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蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブ及びそれを利用した蛋白質-蛋白質相互作用の解析方法 実績あり

国内特許コード P110003085
整理番号 A161P09
掲載日 2011年6月16日
出願番号 特願2002-514409
登録番号 特許第3772193号
出願日 平成12年12月27日(2000.12.27)
登録日 平成18年2月24日(2006.2.24)
国際出願番号 JP2000009348
国際公開番号 WO2002008766
国際出願日 平成12年12月27日(2000.12.27)
国際公開日 平成14年1月31日(2002.1.31)
優先権データ
  • 特願2000-224939 (2000.7.26) JP
発明者
  • 梅澤 喜夫
  • 小澤 岳昌
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブ及びそれを利用した蛋白質-蛋白質相互作用の解析方法 実績あり
発明の概要 あらゆる蛋白質について、高い精度で簡便に蛋白質-蛋白質相互作用を解析できる蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブと、それを用いた蛋白質-蛋白質相互作用の解析を可能とするために、二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、蛋白質-蛋白質相互作用によりプロテインスプライシングを生じさせ、物理化学的または生化学的に検出可能な蛋白質を再生させる蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブを提供する。
従来技術、競合技術の概要


生細胞の構築や機能においては、蛋白質-蛋白質相互作用が重要な役割を果たしていることが知られている。



また、遺伝子の転写機構や細胞内情報伝達などに代表される分子生物学や生物化学の様々な課題の多くは、蛋白質-蛋白質相互作用が関連するものである。



分子生物学や生物化学の分野におけるこれらの研究課題の一部は、これまでに、蛋白質ライブラリー中の「獲物」蛋白質と「おとり」蛋白質との相互作用によってスクリーニングされるtwo-hybrid法(Chien,C.T.,Bartel,P.L.,Sternglanz,R.,Fields,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1991,88,9578-9582;Fields,S.,Song,O.,Nature 1989,340,245-246)などの発展によって解明されてきた。このtwo-hybrid法は、蛋白質-蛋白質相互作用の候補分子の同定を簡便にし、更に新たな蛋白質-蛋白質相互作用マップを作成する有効な手段として提唱されたものである(Flores,A.,Briand,J.F.,Gadal,O.,Andrau,J.C.,Rubbi,L.,Mullem,V.,Boschiero,C.,Goussot,M.,Marck,C.,Carles,C.,Thuriaus,P.,Sentenac,A.,Werner,M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999,96,7815-7820;Ito,T.,Tashiro,K.,Muta,S.,Ozawa,R.,Chiba,T.,Nishizawa,M.,Yamamoto,K.,Kuhara,S.,Sakaki,Y.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999,97,1143-1147;Walhout,A.J.M.,Sordella,R.,Lu,X.,Hartley,J.L.,Temple,G.F.,Brasch,M.A.,Thierry-Mieg,N.,Vidal,M.,Science2000,287,116-122)。しかし、このtwo-hybrid法では、細胞核中、レポーター遺伝子の付近で起こる解析可能な蛋白質相互作用に限って適用できるものであり、一般性に欠けるという問題があった。



また、two-hybrid法は、信頼性においても問題があり、分析の度にモデル細胞あるいは動物を用いて、機能が既知となっている蛋白質による確認試験を行う必要があった(Walhout,A.J.M.et al.,Science 1999,287,116-122)。



そこで、新たな蛋白質-蛋白質相互作用の解析方法として、蛋白質との反応によりN-およびC-末端のユビキチンが再構成され、転写因子の開裂により細胞核付近にあるレポーターが活性化されるスプリットユビキチン蛋白センサー(USPS)法(Dunnwald,M.,Varshavsky,A.,Johnsson,N., Mol.Biol.Cell 1999,10,329-344;Johnsson,N.,Varshavsky,A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998,95,5187-5192;Stagljar,I.,Korostensky,C.,Johnsson,N.,Heesen,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998,95,5187-5192)や、蛋白質間の相互作用により、触媒ドメインと膜局在化ドメインが近づき、グアニン交換因子(GEF)またはRasが再構成され、これがさらに温度敏感変異酵母GEFを有する酵母を補完するというSOS-リクルートシステムが提案された(Aonheim,A.,Nucleic Acids Res.1997,25,3373-3374;Aronheim,A.,Zandi,E.,Hennemann,H.,Elledge,S.J.,Karin,M.,Mol.Cell.Biol.1997,17,3094-3102;Broder,Y.C.,Katz,S.,Aronheim,A.,Curr.Biol.1998,8,1121-1124)。



