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擬微小重力環境下での骨髄細胞を用いた3次元軟骨組織構築方法

国内特許コード P110003635
整理番号 A122P303
掲載日 2011年6月27日
出願番号 特願2005-516155
登録番号 特許第4499041号
出願日 平成16年12月2日(2004.12.2)
登録日 平成22年4月23日(2010.4.23)
国際出願番号 JP2004018339
国際公開番号 WO2005056072
国際出願日 平成16年12月2日(2004.12.2)
国際公開日 平成17年6月23日(2005.6.23)
優先権データ
  • 特願2003-413758 (2003.12.11) JP
  • 特願2004-096686 (2004.3.29) JP
発明者
  • 木田 尚子
  • 植村 寿公
  • 田中 順三
  • 大藪 淑美
出願人
  • 独立行政法人科学技術振興機構
  • 独立行政法人産業技術総合研究所
  • 独立行政法人物質・材料研究機構
発明の名称 擬微小重力環境下での骨髄細胞を用いた3次元軟骨組織構築方法
発明の概要

本発明は、RWV等のバイオリアクターによって実現される擬微小重力環境下において骨髄細胞を培養することにより、3次元に軟骨組織を構築する方法に関する。

従来技術、競合技術の概要

近年、整形外科領域では軟骨欠損部位の修復に、患者から採取した自家軟骨より単離した軟骨細胞を、一旦生体外で培養・増殖させてから欠損部位に再移植する技術が活発に研究され、一部では実用に至っている。しかし、軟骨細胞はシャーレのような容器で2次元培養すると脱分化して繊維芽細胞になってしまうため、軟骨基質産生能等の軟骨細胞本来の機能を失ない、移植しても十分な治療効果が望めないという問題がある。
この問題を解決する手段は3次元培養であるが、常に重力の影響を受ける地上では、水より比重が若干大きい細胞は培養液中に沈降してしまうため、結局2次元培養しか望めないことになる。そのため、3次元培養を行うためには、通常適当な足場材料を用いて培養を行うことが必要となる。
一方、攪拌培養法による3次元組織構築へのアプローチもある。しかし、従来の攪拌培養法では、細胞に与えられる機械的刺激や損傷が強く、大きな組織を得ることは困難か、あるいは得られたとしても内部で壊死を起こしていることが多い。
これに対し、重量を最適化するために設計された一連のバイオリアクターが存在する。その1つであるRWV(Rotating Wall Vessel)バイオリアクターは、NASAが開発したガス交換機能を備えた回転式バイオリアクターである(例えば、米国特許5,002,890号参照)。RWVバイオリアクターは、横向き円筒形バイオリアクター内に培養液を満たし、細胞を播種した後、その円筒の水平軸方向に沿って回転しながら培養を行う。回転による応力のため、バイオリアクター内は地上の重力に比較して100分の1程度の微小重力環境となる。したがって、細胞は培養液中に均一に懸濁された状態で増殖することが可能となり、凝集して、大きな組織塊を形成できる。
RWVバイオリアクターの他にも、RCCS(Rotary Cell Culture SystemTM:Synthecon Incorporated)や3D-clinostatなど、数種の擬微小重力環境を実現する装置が開発され(例えば、特開平8-173143号、特開平9-37767号、特開2002-45173号参照)、実用に供されている。さらに、こうした擬微小重力環境下での細胞培養の結果も、既に特許や論文として発表されている(例えば、米国特許5,153,133号、米国特許5,155,034号、米国特許6,117,674号、米国特許6,416,774号参照)。擬微小重力環境下での軟骨組織構築については、PLGAなどの足場材料と軟骨細胞とのコンポジットを作製することにより、軟骨組織を構築する方法が知られている。
一方、軟骨組織再生における自家軟骨の採取は、正常組織に与える侵襲が大きく、その採取量にも限界があるといった問題も有する。したがって、軟骨以外の細胞を利用した、生体外での効率的な軟骨組織再生技術が望まれている。

産業上の利用分野

本発明は、擬微小重力環境下における骨髄細胞を用いた3次元軟骨組織構築方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】 1軸回転式バイオリアクターを用いて擬微小重力環境下で骨髄細胞を3次元的に培養することによりin vitroで軟骨組織を形成させることを含む、軟骨組織を構築する方法。
【請求項2】 前記擬微小重力環境が、時間平均して地球の重力の1/10~1/100に相当する重力を物体に与える環境である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】 前記擬微小重力環境が、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより擬微小重力環境を地上で実現するバイオリアクターを用いて得られるものである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】 前記擬微小重力を地上で実現するバイオリアクターが、RWV (Rotating Wall Vessel)バイオリアクターである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項5】 骨髄細胞の播種密度が106~107/cm3、RWVの回転速度が直径5cmベッセルに対して8.5~25rpmの条件下で培養が行われる、請求項4に記載の方法。
【請求項6】 培養液中にTGF-βおよび/またはデキサメタゾンを添加して培養が行われる、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】 コンフルエントになるまで2次元培養した後、さらにサブカルチャーした骨髄細胞を擬微小重力環境下で培養する、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】 前記骨髄細胞が患者から採取された細胞である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
産業区分
  • 治療衛生
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
出願権利状態 権利存続中
参考情報 (研究プロジェクト等) CREST 分子複合系の構築と機能 領域
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