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耐熱性多頻度DNA切断酵素の細胞内活性化によるゲノム再編成の誘発方法

国内特許コード P110003405
整理番号 RJ007P96
掲載日 2011年6月21日
出願番号 特願2004-338029
公開番号 特開2006-141322
登録番号 特許第4158920号
出願日 平成16年11月22日(2004.11.22)
公開日 平成18年6月8日(2006.6.8)
登録日 平成20年7月25日(2008.7.25)
発明者
  • 太田 邦史
  • 瀬尾 秀宗
  • 廣田 耕志
  • 柴田 武彦
出願人
  • 国立研究開発法人理化学研究所
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 耐熱性多頻度DNA切断酵素の細胞内活性化によるゲノム再編成の誘発方法
発明の概要 【課題】本発明は、ゲノムDNAの遺伝的組換え頻度を上昇させる方法およびゲノム再編成を誘発する方法に関する。
【解決手段】ゲノム中の任意の部位において遺伝的組換えが起きている細胞の遺伝的組換え頻度を上昇させる方法であって、該細胞中で制限酵素を発現させ、該制限酵素の一過的活性化を誘導し、該細胞の任意のゲノムDNA中に2以上の二本鎖切断を導入することにより、遺伝的組換え頻度を上昇させる方法および前記方法を用いたゲノム再編成の誘発方法、並びに前記2つの方法を用いて各々作製される細胞。
【選択図】
なし
従来技術、競合技術の概要


従来技術として知られているものに、HOエンドヌクレアーゼ(例えば、特許文献1を参照。)、I-SceI(例えば、特許文献2、非特許文献1、非特許文献2を参照。)、Cre-lox(例えば、非特許文献3を参照。)などの部位特異的組換え酵素の細胞内導入型がある。これらの酵素はきわめて配列認識が厳密で、異種ゲノム中には全く切断部位を持たない。そのため予めゲノム中にこれらの切断配列を導入しておくことで、その周辺における相同組換えのみ活性化することが出来る。ただし、今回の発明のようにゲノム一般での組換え頻度向上に用いることは原理的に出来ない。一方、DNA切断酵素を用いてゲノム一般箇所の組換えを上昇させる手法については、切断酵素の活性を厳密に制御することができないため、細胞に致死的な影響が生じやすく、これまで有用な系は実現されていない。ただ、類縁の従来手法であるREMI法 (Restriction Enzyme-Mediated Integration)(例えば、特許文献3、非特許文献4、非特許文献5)では、形質転換時に制限酵素とDNAを混合して細胞内に導入し、導入DNAの染色体挿入頻度を上昇させることが可能になっている。しかし、この手法ではごく一部の細胞にしかDNAと制限酵素が取り込めないので、あくまで外来DNAの染色体への挿入を促進する用途に限定され、ゲノムシャッフリングなど大規模なゲノム組成の改変には利用する事が出来ないという本質的な欠点がある。



【特許文献1】
米国特許第6,037,162号明細書
【特許文献2】
米国特許第6,610,545号明細書
【特許文献3】
米国特許第5,792,633号明細書
【非特許文献1】
Jacquier等,1985.Cell,41:383-394
【非特許文献2】
Rouet等,1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:6064-6068
【非特許文献3】
DiSanto等,1995.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:377-381
【非特許文献4】
SchiestlおよびPetes,1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7585-7589
【非特許文献5】
Schiestl等,1994.Mol.Cell.Biol.14:4493-4500

産業上の利用分野


本発明は、一般にゲノムDNAの遺伝的組換え頻度を上昇させる技術に係り、より詳細には、ゲノムDNAの遺伝的組換え頻度を上昇させることによりゲノム再編成を誘発する方法および係る方法によってゲノム再編成が行われた細胞に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
ゲノム中の任意の部位において遺伝的組換えが起きている真菌細胞から遺伝的組換え頻度を上昇させた細胞を製造する方法であって、該細胞中でTaqIを発現させ、TaqIの一過的活性化を誘導し、該細胞のゲノムDNA中の任意の部位に2以上の二本鎖切断を導入することにより、遺伝的組換え頻度を上昇させた細胞を製造する方法。

【請求項2】
前記遺伝的組換えが相同組換えである請求項1に記載の方法。

【請求項3】
前記遺伝的組換えが非相同組換えである請求項1に記載の方法。

【請求項4】
前記真菌細胞が酵母であることを特徴とする請求項1に記載の方法

【請求項5】
前記TaqIを誘導的に発現させることを特徴とする請求項1ないし4のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
前記細胞の温度を前記TaqIが活性化される温度まで上昇させ、上昇させた温度で該細胞をインキュベートすることにより、前記TaqIの一過的活性化を達成することを特徴とする請求項1ないし5のいずれかに記載の方法。

【請求項7】
前記TaqIが活性化される温度が40℃~60℃であることを特徴とする請求項6に記載の方法。

【請求項8】
前記インキュベートを3~30分間行うことを特徴とする請求項6又は7に記載の方法。

【請求項9】
請求項1ないし8のいずれかに記載の方法を用いて、前記細胞中のゲノム再編成を誘発した細胞を製造する方法
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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