さらに、より一般性の高いアプローチとして、スプリット酵素法が報告された(Rossi,F.,Charlton,C.A.and Blau,H.M,,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997,94,8405-8410;Remy,I.,Michnick,S.W.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999,96,5394-5399;Pelletier,J.N.,Arndt,K.M.,Pluckthun,A.,Michnick,S.W.,Nature Biotech.1999,17,683-690)。この方法では、分割された酵素が蛋白質-蛋白質相互作用により再構築され、酵素活性が復旧される。このとき再構築された酵素の活性は、菌または細胞の表現型、あるいは蛍光性酵素基質によって測定できる。



これらの様々な方法は、比較的精度が高く、いずれも細胞内蛋白質や膜蛋白質の相互作用を検定する目的には適するが、適切に設計された細胞にのみ適用できる、十分な精度や感度が得られない等の問題があった。また、これらの方法は、いずれも、解析を行うために種々の基質を用いる必要があり、手間がかかるという問題もあった。



したがって、これまで、あらゆる蛋白質について、精度高く、かつ簡便に蛋白質-蛋白質相互作用を解析できる汎用性のある方法やプローブは全く知られていなかったのが実情である。



そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、あらゆる蛋白質について、高い精度で簡便に蛋白質-蛋白質相互作用を解析できる蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブと、それを用いた蛋白質-蛋白質相互作用の解析方法を提供することを課題としている。

産業上の利用分野


この出願の発明は、蛋白質-蛋白質相互作用を解析するためのプローブと、それを用いた蛋白質-蛋白質相互作用の解析方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、あらゆる生細胞中の蛋白質-蛋白質間の相互作用を精度高く、簡便に解析できる蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブと、それを用いた蛋白質-蛋白質相互作用の解析方法に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、inteinのN-末端側のポリぺプチドと蛍光蛋白のN-末端側のポリぺプチドを含むプローブaと、inteinのC-末端側のポリぺプチドと蛍光蛋白のC-末端側のポリぺプチドを含むプローブbの二つのプローブからなり、蛋白質-蛋白質相互作用によりプロテインスプライシングを生じさせ、物理化学的または生化学的に検出可能な蛍光蛋白を再生させることを特徴とする蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブ。

【請求項2】
蛍光蛋白が、緑色蛍光蛋白である請求項1の蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブ。

【請求項3】
二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、inteinのN-末端側のポリぺプチドと発光触媒酵素のN-末端側のポリぺプチドを含むプローブaと、inteinのC-末端側のポリぺプチドと発光触媒酵素のC-末端側のポリぺプチドを含むプローブbの二つのプローブからなり、蛋白質-蛋白質相互作用によりプロテインスプライシングを生じさせ、物理化学的または生化学的に検出可能な発光触媒酵素を再生させることを特徴とする蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブ。

【請求項4】
発光触媒酵素が、ルシフェラーゼである請求項3の蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブ。

【請求項5】
inteinが酵母VMA由来のエンドヌクレアーゼである請求項1ないし4のいずれかの蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブ。

【請求項6】
inteinが藍藻由来のDnaEである請求項1ないし4のいずれかの蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブ

【請求項7】
請求項1ないし6記載のいずれかのプローブaを連結した蛋白質と請求項1ないし6記載のいずれかのプローブbを連結した蛋白質を共存させ、標識蛋白のシグナルを検出することを特徴とする蛋白質-蛋白質相互作用の解析方法。

【請求項8】
請求項1ないし6記載のいずれかの蛋白質-蛋白質相互作用解析用プローブを発現するポリヌクレオチドを真核細胞内に導入することによりプローブaを連結した蛋白質とプローブbを連結した蛋白質を共存させる請求項7の蛋白質-蛋白質相互作用の解析方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2002514409thum.jpg
出願権利状態 登録
参考情報 (研究プロジェクト等) CREST 内分泌かく乱物質 領域
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