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骨髄由来の不死化樹状細胞株 コモンズ 実績あり

国内特許コード P110003236
整理番号 P029P06
掲載日 2011年6月17日
出願番号 特願2003-371244
公開番号 特開2004-166697
登録番号 特許第4219789号
出願日 平成15年10月30日(2003.10.30)
公開日 平成16年6月17日(2004.6.17)
登録日 平成20年11月21日(2008.11.21)
優先権データ
  • 特願2002-316871 (2002.10.30) JP
発明者
  • 高井 俊行
  • 帯刀 益夫
  • 伊藤 由美
  • 伊藤 梢
  • 海老原 伸
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 骨髄由来の不死化樹状細胞株 コモンズ 実績あり
発明の概要 【課題】 樹状細胞が本来有する機能・特性を保持する不死化樹状細胞株やその樹立方法、かかる不死化樹状細胞株を用いた有用物質のスクリーニング方法及びかかる不死化樹状細胞株を主成分とする細胞ワクチンを提供すること。
【解決手段】 SV40の温度感受性突然変異株tsA58のラージT抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、リンパ球及びIa陽性細胞を除去し、得られた細胞をGM-CSFの存在下培養することにより樹状細胞を誘導することにより、継代培養を10回以上繰り返し、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及びCTL活性の誘導能を有する不死化樹状細胞株を樹立する。
従来技術、競合技術の概要


従来、医薬品の安全性や有効性に関する試験研究には主として動物が用いられていたが、動物愛護の観点から動物を使用する代わりに、培養細胞等を用いてインビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する技術の実用化レベルでの研究が行われている。例えば、生体組織から採取した初代培養細胞や無限増殖する不死化細胞(樹立細胞)系を用いる方法で予め試験した後に動物試験が行われている。しかし、初代細胞は初期段階ではよく増殖するが、継代培養とともに次第に増殖が停止し、やがては死滅する(この現象を細胞老化という)。さらに、初代細胞は、その特性が生体組織から採取する度に異なるという危惧に加え、継代とともに変化することが指摘されている。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合には、試験に供するに足る初代細胞を得ることは非常に困難であるとされている。



一方、初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得した不死化細胞では、安定して均一の特性を有することになるが、このような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失する。そのため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいとされていた。そこで、初代細胞にras遺伝子やc-myc遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウイルスのE1A遺伝子、SV40ウイルスのラージT抗原遺伝子、ヒトパピローマウイルスのHPV16遺伝子等を導入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖能を継続的に保持し、さらに継代することによってその細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試みがなされている。ところが、このような不死化細胞においても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を調製し、これらの癌遺伝子やラージT抗原遺伝子を導入する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困難であった。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは極めて困難であった。



これに対し、近年確立された動物個体への遺伝子導入技術を用いて、個々の細胞に癌遺伝子やラージT抗原遺伝子を導入するかわりに、これらの遺伝子を安定的に染色体に組み込んだ遺伝子導入動物を作出し、個体の発生時点において既に癌遺伝子やラージT抗原遺伝子を細胞の中に保有する動物の臓器から初代細胞を調製して、これを継代することによって不死化細胞を樹立する方法が報告されている。特にts SV40 LT Tgマウスの臓器から得られる不死化細胞は、その増殖や分化形質の発現を温度を変えることによって操作することができるため、非常に有効であるとされている(例えば、非特許文献1~8参照。)。



