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リンカー化合物およびリガンド並びにオリゴ糖鎖の固定化方法および蛋白質分析用の支持体 実績あり

国内特許コード P110003505
整理番号 Y01-P272-1
掲載日 2011年6月22日
出願番号 特願2005-234913
公開番号 特開2006-047318
登録番号 特許第4364853号
出願日 平成17年8月12日(2005.8.12)
公開日 平成18年2月16日(2006.2.16)
登録日 平成21年8月28日(2009.8.28)
発明者
  • 隅田 泰生
  • 楠本 正一
  • 荒野 明男
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 リンカー化合物およびリガンド並びにオリゴ糖鎖の固定化方法および蛋白質分析用の支持体 実績あり
発明の概要 【課題】 オリゴ糖を用いて一段階で蛋白質分析用の支持体に簡便に固定化することができ、また分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な影響が低減され、蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる支持体を得ることができるリンカー化合物を提供する。
【解決手段】 リンカー化合物は、
一般式(101)



で表される構造を有する。上記リンカー化合物は、ビオチン-ストレプトアビジン結合によりリガンド中のオリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体表面に一段階で固定できる。
【選択図】 なし
従来技術、競合技術の概要


下記一般式(6)



【化1】




で表される硫酸化多糖ヘパリンは、構造や分子量が非常に不均一なものであり、多くの生物活性を有することが知られている。そのなかでも、抗血液凝固活性は有名であり、医薬として広く用いられている。



しかしながら、不均一な硫酸化多糖ヘパリンは、血小板やフォンビルブラント因子(vWF)とも結合する。このため、従来、硫酸化多糖ヘパリンを医薬として用いた場合における血液中の血小板との結合に起因する副作用が指摘されている。



これらの結合相互作用には、硫酸化多糖ヘパリン中の、下記一般式(7)



【化2】




で表される特定の部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)と、それに基づくクラスタリング効果が重要である。



本願発明者等は、以前に、この特定の部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)が血小板細胞や血液凝固に関わるフォンビルブラント因子(vWF)という蛋白質との結合に大きく関与することを見出した。



しかしながら、これらの生化学的結合実験のためには特殊な設備や多量のオリゴ糖が必要になるという問題がある。生物活性測定法としては、従来、放射標識法(RI法)とSPR法とが知られているが、RI法は、特殊な実験設備や多量のオリゴ糖を必要とする。



そこで、本願発明者等は、蛋白質分析用の支持体として非放射標識法である表面プラズモン共鳴(SPR)のセンサチップを使用し、図11に示すように、該センサチップの表面上に、疎水性相互作用を介して上記した部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)を固定化し、SPRを用いて硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)と硫酸化多糖ヘパリン結合性の蛋白質との結合挙動を解析した。SPR法は、少量のオリゴ糖で測定が可能であり、分子間の相互作用をリアルタイムで観測することが可能である。なお、図11中、NS6Sは上記した部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)のうちGlcNS6Sを示し、I2SはIdoA2Sを示し、Gはグルコース単位を示す。



具体的には、センサチップとしての疎水性チップ上に上記部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)を固定化し、この疎水性チップ上に、硫酸化多糖ヘパリン結合性ドメインを有する合成vWFペプチド(vWF中のヘパリン結合サイト;YIGLKDRKRPSELRRIASQVKYA-NH)をアナライトとして添加した。



この結果、図12の線aに示すように、vWFペプチドの濃度変化に応じて結合量の変化、すなわち、ΔRU(オリゴ糖の結合量)/ΔRU(vWFペプチドの結合量)が観測された。



この線aのカーブから求められる解離定数KD は、以前にSobel等が生化学的手法を用いて測定した値(K=370±100nM、非特許文献1参照)にオーダーとして近いものであった。



一方、従来、SPR測定装置等に用いるセンサチップの表面にオリゴ糖鎖を結合(固定化)する試みとしては、例えば、チップ表面に長鎖アルキル鎖の短分子膜を作り、疎水性相互作用を利用してオリゴ糖鎖をチップに固定化する試みがなされている(非特許文献2参照)。
【非特許文献1】
M.Sobel et al., J. Biol. Chem., vol.267, p8857, (1992)
【非特許文献2】
G.M.Kuziemko et al., Biochemistry, Vol. 35, p6375, (1996)

産業上の利用分野


本発明は、オリゴ糖鎖を、表面プラズモン共鳴等のセンサチップやアフィニティークロマトグラフィーの担体等の蛋白質分析用の支持体に一段階で導入し、固定することが可能なリンカー化合物および該リンカー化合物を用いたリガンド並びに該リガンドを用いたオリゴ糖鎖の固定化方法および該リガンドを表面に固定化させてなる蛋白質分析用の支持体に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
一般式(101)
【化1】


で表されるリンカー化合物。

【請求項2】
一般式(102)
【化2】


で表されるリガンド。

【請求項3】
オリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体の表面に固定化するオリゴ糖鎖の固定化方法であって、
請求項2記載のリガンドを含む溶液を、表面にストレプトアビジンを固定化した支持体とを接触させることを特徴とするオリゴ糖鎖の固定化方法。

【請求項4】
請求項2記載のリガンドを、ビオチン-ストレプトアビジン結合を介して表面に固定化させてなることを特徴とする蛋白質分析用の支持体。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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