材からなる、請求項1又は2に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。

【請求項4】
前記SECM電極を形成する金属線が金又はプラチナからなる、請求項2に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。

【請求項5】
前記SICM電極を形成する金属線が銀/塩化銀電極からなる、請求項1又は2に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。

【請求項6】
前記電解質が流出する前記中空部の開口径が1μm以下である、請求項1又は2に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。

【請求項7】
前記電解質が流出する中空部の開口径が10nm~100nmである、請求項1又は2に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。

【請求項8】
前記SECM電極の半径が1μm以下、前記SICM電極を収容する中空部の開口径が1μm以下である、請求項1又は2に記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針。

【請求項9】
請求項1乃至8の何れかに記載の走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針を備えており、
前記探針を、前記SICM電極で計測したイオン電流を距離制御フィードバック信号に利用しつつ、探針-試料間距離一定モードで試料表面に沿って相対的に走査移動し、前記SECM電極で電気化学イメージングを行うと共に、前記SICM電極で形状イメージングを行う、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡。

【請求項10】
一つの中空部を有する中空基材の一端をプラーで引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し、
次いで、上記中空部にブタンガスを充填して炭化させることにより上記中空部の内周面に炭素層を形成し、
次いで、一端を先鋭化して上記中空部内周面に上記炭素層を形成した中空基材の先端を、集束イオンビームで切断することにより、
上記中空基材を先鋭化した先端部を有しかつ中空部が露出する先端面を備えた探針本体として形成すると共に、上記探針本体の先端面に露出する上記炭素電極層のリング状の端面部をもって構成されたSECM電極を備え
上記中空部に金属線を挿入することにより、上記中空部の開口から電解質の流出量に応じたイオン電流を計測するためのSICM電極とした、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の製造方法。

【請求項11】
二つの中空部を有する中空基材の一方の中空部にSECM電極の形成用に金属線を挿入し、
次いで、プラーにより上記中空基材の先端部を上記金属線と共に引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化し、
次いで、集束イオンビームで上記中空基材の先端部を切断することにより、
他方の中空部が露出する開口を有する先端面を備えるとともに、上記一方の中空部の開口が閉塞状態で露出形成された上記金属線の切断面部にて形成されるSECM電極を備え
上記他方の中空部に別の金属線を挿入することにより、上記他方の中空部の開口から電解質の流出量に応じたイオン電流を計測するためのSICM電極とした、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の製造方法。

【請求項12】
二つの中空部を有する中空基材の一方の中空部にSECM電極の形成用に金属線を挿入すると共に、他方の中空部に易エッチング線を挿入し、
次いで、プラーにより上記中空基材の先端部を上記金属線及び易エッチング線と共に引き伸ばしてナノメートルオーダーに先鋭化しかつ上記二つの中空部の先端を閉鎖した状態とし、
次いで、易エッチング線を挿入した上記他方の中空部の先端部を露出して易エッチング線をエッチングして除去し、
次いで、集束イオンビームで上記中空基材の先端部を切断することにより、
上記他方の中空部が露出する開口を有する先端面を備えるとともに、該先端面に上記一方の中空部の開口を閉塞した状態に露出形成された上記金属線の切断面部にて形成されるSECM電極を備え
上記他方の中空部に別の金属線を挿入することにより、上記他方の中空部の開口から電解質の流出量に応じたイオン電流を計測するためのSICM電極とした、走査型電気化学イオンコンダクタンス顕微鏡用の探針の製造方法。
国際特許分類(IPC)
画像

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JP2009140602thum.jpg
出願権利状態 登録
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