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一枚膜リポソームを用いた酵素進化法の開発

国内特許コード P110002946
整理番号 E102P04
掲載日 2011年6月9日
出願番号 特願2011-076727
公開番号 特開2012-210170
登録番号 特許第5467320号
出願日 平成23年3月30日(2011.3.30)
公開日 平成24年11月1日(2012.11.1)
登録日 平成26年2月7日(2014.2.7)
発明者
  • 四方 哲也
  • 市橋 伯一
  • 角南 武志
  • 西川 雄大
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 一枚膜リポソームを用いた酵素進化法の開発
発明の概要 【課題】分子進化工学(例えば、酵素進化法)におけるスクリーニングの効率を向上させることを、本発明の課題とする。
【解決手段】上記課題は、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム、あるいは、核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソームを提供することによって解決された。
【選択図】図1
従来技術、競合技術の概要



酵素を進化工学的に改良する方法として、遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系を封入したリポソームとセルソータを用いた方法が利用されている。この方法では、酵素遺伝子にランダム変異を導入した遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系をリポソームに封入し、内部で酵素を発現させる。そして、セルソータにより、より高機能の酵素を含むリポソームを選択することにより、より高機能の酵素をコードする遺伝子を選択することができる。この選択を繰り返すことによって、酵素をコードする遺伝子を進化させることができる(非特許文献1)。





スクリーニング効率を向上させることによって、より少ない作業量で、より高い機能を有する酵素をコードする遺伝子が可能になると予測される。それゆえ、酵素進化法におけるスクリーニング効率の向上が求められている。

産業上の利用分野



本発明は、分子進化工学に利用するための、新規の一枚膜リポソームの分野に関連する。また、本発明は、一枚膜リポソームを用いた、新規の分子進化工学、特に、酵素進化工学に関連する。

特許請求の範囲 【請求項1】
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。

【請求項2】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項1に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項3】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項1に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項4】
核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。

【請求項5】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項4に記載のライブラリー。

【請求項6】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項4に記載のライブラリー。

【請求項7】
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。

【請求項8】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項7に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項9】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項7に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項10】
核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。

【請求項11】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項10に記載のライブラリー。

【請求項12】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項10に記載のライブラリー。

【請求項13】
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下:
(1)以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程;ならびに、
(2)工程(1)で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。

【請求項14】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。

【請求項15】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項13に記載の方法。

【請求項16】
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下:
(1)以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程;ならびに、
(2)工程(1)で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。

【請求項17】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。

【請求項18】
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項16に記載の方法。

【請求項19】
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下:
(i)請求項4に記載のライブラリーを提供する工程;
(ii)該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程;
(iii)該一枚膜リポソームに含まれるDNAを増幅する工程;および、
(iv)該増幅したDNAを単離する工程、
を包含する方法。

【請求項20】
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下:
(i)請求項10に記載のライブラリーを提供する工程;
(ii)該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程;
(iii)該一枚膜リポソームに含まれるRNAに逆転写酵素を作用させて、DNAを生成する工程;
(iv)該生成したDNAを増幅する工程;および、
(v)該増幅したDNAを単離する工程、
を包含する方法。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2011076727thum.jpg
出願権利状態 登録
参考情報 (研究プロジェクト等) ERATO 四方動的微小反応場 領域
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