他方、樹状細胞(DC)は造血幹細胞由来の樹枝状形態をとる細胞集団で、生体内に広く分布している。未成熟樹状細胞は、それぞれの組織に侵入したウイルスや細菌をはじめとする異物を認識して取り込み、リンパ系器官T細胞領域への移動の過程でペプチドを消化分解によって生成し、MHC分子に結合させて細胞表面に提示することにより、抗原特異的なT細胞を活性化して免疫応答を誘導する抗原提示細胞としての役割を担っている(例えば、非特許文献9、10参照。)。このように、DCはT細胞依存性の初期免疫応答を惹起できるというT細胞応答の始動にとって非常に重要な役割を果たしている(例えば、非特許文献11、12参照。)。骨髄で生まれたDCは未熟な状態で、生体内の様々な組織に飲食作用をもって分布する。その未熟DCは抗原を取り込み成熟し、2次リンパ性器官へと移動する。そしてそのT細胞領域に蓄積して、体内を循環しているT細胞のうち抗原特異的なものを選択的に活性化して免疫応答を駆動する。しかし、DCのインビボにおけるこれらの詳しいメカニズムは未だ分かっておらず、インビトロにて解析する必要がある。マウスのインビトロのシステムにおいて顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を用いることにより、機能的なDCの誘導が初期培養で可能であるが、その寿命は長くても2ヶ月である(例えば、非特許文献13参照。)。近年、マウスの2次リンパ性器官である脾臓から、DCがGM-CSF依存的に長期培養(12ヶ月以上)できることが報告されたが(D1細胞:例えば、非特許文献14参照。)、未熟で抗原を取り込んでいない、骨髄などの1次リンパ組織からはDC細胞株が樹立されていない。
【非特許文献1】
Transgenic Research 4, 215-225, 1995
【非特許文献2】
Genes to Cells, 2, 235-244, 1997
【非特許文献3】
Exp. Cell Res., 197, 50-56, 1991
【非特許文献4】
Exp. Cell Res., 209, 382-387, 1993
【非特許文献5】
Exp. Cell Res., 218, 424-429, 1995
【非特許文献6】
Blood, 86, 2590-2597, 1995
【非特許文献7】
J. Cell. Physiol., 164, 55-64, 1995
【非特許文献8】
Exp. Hematol., 27, 1087-1096, 1999
【非特許文献9】
Ann. Rev. Immunol. 9, 271-296, 1991
【非特許文献10】
J. Exp. Med., 185, 2133-2141, 1997
【非特許文献11】
Nature, 392, 245-252, 1998
【非特許文献12】
Annu. Rev. Immunol., 18, 767-811, 2000
【非特許文献13】
J. Exp. Med., 175, 1157-1167, 1992
【非特許文献14】
J. Exp. Med., 185, 317-328, 1997

産業上の利用分野


本発明は、骨髄に由来する不死化樹状細胞株に関し、詳しくはSV40の温度感受性突然変異株tsA58のラージT抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウス(ts SV40 LT Tgマウス)の骨髄に由来する樹状細胞(Dendritic cell;DC)を継代培養することにより樹立することができる不死化樹状細胞株及びその製法や、その利用に関する。本発明の不死化樹状細胞株は、樹状細胞のインビトロにおける解析や樹状細胞を用いたワクチン療法の開発並びに免疫応答の修飾、増強の研究に応用できる。

特許請求の範囲 【請求項1】
SV40の温度感受性突然変異株tsA58のラージT抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの骨髄細胞を溶血処理した後、リンパ球及びIa陽性細胞を除去し、得られた細胞をGM-CSFの存在下培養することにより樹状細胞を誘導し、継代培養を10回以上繰り返して樹立される細胞であって、細胞表面にミエロイド分子及びロイコサイト分子を発現し、抗原の取込み能、抗原の提示能、及びCTL活性の誘導能を有し、33℃で増殖することができるが、37℃では増殖が抑制され、LPS刺激に応答能を有することを特徴とする不死化樹状細胞株TDC(FERM BP-08527)。

【請求項2】
被検物質の存在下、請求項記載の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞株における成熟マーカータンパク質の発現の程度を測定・評価することを特徴とする樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法。

【請求項3】
マーカータンパク質が、ミエロイド分子、ロイコサイト分子、I-Ab、CD86及び/又はCD40であることを特徴とする請求項記載の樹状細胞における成熟促進又は抑制物質のスクリーニング方法。

【請求項4】
被検物質の存在下、請求項記載の不死化樹状細胞株を培養し、該細胞の増殖の程度を測定・評価することを特徴とする樹状細胞における細胞増殖促進又は抑制物質のスクリーニング方法。

【請求項5】
被検物質の存在下、請求項記載の不死化樹状細胞株をLPS刺激し、該細胞のIL-12産生量を測定、評価することを特徴とする樹状細胞の活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法。

【請求項6】
請求項記載の不死化樹状細胞株を主成分とすることを特徴とする細胞ワクチン。

【請求項7】
不死化樹状細胞株が、抗原又は抗原-IgG免疫複合体を取り込ませた不死化樹状細胞株であることを特徴とする請求項記載の細胞ワクチン。

【請求項8】
抗原が腫瘍抗原であることを特徴とする請求項記載の細胞ワクチン。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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